Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль антибактериальных пептидов в иммунитете насекомых 11
1.1. Представление об иммунитете насекомых .11
1.2. Антибактериальные пептиды насекомых 18
1.2.1. Многообразие антибактериальных пептидов насекомых 18
1.2.2. Особенности экспрессии генов антибактериальных пептидов...25
1.2.3. Механизм действия антибактериальных пептидов 29
1.3. Иммунитет и система антибактериальных пептидов медоносной пчелы 31
1.3.1. Иммунитет медоносной пчелы 31
1.3.2. Антибактериальные пептиды медоносной пчелы 38
Глава 2. Материалы и методы исследований 45
2.1. Характеристика объектов исследования 45
2.2. Описание исследованных регионов 49
2.3. Методы исследования антибактериальных пептидов медоносной пчелы 52
2.3.1. Консервация пчел для перевозки и хранения 52
2.3.2. Выделение ДНК и РНК 53
2.3.3. Амплификация тотальной ДНК 54
2.3.4. Электрофоретическое фракционирование ДНК 55
2.3.5. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами 56
2.3.6. Перенос РНК на мембранные фильтры 57
2.3.7. Радиоактивное мечение препаратов ДНК 58
2.3.8. Молекулярная гибридизация 59
2.3.9. Элюция ДНК из агарозных гелей 59
2.3.10. Клонирование фрагментов генов антибактериальных пептидов медоносной пчелы 60
2.3.11. Подготовка компетентных клеток Е. coli 62
2.3.12. Трансформация компетентных клеток.со/і ішазмидной ДНК 62
2.3.13. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной ДНК 63
2.3.14. Секвенирование ДНК ферментативным методом 64
2.3.15. Электрофоретическое фракционирование ДНК в денатурирующих условиях (секвенирующий гель-электрофорез) 66
2.3.16. Составы использованных стандартных растворов 67
2.4. .Методы идентификации расового происхождения 68
2.4.1. Морфометрический анализ 68
2.4.2. Анализ полиморфизма мтДНК (локус СОІ-СОП) 69
2.5. Компьютерный анализ и статистическая обработка результатов 70
Глава 3. Амплификация и поиск полиморфизма участков генов антибактериальных пептидов абецина, гименоптецина и дефензина медоносной пчелы Apis mellifera L 72
3.1. Анализ известных нуклеотидных последовательностей и подбор праймеров 72
3.2 Определение нуклеотидной последовательности и идентификация полученных ПЦР-амшшфицированных фрагментов 78
3.3 Полиморфизм генов антибактериальных пептидов медоносной пчелы...84
Глава 4. Экспрессия генов антибактериальных пептидов (абецина, гименоптецина, дефензина) у медоносной пчелы Apis mellifera L 88
4.1 Экспрессия генов антибактериальных пептидов Apis mellifera (абецина, гименоптецина, дефензина) в ходе инфекционного процесса и при действии адаптогена (эксперимент I) 90
4.2. Межрасовые различия характера экспрессии генов антибактериальных пептидов абецина, гименоптецина, дефензина у пчел Apis mellifera mellifera и Apis mellifera cancasica (эксперимент II) 97
Глава 5. Полиморфизм гена дефензина в башкирской популяции медоносной пчелы Apis mellifera 109
5.1. Гетерогенность субпопуляций медоносной пчелы по полиморфному локусу гена дефензина 111
5.2. Интегральная гетерогенность субпопуляций РБ 119
Выводы 134
Список литературы 136
- Антибактериальные пептиды насекомых
- Методы исследования антибактериальных пептидов медоносной пчелы
- Определение нуклеотидной последовательности и идентификация полученных ПЦР-амшшфицированных фрагментов
- Межрасовые различия характера экспрессии генов антибактериальных пептидов абецина, гименоптецина, дефензина у пчел Apis mellifera mellifera и Apis mellifera cancasica (эксперимент II)
Введение к работе
В последние годы проявляется значительный интерес к изучению антибактериальных пептидов (АБП) насекомых и беспозвоночных в целом. К настоящему времени из насекомых выделено более ста веществ пептидной природы, обладающих бактериостатическими, бактерицидными и фунгицидными свойствами. Повышенный интерес к ним, прежде всего, обусловлен их большим прикладным значением. По мнению многих специалистов, АБП являются перспективным источником нового класса антибиотиков, потенциальный спектр применения которых не ограничивается только рамками медицины (Hancock, Lehrer, 1998). Использование АБП в области сельского хозяйства привело к созданию новых трансгенных сортов растений, устойчивых к различного рода заболеваниям.
