Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 1
2. Обзор литературы. Инициация транскрипции прокариот и ее регуляция 5
2.1. Структура РНК-полимеразы 5
2.2. Структура промоторов и их взаимодействие с РНК-полимеразой 9
2.2.1. Структура промоторов, транскрипционный цикл 9
2.2.2. Модуляция активности промоторов 14
2.2.2.1. Репрессия 14
2.2.2.2. Активация 17
2.2.3. Промоторы, активируемые при замедлении и прекращении роста Е. coli 20
2.3. Глобальные регуляторы транскрипции 23
2.3.1. Сигма S - ключевой фактор регуляции экспрессии генов при переходе клеток к стационарной фазе роста и при стрессах 24
2.3.1.1. Регуляция экспрессии гена rpoS на уровне транскрипции 26
2.3.1.2. Регуляция экспрессии гена rpoS на уровне трансляции 28
2.3.1.3. Регуляция внутриклеточного содержания os на стадии протеолиза 29
2.3.1.4. Строение os и особенности связывания с промотором 30
2.3.2. Белок CRP и сАМР 35
2.3.2.1. Структура белка CRP, взаимодействие с сАМР, ДНК и РНК-полимеразой...36
2.3.2.2. Участие CRP в регуляции транскрипции 39
2.3.3. CytR. 41
2.3.4. Гистоноподобные белки 43
2.3.4.1. H-NS 44
2.3.4.2. IHF - фактор интеграции 46
2.3.4.3. Белок FIS 48
2.3.4.4. Лейцин-зависимый белок Lrp 50
2.4. Микроцины - пептидные антибиотики энтеробактерий и генетические детерминанты, определяющие их синтез 53
3. Материалы и методы 60
4. Результаты 70
4.1. Особенности функционирования промотора оперона микроцина С51 (Ртсс) в зависимости от фазы и условий роста 70
4.1.1. Получение однокопийной конструкции Ртсс-/ас в составе рекомбинантного фага ?iDF 70
4.1.2. Активация Pmcc-/ac экспрессии при переходе клеток Е. coli в стационарную фазу роста 70
4.1.3. Особенности функционирования Ртсс в различных условиях роста клеток 73
4.1.4. Сравнение активности промотора оперона микроцина С51 и промотора гена lacZв штамме E.coli SBS1936 76
4.2. Сигма-S и сигма-70 субъединицы РНК-полимеразы в регуляции транскрипции оперона микроцина С51 76
4.2.1. Зависимость транскрипции Ртсс~^ от с — субьединицы РНК-полимеразы 76
4.2.2. Влияние суперпродукции а70 и а32 на экспрессию Ртсс-/ас 78
4.2.3. Экспрессия Ртсс-1ас в клетках Е.coli с мутацией rpoDSOO 81
4.2.4. Экспрессия ?тсс-1ас в клетках E.coli с мутацией ssrl в гене, кодирующем 6S-РНК 83
4.2.5. Анализ нуклеотидной последовательности Ротсс и влияние замен в сайте -10 на экспрессию тсс-1ас 84
4.3. Регуляция экспрессии Vmcc-lac в условиях голодания без глюкозы клеток E.coli в экспоненциальной фазе роста 88
4.4. Изучение роли глобальных регуляторов транскрипции белков CRP, CytR, H-NS и Lrp в регуляции экспрессии оперона микроцина С51 92
4.4.1. Роль белков CRP и CytR в регуляции экспрессии тсс-1ас. Локализация сайта связывания белка CRP 92
4.4.2. Изучение роли белка H-NS в регуляции экспрессии ?тсс-1ас 96
4.4.3. Роль белка Lrp 98
5. Обсуждение результатов 105
6. Выводы 113
7. Список литературы 114
- Структура промоторов и их взаимодействие с РНК-полимеразой
- Регуляция внутриклеточного содержания os на стадии протеолиза
- Особенности функционирования промотора оперона микроцина С51 (Ртсс) в зависимости от фазы и условий роста
- Анализ нуклеотидной последовательности Ротсс и влияние замен в сайте -10 на экспрессию
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Исследования, связанные с поиском и подробным изучением веществ с антибиотической активностью на протяжении многих десятилетий вызывали самое пристальное внимание специалистов различных областей медицины и биологии. В настоящее время интерес к поиску и изучению новых антибиотиков возрос в связи с широким распространением устойчивости патогенных бактерий к обычно используемым лекарственным препаратам, что привело к снижению эффективности действия большого количества антибиотиков.
В 1976 году была обнаружена новая группа антибиотических веществ, продуцируемых бактериями семейства Entcrobacleriaceae, которые вследствие своего малого размера были названы микроцинами. Микроцины являются антибиотиками пептидной природы, часто с необычной структурой, с различным типом действия; они активны в отношении грамотрицательных бактерий, особенно энтеробактерий разных видов и родов. В большинстве случаев синтез микроцннов определяется плазмидами, которые детерминируют также иммунитет к микроцину клетки-продуцента. При изучении микроцннов и генетического контроля их синтеза выявлены особенности, представляющие общебиологический интерес. Большой интерес вызывает изучение регуляции синтеза микроцннов, что является частью проблемы регуляции синтеза вторичных метаболитов бактерий.
Известно, что при переходе клеток грамотрицательных бактерий в стационарную фазу роста в ннх происходят существенные изменения экспрессии генов. В этих условиях ингибируется синтез большинства клеточных белков. Однако, наряду с этим происходит индукция синтеза ряда белков, которые необходимы бактериям для выживания в неблагоприятных условиях внешней среды. Многие антибиотики и другие вторичные метаболиты (токсины, органические кислоты и др.), а также большое количество ферментов продуцируются при переходе клеток в стационарную фазу роста, что определяет важность изучения этого периода жизни клетки для биотехнологии. В настоящее время механизмы регуляции экспрессии генов в данных условиях изучены недостаточно. До сих пор остается невыясненным, какие механизмы обеспечивают «молчание» генов в экспоненциальной фазе роста и их индукцию при переходе из экспоненциальной фазы в стационарную. Для изучения особенностей транскрипции в этих условиях гены, определяющие синтез микроцннов, могут служить удобной модельной системой.
-Л-
В моей работе эти вопросы исследуются на модели оперона микроцина С51-нуклеотидпептидного антибиотика с необычной структурой, обнаруженного в Лаборатории внехромосомной наследственности Института молекулярной генетики РАН.
Цель работы и задачи исследования
Целью настоящей работы было изучение регуляции экспрессии оперона микроцина С51, зависимой от фазы роста клеток Escherichia coll. Конкретными задачами работы были:
изучение особенностей функционирования промотора оперона микроцина С51 в различных условиях роста клеток Е. coli;
исследование роли сигма субъединиц РНК-полимеразы в регуляции экспрессии оперона микроцина С51;
- изучение роли 6S-PHK в регуляции экспрессии оперона микроцина С51;
изучение роли белков - глобальных регуляторов транскрипции (CRP, гистоноподобных белков II-NS и Lrp, белка CytR) в регуляции экспрессии оперона микроцина С51;
- выявление сайтов в промоторной области, функционально значимых для регуляции
транскрипции микроцинового оперона.
Научная новизна и практическая значимость
В представленной работе впервые исследованы особенности функционирования
промотора оперона микроцина С51 в различных условиях роста клеток Е.соїі. В
экспериментах, проведенных с использованием однокопийной конструкции Ртсс-/ас,
содержащей клонированную промоторную область микроцинового оперона, слитую с
репортером /ас-опероном в составе векторного фага XRS45, было показано, что
замедление роста (при переходе клеток в стационарную фазу, росте на минимальных
средах с различными источниками углерода) в большинстве случаев приводит к
активации транскрипции, инициированной с этого промотора. Проведено исследование
влияния мутаций в генах глобальных регуляторов транскрипции на экспрессию оперона
микроцина С51. Было установлено, что в регуляции экспрессии микроцинового опероиа
участвует сложная регуляторная сеть, включающая четыре глобальных регулятора
транскрипции: сигма S субъединицу РНК-полимеразы, белок-активатор CRP и два белка с
репрессирующим действием, H-NS и Lrp, Зависимость транскрипции оперона
микроцина С51 от гена rpoS показывает, что транскрипция выполняется главным образом
-ъ-
РНК-полимеразой, содержащей а . Белок CytR, который может модулировать действие белка CRP, в регуляции экспрессии Vmcc-lac участия не принимает.