Следует отметить, что многие исследования в данной области пока носят поисковый характер. Они направлены на расширение списка изучаемых видов и выявление новых пептидных антибиотиков. Вместе с тем, АБП являются наиболее древними и биологически значимыми компонентами иммунной системы насекомых (Черныш и др., 1999). Создание ясного представления о системе антибактериальных пептидов и механизмах её функционирования у медоносной пчелы является важным этапом решения проблемы эволюции иммунитета у насекомых.
В настоящее время у медоносной пчелы обнаружены следующие антибактериальные пептиды: апидацины (несколько изоформ), абецин, дефензин и гименоптецин (Casteels-Josson et al. 1993; Casteels-Josson et al., 1994). Наличие этих пептидов в организме на всех стадиях развития, в мёде, маточном молочке и
7 прополисе является необходимой составляющей групповой и индивидуальной системы иммунитета (Зюман, 1992). Вместе с тем генетические аспекты иммунитета данного вида изучены крайне слабо. Поэтому исследование структурной организации и экспрессии генов АБП медоносной пчелы заслуживают особого внимания.
Кроме перспективности исследований АБП медоносной пчелы для медицины, изучение цитотоксических пептидов является отправной точкой при создании нового поколения иммуномодуляторов для пчеловодства, повышающих уровень естественного гуморального иммунитета отдельной особи и пчелосемьи в целом.
Одновременно молекулярно-генетический анализ комплекса антибактериальных пептидов является перспективным подходом к изучению структуры популяций и адаптивных возможностей медоносной пчелы. Исследование полиморфизма генов АБП может стать основой для создания ДНК-маркёров, непосредственно связанных с иммунитетом данного вида, открыть новые возможности для решения проблем сохранения внутривидового биоразнообразия медоносной пчелы.
Цели и задачи исследований. Цель работы заключалась в выявлении особенностей экспрессии и ёнутривидового полиморфизма генов антибактериальных пептидов медоносной пчелы (Apis mellifera L.). Были поставлены следующие задачи:
Амплификация и исследование полиморфизма генов АБП;
Изучение экспрессии генов АБП;
Популяционно-генетический анализ полиморфизма генов АБП.
8 Научная новизна. Впервые изучена экспрессия генов антибактериальных пептидов абецина, гименоптецина и дефензина медоносной пчелы в ходе инфекционного процесса при заражении битоксибациллином (БТБ), а также при действии адаптогена - хитоолигосахаридов (ХОС). Обнаружены нуклеотидные замены в кодирующей области гена дефензина, которые ведут к замене аминокислот в соответствующем пептиде. Выявлена новая, ранее не известная у медоносной пчелы, форма диаллельного полиморфизма гена дефензина. Впервые проведено популяционно-генетическое исследование медоносной пчелы с использованием обнаруженного полиморфного сайта в качестве объекта ДНК- типирования. Показана генетическая неоднородность зоны гибридизации пчёл тёмной лесной (Apis mellifera mellifera) и южных рас. Найденные различия позволяют использовать полиморфный сайт гена дефензина в качестве удобного популяционно-генетического маркёра.
Практическая ценность работы. Полученные результаты могут быть использованы при осуществлении программ разведения пчёл среднерусской расы.
Оценка иммунной устойчивости делает возможным целенаправленный отбор при выведении устойчивых к заболеваниям линий и пород пчёл. Применение обнаруженного нами полиморфизма гена дефензина в качестве маркёра в комплексе с результатами анализа митохондриального генома и морфометрии, позволяет дифференцировать субпопуляции, находящиеся на разных стадиях гибридизации. На основе полученных в результате анализа данных возможно выделение субпопуляций перспективных с точки зрения сохранения генофонда среднерусской расы медоносной пчелы.
9 Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях: «Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии» (Челябинск, 1999); «Актуальные проблемы биологии» (Сыктывкар, 1999, 2000); «Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии» (Новосибирск, 2000).