Обнаружено, что глобальные регуляторы транскрипции белки CRP, H-NS и Lrp участвуют как в RpoS-зависимой, так и в RpoS-независимой регуляции экспрессии оперона микроцина С51. Определена локализация сайта связывания белка CRP с ДНК в промоторной области микроцинового оперона. Показано, что мутации в генах lrp и hns при росте клеток на минимальной среде с глюкозой приводили к увеличению экспрессии Pmcc-foc в экспоненциальной фазе роста, что позволило высказать предположение о роли этих белков в репрессии микроцинового оперона в этой фазе роста.
При исследовании возможного участия других сигма субъединиц РНК-полимеразы (кроме cjs) в транскрипции микроцинового оперона показана необходимость а70 для активации транскрипции этого оперона при переходе клеток в фазу замедления роста и стационарную фазу, а54 и а28 были несущественны для его транскрипции. Обнаружено, что суперпродукция о70 и а32 приводила к уменьшению экспрессии Ртсс-/ас, зависимой от as, по-видимому, в результате конкуренции этих сигма-субъединиц с os за лимитирующее количество кор-РНК-полимеразы. Показано, что 6S РНК не играет существенной роли в регуляции транскрипции оперона микроцина С51. Обнаружены различия в регуляции экспрессии оперона микроцина С51 при переходе культуры к стационарной фазе роста и при стрессе, вызванном голоданием без глюкозы клеток экспоненциальной фазы роста.
Показано, что введение замен в -10 сайт Ртсс, в результате чего был сформирован консенсус ТАТААТ, привело к повышению силы промотора, но не изменило зависимости транскрипции от фазы роста, os и белка CRP.
Практическая значимость работы связана с возможностью использования промотора оперона микроцина С51 в биотехнологии для создания векторов, обеспечивающих активацию (индукцию) синтеза продуктов метаболизма бактерий при переходе культур в стационарную фазу роста, без специальных индуцирующих воздействий.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Втором съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров Санкт-Петербург (1-5 февраля 2000г.), Путинской школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (28 мая-2 июня 2000 г.), Девятом Иранском конгрессе «Инфекционные болезни и тропическая медицина» (14-18 января 2001 г.), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва - Минск, ноябрь 2001 г.), Четырнадцатой зимней международной молодежной школе «Перспективные направления физико-химической
-ч-
биологии и биотехнологии» (Москва, 11-15 февраля 2002 г.), Седьмой Пущинской школе-конференции «Биология - наука 21 века» (апрель 2003 г.), ежегодных отчетных научных конференциях ИМГ РАН (1999-2003 гг.), семинарах Лаборатории внехромосомной наследственности микроорганизмов Института молекулярной генетики РАН.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и включает в себя 28 рисунков и 6 таблиц. Работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, включая описание материалов и методов, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Инициация транскрипции прокариот и ее регуляция.
Наиболее важной стадией транскрипции с точки зрения регуляции экспрессии генов является инициация транскрипции. У прокариот инициацию траснкрипции осуществляет холофермент, в котором различают пять субъединиц в составе кор-фермента и дополнительную а-субъединицу, которую также называют фактором инициации транскрипции, а-субъединица играет важную роль в процессах узнавания промоторов н расплетении ДНК. Вопросы инициации транскрипции лучше всего изучены для E.coli и будут рассмотрены на ее примере. В последнее время при изучении транскрипции были достигнуты большие успехи. В частности, предложена рентгеноструктурная модель кор-РНК-полимеразы Thermus aquaticiis [241], построена модель фрагмента с-субъединицы E.coli высокого разрешения [247].