Работа выполнялась в 1997-2001 гг. в Институте биохимии и генетики (до
1999 г. Отдел биохимии и цитохимии) Уфимского научного центра РАН в рамках следующих тем: "Генетико-биохимические особенности башкирской популяции среднерусской расы медоносной пчелы" (РАН, № госрегистрации 01.9.60001037, 1996-1998); "Молекулярные механизмы адаптивности южно-уральской популяции Apis mellifera mellifera к современным условиям обитания" (РАН, № госрегистрации 01.99.0008299, 1999-2001); "Физиолого-биохимические особенности холодоустойчивости башкирской популяции среднерусской породы медоносной пчелы" (АН РБ, договор №1, 1996-1998); "Молекулярно-генетическая паспортизация генофонда башкирской популяции медоносной пчелы" (АН РБ, договор №15, 1999-2001); "Разработка комплекса молекулярно-генетических методов для контроля состояния генофонда башкирской пчелы" (АН РБ, договор №17, 1999-2001); "Изучение экспрессии биохимических механизмов защитных реакций как основа оценки адаптивных возможностей организма насекомых" (АН РБ, 1999-2001).
Автор выражает свою признательность руководителю и научному консультанту диссертационной работы - к.б.н., с.н.с. А.Г. Николенко и д.б.н. проф. А.В. Чемерису за организационную работу, поддержку и общую редакцию рукописи. Хотелось бы также поблагодарить проф. Э.К. Хуснутдинову за советы и консультации, значительно облегчившие работу над диссертацией. Искренне благодарю сотрудников лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ИБГ УНЦ РАН О. Филатову, Ю.М. Никонорова, Б.Е. Сабиржанова, Ал.Х. Баймиева и Ан.Х. Баймиева за методическую поддержку при выполнении экспериментальной части работы. Сердечно благодарю за оказанную помощь в сборе материала и критические замечания всех сотрудников лаборатории биохимии адаптивности насекомых ИБГ УНЦ РАН.
Антибактериальные пептиды насекомых
В организме насекомых синтезируется широкий спектр антибактериальных факторов. Из гемолимфы Hyalophora cecropia выделено 15 различных протеинов, обладающих цитотоксическим действием (Boman, Hultmark, 1987). В гемолимфе инфицированной Manduca sexta обнаружено более 25 различных иммунных протеинов, различающихся у гусениц и куколок (Hurlbert et al., 1985). АБП были обнаружены в иммунизированной гемолимфе представителей отряда Diptera (Okada, Natori, 1983; Robertson, Postlethwait, 1986; Keppi et al., 1986; Flyg et al., 1987; Kaaya et al, 1987; Asling et al., 1995), отряда Coleoptera (Spies, et al., 1986; Lee et al., 1995; Akihiro Miyanoshita et al., 1996), отряда Orthoptera (Lambert, Hoffmann, 1985), отряда Hemiptera (de Azambuja et al., 1986; Chernysh, 1996; Fehlbaum et al., 1996) и многих других насекомых. Вопрос классификации цитотоксических факторов до настоящего времени остаётся открытым. Некоторые исследователи выделяют четыре группы антибактериальных пептидов (дефензины, цекропины, пролин- и глицинбогатые пептиды), исключая принадлежность лизоцимподобных антибактериальных факторов к числу цитотоксических пептидов (Черныш, 1998; Hancock, Diamond, 2000). Однако имеет место и более широкая классификация иммунных цитотоксических факторов насекомых, включающая пять групп (Casteels et al., 1993). Основываясь на характеристиках аминокислотной последовательности, предполагаемой вторичной (третичной) структуры, антибактериального спектра и возможного механизма действия, антибактериальные пептиды (АБП) подразделяют на следующие группы: 1) Лизоцимоподобные протеины (14 кДа), обладающие характерной консервативной аминокислотной последовательностью, как у насекомых, так и у позвоночных. 2) Цекропины (саркотоксин I) - основные пептиды (20 - 40 аминокислотных остатков, 3,5-4 кДа) способные нарушать мембранный потенциал, блокируя протонный градиент, в результате чего разрушаются мембраны и происходит потеря жизнеспособности бактерий. 3) Дефензины - катионные полипептиды с длинной цепи 38-43 аминокислоты, включая 6 остатков цистеина, связанных тремя дисульфидными мостиками. Дефензины насекомых отличаются от других семейств цитотоксических пептидов характерной структурой, а также избирательностью для грам положительных бактерий и некоторых мицелиальных грибов (Черныш, 1999). 4) Пролинбогатые пептиды - цитотоксические пептиды с длиной цепи 18-59 аминокислотных остатков и содержанием пролина более 30%. К этой группе относятся апидацины, абецин - антибактериальные пептиды медоносной пчелы. 5) Глицинбогатые пептиды, отличающиеся характерным размером полипептидной цепи (более 70 аминокислотных остатков), высоким содержанием глицина во всей последовательности (колеоптерицин) или в специфичном "G-домене" (диптерицин, аттацин, саркотоксин II) (Casteels et al., 1993). Первым антибактериальным фактором, выделенным из гемолимфы насекомых, является лизоцим (Powning, Davidson, 1976). Лизоцим был обнаружен в гемоцитах саранчи Locusta (Zachary, Hoffmann, 1984), секрете придаточных половых желез самки Ceratitis capitata (Marchini Daniela et al., 1991), в полости тела личинок большой пчелиной огнёвки Galleria mellonella (Jarosz, 1995), в яйцах, личинках и имаго медоносной пчелы Apis mellifera (Зюман, 1991), а также у многих других насекомых.