Структура промоторов и их взаимодействие с РНК-полимеразой
Синтез РНК начинается с присоединения РНК-полимеразы к промоторам -участкам ДНК, определяющим специфические места инициации транскрипции. Структура типичного с -зависимого промотора приведена на Рис. 2.1.. Четыре компонента промотора важны для его функционирования [30, 84]. Это, прежде всего, два гексамера, расположенные в положениях -10 и -35 от точки начала транскрипции на нематричной нити ДНК. Их канонические (consensus) последовательности, выведенные на основе статистической обработки нуклеотидных последовательностей большого количества бактериальных промоторов, -соответственно ТАТААТ (этот сайт называют также блоком Прибнова) и TGTACA. Как правило, чем ближе последовательность этих сайтов к консенсусу, тем лучше промотор функционирует in vitro и in vivo — об этом свидетельствуют многочисленные эксперименты по введению замен в -10 и -35 сайты [213]. В настоящее время известно, что - 10 и -35 сайты связываются с двумя различными участками о субъединицы РНК-полимеразы. Участок 2 присоединяется к сайту -10, а участок 4 - к сайту -35 [190]. Различные сигма-субъединицы узнают промоторы с характерными консервативными последовательностями сайтов ДНК (приведены в Таб. 2.1.). Известно, что между сигма-субъединицами РНК-полимеразы in vitro и in vivo происходит конкуренция за связывание с лимитирующим количеством кор-фермента. Сигма-субъединицы проявляют разное сродство к кор-ферменту [62, 152]. Третьим компонентом промотора, существенным для его функционирования, является спейсерный участок между сайтами -10 и -35. Для РНК-полимеразы, содержащей а70, оптимальны промоторы с длиной этого участка 17 п.н. Уменьшение и увеличение спейсерного участка снижает активность промоторов. У промоторов Е. coli обнаружен еще один структурный элемент, влияющий на их активность - UP-элемент, район, очень богатый А+Т, расположенный перед -35 сайтом, между положениями —40 и -60 относительно старта транскрипции [58]. С UP элементом связывается а субъединица РНК-полимеразы, что усиливает ее связывание с промотором и способствует прохождению дальнейших стадий инициации транскрипции. Было показано, что очищенная а-субъединица в отсутствие остального комплекса РНК- полимеразы была способна узнавать и связываться с UP участком [190].
UP элементы были обнаружены у большого количества бактериальных промоторов; лучше всего они были изучены в случае промотора Р1 гена гтВ. Замена исходного участка PI ггпВ (-59) - (-38) на последовательность nnAAA(A/T)T(A/T)TTTTnnAA AAnnn повышала транскрипцию в 136-326 раз in vivo по сравнению с «диким» rrnB Р1 UP-элементом у Е coli [58]. Нельзя сказать, что UP-элемент является определяющим звеном в регуляции транскрипции абсолютно всех промоторов, поскольку у разных промоторов E.coli не наблюдалось консервативности UP-элемента, наряду с наличием высоко консервативных сайтов -10 и -35. Однако у ряда промоторов E.coli и B.subtilis А+Т-богатые последовательности выше -35 сайта могли взаимодействовать с РНК-полимеразой и способствовать увеличению траснкрипции in vitro в отсутствие дополнительных факторов [69].
Было показано, что группа промоторов E.coli, зависимых от а70, которые могут достаточно хорошо функционировать без четко выраженного -35 района, имеют удлиненный (extended) -10 сайт с нуклеотидной последовательностью TGNTATAAT. Образование открытого промоторного комплекса происходит у этих промоторов со скоростями, близкими к скоростям у промоторов, у которых имеются consensus -10 и -35 районы. За узнавание мотива TG отвечает район 2.5. о70 субъединицы [6]. Были обнаружены и некоторые другие структурные элементы промоторов, оказывающие влияние на их функционирование. Например, было показано, что С в положении -13 и, в меньшей степени, Т в положении -14 являются важными компонентами с - зависимых промоторов, увеличивающими транскрипцию с этих промоторов (Таб. 2.2.) [11]. Также выяснилось, что для активации транскрипции многих независимых промоторов важно, чтобы участок между сайтами -10 и -35 бьш богат парами А-Т. Это характерно для генов, которые позитивно контролируются гуанозинтетрафосфатом (ppGpp) [217J. ppGpp активирует экспрессию гена rpoS и тем самым опосредованно вызывает активацию экспрессии -зависимых генов, а также тех а70-зависимых генов, которые экспрессируются в стационарной фазе роста и при голодании [129]. На первом этапе инициации транскрипции происходит связывание холофермента РНК-полимеразы с промотором (Рис. 2.1.), в результате образуется закрытый промоторный комплекс, в котором ДНК еще сохраняет свою двуспнральнуїо структуру. В составе холофермента сигма субъединица (a ) взаимодействует одновременно с -10 и -35 районами промотора. В автономном состоянии сигма-факторы не способны связываться с ДНК. Присоединение РНК-полимеразы к промотору завершается расплетанием 10-15 п.н. двойной спирали ДНК в области старта транскрипции с образованием так называемого транскрипционного пузырька («transcription bubble»); закрытый промоторный комплекс переходит в открытый. В открытом промоторном комплексе РНК-полимераза защищает от ДНКазы I район ДНК между положениями 20 п.н. перед стартовой точкой транскрипции и 50-70 п.н. после стартовой точки. На следующем этапе при добавлении нуклеозидтрифосфатов РНК-полимераза синтезирует набор коротких РНК (2-8 н.), которые быстро высвобождаются вследствие непрочной связи РНК-продукта с матрицей и РНК-полимеразой (абортивная транскрипция). Переход от этой стадии к элонгации сопровождается структурными перестройками комплекса; они приводят к укорочению района ДНК, с которым контактирует РНК-полимераза, до приблизительно 35 п.н. (Рис. 2.2.) При этом прочность комплекса значительно возрастает. Это позволяет РНК-полимеразе, не покидая матрицы ДНК, синтезировать молекулы РНК длиной до 10 н.
Регуляция внутриклеточного содержания os на стадии протеолиза
- Роль протеазы ClpXP. В экспоненциально-растущих клетках а чрезвычайно нестабильна, время ее полужизни составляет 1-3 минуты. Такая нестабильность обусловлена главным образом действием протеазы ClpXP. Мутации в генах clpX и clpP, кодирующих две субъединицы протеазы ClpXP, приводили к четырехкратному увеличению уровня а в экспоненциальной фазе роста [201]. В условиях голодания и сосмотического шока с стабилизируется. Сразу же после воздействия осмотического шока время полужизни as было 50 минут, а затем снижалось до 16 минут через 45, минут после начала осмотического шока [167]. Поскольку в стационарной фазе роста содержание ClpXP повышается, наряду с увеличением времени полужизни os, это значит, что повышенная стабильность а в стационарной фазе роста не зависит от концентрации протеазы ClpXP.Роль белка RssB. Для того, чтобы протеаза ClpXP могла узнавать as, помимо белка H-NS требуется специфический фактор узнавания — белок RssB, который кодируется геном rssB. Мутации в гене rssB приводят к повышению стабильности os и повышенному уровню о в экспоненциальной фазе роста [165].
Долгое время вопрос о том, каковы особенности узнавания промоторов РНК-полимеразой, содержащей os по сравнению с ферментом, содержащим а70, и что определяет выбор а для инициации транскрипции большого количества генов, экспрессирующихся при переходе клеток Е. coli в стационарную фазу роста и при различных стрессовых воздействиях, оставался нерешенным.
Действительно, а обладает сходным с о70 строением. Особенно высокая гомология наблюдается в участках 2.3., 2.4. и 4.2. Промоторные последовательности типичных а -зависимых генов могут быть сходными с последовательностями генов, для транскрипции которых используется ст70. Кроме того, in vitro большое количество промоторов узнаются РНК-полимеразой, содержащей обе сигмы, хотя in vivo для транскрипции с этих промоторов используется одна из двух сигма субъединиц [213, 48]. В связи с выше сказанным до сих пор остается недостаточно понятным, как эти два сг фактора могут контролировать экспрессию различных регулонов. Прогресс в понимании парадокса выбора a /а для транскрипции различных генов был достигнут лишь в самое последнее время. Ниже будут кратко суммированы данные о факторах, определяющих этот выбор [94].