Методы исследования антибактериальных пептидов медоносной пчелы
Одной из важных методических проблем является корректный сбор биологического материала. При исследованиях на молекулярно-генетическом уровне необходим подход, обеспечивающий сохранение ДНК в нативном состоянии.
Для выбора метода консервации пчел в полевых условиях с последующим выделением ДНК отрабатывались методы выделения ДНК из сухих пчел, хранившихся в течение 1 месяца и 6 месяцев при комнатной температуре, а также из пчел, помещенных живыми в 96%-ный этанол и хранившихся в течение 1 месяца при - 10С, и в течение месяца при комнатной температуре. Было показано, что тотальная ДНК из пчел, помещенных живыми в 96%-ный этанол и хранившихся в течение 1 месяца при - 10С в наибольшей степени пригодна для дальнейших работ.
Для выделения ДНК использовали как живых пчел, так и фиксированных в 96%-ном этиловом спирте (см. выше). Выделение проводили модифицированным методом экстракции смесью гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформ (Chomezynski, Sacchi, 1987). Растертый в 0,5-мл микроцентрифужных пробирках гомогенат лизировали добавлением охлажденного во льду буфера, содержащего 4М гуанидинтиоцианата, 25мМ цитрата натрия, 100 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,5% саркозила. Затем к лизату добавляли 0,1 объема 2М трис-НС1-буфера рН 8,0 и энергично встряхивали с равным объемом водонасыщенного фенола рН 8,0 и 0,2 объемами смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) 15 мин. Смесь выдерживали 15 мин при 0 С и центрифугировали в течение 10 мин при 10000 g (центрифуга MPW-50). Водно-солевую фазу, содержащую ДНК, отбирали и смешивали с равным объемом этанола. Препарат ДНК выдерживали при -20С до формирования видимого осадка и центрифугировали 10 мин при 10000 g (центрифуга MPW-50).
Осадок, содержащий ДЕК, подсушивали, растворяли в лизирующем буфере и повторно осаждали добавлением 2 объемов 96%-ного этанола. Конечный осадок ДНК промывали 70%-ным этанолом, высушивали и растворяли в минимальном объеме бидистиллированной воды.
Для выделения РНК использовали только живых пчёл. Выделение и очистку проводили также методом экстракции смесью гуанидинтиоционат-фенол-хлороформ (Chomezynski, Sacchi, 1987). Растертый в 0,5-мл микроцентрифужных пробирках гомогенат лизировали добавлением охлажденного во льду буфера, содержащего 4М гуанидинтиоцианата, 25мМ цитрата натрия, 100 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,5% саркозила. Затем к лизату добавляли 0,1 объема 2М ацетата натрия рН 4.0 и энергично встряхивали с равным объемом водонасыщенного фенола рН 5,0 и 0,2 объемами смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) 15 мин. Препарат РНК выдерживали при -20С до формирования видимого осадка и центрифугировали 10 мин при 10000 g (центрифуга MPW-50). Верхний водно-солевой слой отбирали и повторяли процедуру депротеинизации. Затем РНК осаждали добавлением 2 объёмов 96%-ного этанола. Конечный осадок РНК промывали 70%-ным этанолом, высушивали и растворяли в минимальном объеме бидистиллированной воды.
Амплификацию ДНК проводили методом ПЦР в термоциклере "Циклотерм" (Россия) в 30 мкл реакционной смеси, содержащей буфер для Taq-полимеразы (10 мМ трис-HCl, рН 8,8; 50 мМ КС1; 2.5 мМ MgCl2 и 0,01% желатина), около 1 мкг суммарной ДНК, 10 пкмоль каждого праймера, 250 мкмоль каждого дНТФ и 2,5 ед.