Элементы промотора, участвующие в выборе а 1) -10 сайты промоторов, использующих сигмы S и 70, сходны. Консенсусы этих сайтов соответственно СТАСАСТ [140] и ТАТААТ. Было показано, что аденин в положении -8 встречается в природных с - зависимых промоторах почти так же часто, как цитозин в положении -13.
С целью изучения влияния нуклеотидного состава гексамера -10 на связывание с РНК-полимеразой, несущей os, было сконструировано много искусственных промоторов введением замен в этот сайт, в частности, промоторов на основе промотора гена lacUV5, узнаваемого in vitro РНК-полимеразой, содержащей а и a . У этого промотора сайт —10 имел последовательность ТАТААТ. Оказалось, что любая замена в положении -10 приводила к резкому снижению транскрипции с lacUV5-промотора, осуществляемой РНК-полимеразой, несущей as (Таб. 2.3.).
2) Присутствие в промоторе выраженного сайта -35 является необязательным для большинства а -зависимых промоторов [37, 70]. Это согласуется с наблюдением что in vitro Еа взаимодействует преимущественно с -10 районом, в то время как контакты с -35 районом могут быть слабыми [37]. Замена в -35 сайте цитозина на тимидин в с -зависимом промоторе гена osmY уменьшала транскрипцию, проводимую Ea , и увеличивала транскрипцию, осуществляемую Ea . Если же эти замены вводились в -35 сайт а70- зависимого промотора генаproU, то Еа70 не могла инициировать транскрипцию с мутантного промотора, но транскрипция могла осуществляться РНК-полимеразой, ненесущей a . Эти данные показывают, что последовательность в -35 участке действует как часть механизма дискриминации между as на70 [235].
3) Цитозин в положении -13 в "extended -10 районе" (Таб. 2.2.) существенен для as зависимых промоторов; он встречается у более чем 80% природных промоторов, контролируемых a [11, 57]. Замена С (-13) на тимин в промоторе гена osmE уменьшала экспрессию с участием Eas значительно сильнее, чем экспрессию, опосредованную Еа [20]. Было показано, что С (-13) взаимодействует непосредственно с аминокислотой лизином 173 в районе 2.5. а (в то время как в этом районе а70 присутствует глютамат). Введение цитозина в положении -13 в а70- зависимый промотор, у которого -35 район был элиминирован, приводило к значительному увеличению селективности использования a [94]. Однако, несмотря на важность этого элемента промотора, С(-13) не абсолютно необходим для более эффективной инициации транскрипции Eas, чем Еа70, как показало изучение мутантных вариантов промотора гена aidB [98]. 4) Большинство природных а -зависимых промоторов содержат АТ-богатый район непосредственно перед -10 участком [111, 129]. У искусственно сконструированных промоторов присутствие АТ-богатого района между стартом транскрипции и -10 сайтом и увеличение содержания АТ-пар способствовало селективности Eas, особенно в сочетании с нуклеотидом С в положении (-13) [94]. 5) Большинство а8-зависимых промоторов обнаруживают перед кор-промоторным районом мотив, сходный по последовательности и локализации с дистальным полусайтом UP элемента (см. Раздел 2.2.1.); этот элемент контактирует в сильных рибосомных промоторах с карбокситерминальным районом а субъединицы РНК
Особенности функционирования промотора оперона микроцина С51 (Ртсс) в зависимости от фазы и условий роста
Анализ иуклеотидных последовательностей промоторных областей оперонов микроцина С51 (Рис. 4.10.) и микроцина С7 [164] показал их большое сходство (Рис. 4.9.). В 207 пн промоторной области оперона микроцина С51 (район до начала гена тссА) имеются всего 6 замен и два делегированные основания по сравнению с этой областью оперона микроцина С7 [65, 164]. Для промотора оперона микроцина С7 была определена стартовая точка транскрипции и -10 сайт [164, 79]. Область, включающая эти сайты (участок в 53 п.н. перед RBS), идентична у указанных промоторов. Поэтому мы можем предполагать, что стартовая точка и -10 район у промотора оперона микроцина С51 совпадают с этими сайтами оперона микроцина С7. В случае оперона микроцина С7 было показано, что стартовая точка была одной и той же как в штамме дикого типа, так и в rpoS мутанте [164], т.е. транскрипция с этого оперона может осуществляться РНК-полимеразой, несущей различные а субъединицы.
Район -35 Vmcc не гомологичен консенсус последовательности этого сайта, что характерно для промоторов, участвующих в as- и CRP-зависимой транскрипции; показано, что выраженный —35 сайт не является необходимым для узнавания промотора РНК-полимеразой, содержащей a [213, 37]. Нуклеотидная последовательность промотора перед -35 районом и между-10 и-35 участками богата АТ-парами, что также типично для большинства -зависимых промоторов.
Сайт -10 в промоторе микроцина С51 существенно отличается от консенсус последовательностей -10 сайтов, узнаваемых холоферментом РНК-полимеразой, несущей а70 или cs, ТАТААТ и СТАСАСТ [140], соответственно. С использованием техники ПЦР мы ввели две замены в -10 сайт и сконструировали сайт ТАТААТ. Измененная регуляторная область была клонирована в плазмиду pRS415, а затем перенесена рекомбинацией в векторный фаг A.RS45. Полученный рекомбинантный фаг A.AV был интегрирован в хромосому штаммов E.coli SBS2151 и SBS2152.
В Ртсс перед -10 сайтом, через 1 пн от него, имеется 5 G-3 мотив, т.е. измененный промотор содержит "extended" -10 элемент 5 GnTATAAT-3 . Было показано, что подобный - 10 элемент усиливал активность ряда сг70-зависимых промоторов, функционирующих без участия активаторов, у которых не наблюдалось гомологии с консенсус - 35 районом. TGn мотив был способен компенсировать отсутствие взаимодействия РНК-полимеразы с — 35 сайтом посредством дополнительного контакта с РНК-полимеразой; главную роль в этом узнавании играет район 2.5 а [29, 6]. Сходная роль этого мотива не была показана для о -зависимых промоторов.
Мы предполагали, что превращение -10 сайта в consensus ТАТААТ усилит активность Vmcc. Действительно, уровень экспрессии тсс-1ас в клетках, несущих профаг с измененной -10 областью Vmcc, увеличивался, хотя и не сильно, не более, чем вдвое.
Далее, т.к. не исключалось, что а субъединица РНК-полимеразы принимает
участие в транскрипции тсс-1ас, то присутствие консенсус последовательности для а70 в -10 сайте и "extended" -10 элемента могли существенно повысить роль а70 в транскрипции с Ттсс, значительно уменьшить или снять зависимость транскрипции от ст . Однако, проведенные эксперименты показали, что основные закономерности регуляции экспрессии Vmcc-lac не изменялись существенно при конструировании ТАТААТ -10 сайта: сохранилась зависимость экспрессии от CTS , фазы роста и белка CRP (о роли CRP в экспрессии тсс-1ас см. в разделе 4.4.1) (Рис. 4.11.). Уровень экспрессии Vmcc-lac в клетках с мутацией сгр был снижен в одинаковой степени в случае промоторов дикого типа и модифицированного (данные не показаны). В rpoS мутантах в большей части экспериментов наблюдалось небольшое (в 1,3-1,5 раза) увеличение процента остаточной экспрессии тсс-1ас в случае штамма, несущего фаг A.AV с модифицированным промотором, что, возможно, отражает тенденцию к некоторому снижению роли ст в транскрипции с промотора Ртсс при конструировании сайта ТАТААТ.
Увеличение активности модифицированного промотора было, по-видимому, вызвано усилением взаимодействия РНК-полимеразы, несущей а , с улучшенным -10 сайтом. Ранее было показано для некоторых а -зависимых промоторов, что изменения — 10 сайта, приближающие его к consensus ТАТААТ, усиливали транскрипцию с этих промоторов [20].