Taq-полимеразы под слоем вазелинового масла. Реакцию проводили в 25-30 циклов: денатурация - 94С 1 мин, отжиг - 2 мин при соответствующей для каждой пары праймеров температуре, элонгация - 72С, 2 мин. Подбор праймеров осуществлялся на основе известных кДНК последовательностей генов 3-х антибактериальных пептидов: абецина (abaecin), пчелиного дефензина (bee defensin) и гименоптецина (hymenoptaecin) (Casteels-Josson et. al., 1994). Праймеры подбирались при помощи компьютерной программы PrimerSelect из пакета компьютерных программ Lasergene (DNASTAR, США).
Определение нуклеотидной последовательности и идентификация полученных ПЦР-амшшфицированных фрагментов
Для успешной амплификации исследуемых локусов нужна стабильная гибридизация праймеров и последовательностей-мишеней. Если последовательность праймеров отличается от структуры локуса-мишени или условия ПЦР не соответствуют необходимым требованиям, то существует вероятность неспецифической гибридизации и амплификации случайного фрагмента. Следует отметить, что в наших исследованиях стабильность длин продуктов амплификации, а также характер их транскрипционной динамики при воздействии на организм стресс-факторов, более подробно рассмотренный ниже, свидетельствует о соответствии амплифицированных участков фрагментам генов изучаемых цитотоксических пептидов. Вместе с тем, для более точной идентификации полученных ПЦР-амплифицированных фрагментов, а также с целью поиска нуклеотидных и аминокислотных замен было проведено секвенирование амплифицированных ДНК-фрагментов генов гименоптецина и дефензина. Секвенирование ДНК проводили ферментативным методом по Сэнджеру (Sanger et al., 1977). Поскольку в основе метода ферментативного секвенирования лежит построение новой комплиментарной цепи ДНК по уже имеющейся, то большое значение приобретает подготовка молекул ДНК для осуществления этого процесса.
После предварительного электрофоретического фракционирования ПЦР продуктов и элюирования необходимых участков из легкоплавкой агарозы, мы проводили клонирование амплифицированных фрагментов. Клонирование осуществляли с применением вектора pGEMEasy (Promega Corporation, США), а также dT-вектора, приготовленного на основе фагмиды pBluescript II KS (-) (Stratagene, США), расщепленной по сайту EcoRV. В дальнейшем, используя полученные конструкции и фаг М13, мы получали псевдофаговые частицы, содержащие искомый одноцёпочечный фрагмент ДНК. После очистки одноцепочечной ДНК и оценки её качества проводилось секвенирование соответствующих фагментов. Секвенирование амплифицированного участка гена гименоптецина позволило определить нуклеотидную последовательность участка протяженностью 170 пн (рис. 3.5). Сравнительный анализ определённой нами последовательности и нуклеотидной последовательности кДНК (Casteels-Josson et. al., 1994), показал полную гомологию, что говорит о соответствии амплифицированного нами фрагмента участку гена гименоптецина медоносной пчелы. Секвенирование амплифицированного фрагмента гена дефензина позволило определить нуклеотидную последовательность участка протяженностью 199 пн (рис. 3.6). Сравнение с нуклеотидной последовательностью кДНК (Casteels-Josson et. al., 1994), показало значительную гомологию, что указывает на соответствие амплифицированного нами фрагмента участку гена дефензина пчелы. Однако 3 концевой участок (26 пн) секвенированной последовательности не гомологичен кДНК.
Можно предположить, что этот участок является некодирующим интронным фрагментом, который отсутствует в соответствующей кДНК последовательности. Также следует отметить наличие нуклеотидных замен в кодирующей области, ведущих к замене аминокислот (рис.3.6, 3.7). Вместо тимина в кодоне СТС обнаружен аденин (119 Т- А), что приводит к соответствующей аминокислотной замене (65 Leu— His). Также обнаружены нуклеотидные замены, ведущие к изменению последовательности аминокислот дефензина. Вместо последовательно расположенных триплетов GTT GGA в позиции 154-159 кДНК, в секвенированной нами последовательности обнаружен обратный порядок расположения кодонов - GGA GTT. Это приводит к соответственному изменению порядка расположения аминокислот в пептиде, вместо последовательности валин глицин в позициях 77 и 78 аминокислотной последовательности дефензина, присутствует последовательность глицин-валин. Данные аминокислотные замены, по всей видимости, ведут к изменению физико-химических и, возможно, функциональных свойств антибактериального пептида.
Межрасовые различия характера экспрессии генов антибактериальных пептидов абецина, гименоптецина, дефензина у пчел Apis mellifera mellifera и Apis mellifera cancasica (эксперимент II)
Во второй части экспериментальной работы мы исследовали межрасовые различия в экспрессии генов АБП у медоносной пчелы Apis mellifera. Эксперимент проводился на летних одновозрастных тёмных лесных (среднеруских, Apis mellifera mellifera) и серых горных кавказских пчёлах {Apis mellifera caucasica).
Цель эксперимента заключалась в выявлении межрасовых особенностей экспрессии генов цитотоксических пептидов на начальном этапе инфекционного процесса. Исходя из цели, была разработана соответствующая модель эксперимента (рис.4.4).
Как в предыдущем эксперименте, пчелы были обработаны 0,5% БТБ. Далее через 15 мин, 30 мин, 1 ч, 4 ч, 24 ч, 36 ч и 48 ч выделялась РНК. Для более точного определения количества иммобилизованной РНК использовали фильтр реперных повторов. В качестве ДНК - зонда использовали рекомбинантный клон, содержащий фрагмент гена 18S рибосомной РНК пшеницы, которая проявляет достаточно высокую степень гомологии с аналогичной областью рДНК медоносной пчелы.
Полученные данные по транскрипционной активности генов антибактериальных пептидов у пчел среднерусской и кавказкой рас в неинфицированном состоянии и в ходе инфекционного процесса представлены в табл. 4.2 и на рис. 4.5-4.7.
Также как в предыдущем эксперименте нами была зафиксирована экспрессия генов всех трех антибактериальных пептидов в контрольных вариантах (рис.4.5). Обнаружено, что транскрипция гена гименоптецина в нормальном состоянии у среднерусских пчёл выше, чем у пчел кавказкой расы. Возможно, это является причиной незначительного изменения уровня экспрессии этого пептида у А. т. mellifera при инфицировании и, напротив, быстрой активизации транскрипции гименоптецина у А. т. caucasica (табл.4.2, рис.4.6).
Наши исследования экспрессии генов антибактериальных пептидов медоносной пчелы показали, что при инфицировании per os битоксибациллином происходит изменение транскрипционной активности данных генов примерно в 1,5-3,4 раза относительно контроля. Изучение антибактериальных пептидов медоносной пчелы методом диффузии экстрактов фракций пептидов в агаре, свидетельствует об увеличении антибактериальной активности (диаметра зон задержки роста бактерий) гемолимфы и экстрактов имаго пчелы после иммунизации в 1,5-2 раза (Зюман, Лобаченко, 1991; Зюман, 1991; Зюман, 1993а), что сопоставимо с полученными нами результатами по транскрипционной активности генов цитотоксических пептидов у данного вида.
Вместе с тем, исследования экспрессии генов АБП дрозофилы свидетельствуют об увеличении уровня транскрипционной активности данных генов при инфицировании бактериями В. thuringiensis в среднем в 10-20 раз (Lemaitre et al., 1997), что выше обнаруженных нами изменений транскрипционной активности. Данный феномен можно объяснить рядом причин биологического и методического характера.
Наиболее значимым, на наш взгляд, является то, что изменение уровня экспрессии при инфицировании в значительной степени видоспецифично и зависит от уровня транскрипционной активности данных генов в неинфицированном состоянии. В отличие от дрозофилы, у которой активация экспрессии генов АБП происходит, только после антигенного стимулирования, у медоносной пчелы, наблюдается значительный уровень активности данных генов и в неинфицированном (интактном) состоянии, что, по всей вероятности, является причиной менее выраженного изменения уровня активности генов АБП после инфицирования. Данное предположение подтверждается результатами исследований активности антибактериальных пептидов у медоносной пчелы Б.В. Зюмана (1993), данными по экспрессии антибактериальных пептидов у термитов Pseudacanthotermes spiniger (Lamberty et al., 2001).
Другой, не менее значимой на наш взгляд, причиной является то, что при изучении экспрессии генов АБП дрозофилы (Lemaitre et al. 1997), как и в большинстве исследований в данной области, при антигенном стимулировании использовался метод инъекции инфицирующего агента в гемоцель с нарушением покровов насекомого, что само по себе является мощным стресс-фактором, вызывающим активацию транскрипционной активности генов цитотокстических пептидов. С нашей точки зрения, более корректным является введение бактериальных культур естественным путём, то есть per os вместе с пищей.