Когда рост клеток Е. coli останавливается в результате голодания без существенно важных компонентов среды, происходит активация экспрессии многих генов при общем резком снижении экспрессии большинства генов [148, 137]. В настоящей работе мы провели эксперименты по изучению функционирования Ртсс в условиях голодания клеток без единственного источника углерода - глюкозы. Клетки Е.соїі ЕІМ2 выращивали на минимальной среде с 0,2% глюкозы в течение ночи, затем их пересевали в свежую среду того же состава и растили до середины экспоненциальной фазы. После этого клетки концентрировали на мембранном фильтре N4 (Россия), отмывали один раз средой того же состава, но без глюкозы, и суспензию разводили до ODeoo 0,1. Эта процедура приводила к быстрой остановке роста клеток.
Перенесение клеток в среду без глюкозы (резкое голодание) вызывало немедленную активацию экспрессии Ртсс-1ас (Рис. 4.12.). В контрольном варианте (процедура такая же, но использовалась среда с глюкозой 0,2%) активации экспрессии Ymcc-lac за это время не происходило, она наблюдалась при более высоких СШбоо при замедлении роста культуры и переходе в стационарную фазу роста [65]. В Асгр мутанте активация экспрессии Ртсс-1ас не происходила (данные не приводятся).
В штамме ЕІМ10, несущем мутацию rpoS::Kmr, мы наблюдали сходную картину -немедленную активацию экспрессии Ртсс-1ас при голодании без глюкозы (Рис. 4.12.). При этом во всех проведенных экспериментах происходило даже более резкое увеличение активности р-галактозидазы в rpoS штамме, чем в изогенном EIM2 rpoST штамме. И хотя уровень активности р-галактозидазы в rpoS мутанте не доходил до ее уровня в штамме дикого типа, такая кинетика активности фермента при голодании без глюкозы свидетельствует о том, что активация экспрессии тсс-1ас в этом случае не требовала as субъединицы РНК-полимеразы. Таким образом, индукция промотора оперона микроцина С51 может происходить не только при замедлении роста клеток Е. coli, но и в клетках ранней экспоненциальной фазы в результате стресса, вызванного глюкозным голоданием. В этих обстоятельствах мы также видим возможность индукции Ртсс, не зависимой от crs. Интересно, что при голодании клеток экспоненциальной фазы (EIM2) без единственного источника азота (NH4CI) не наблюдалась активация экспрессии тсс-1ас. Сколько-нибудь заметной активации экспрессии не происходило и при переходе к стационарной фазе клеток, растущих на минимальной среде с 0,2% глюкозы и низкой концентрацией NH4CI (0,125 г/л), с исчерпанием которого, как мы показали, были связаны замедление и остановка роста клеток (данные не приводятся). Причина отсутствия активации экспрессии тсс-1ас в этих условиях в настоящее время неясна.
Чтобы проверить, участвует ли а70 в индукции экспрессии Ртсс-1ас при глюкозном голодании клеток экспоненциальной фазы роста, клетки штаммов E.coli EIM34 и EIM35, несущих мутацию rpoD800, переносились в среду 2 без глюкозы, нагретую до 40С. В контроле использовалась та же среда при 30С. Мы наблюдали активацию экспрессии тсс-1ас при 40С, хотя в этом случае увеличение активности р-галактозидазы было менее резким, прекращалось раньше, и уровень активности фермента был ниже, чем при 30С (Рис. 4.13А.)- Такая же закономерность была обнаружена и в клетках штамма EIM35, несущего мутации rpoD800 и rpoS (Рис. 4.13Б.). Таким образом, при стрессе, вызванном глюкозным голоданием, частичная индукция экспрессии Ртсс-1ас может происходить независимо от обеих сигма субъединиц РНК-полимеразы - ст70 и as. Эти данные свидетельствуют о возможности участия какой-то иной сигма субъединицы в транскрипции с Ргасс в данных условиях.
Анализ нуклеотидной последовательности Ротсс и влияние замен в сайте -10 на экспрессию
Известно, что лейцин может модулировать действие белка LRP на транскрипцию ряда бактериальных оперонов (ингибировать или повышать связывание LRP с промоторным районом) [31]. В связи с этим мы исследовали эффект добавления 1-лейцина в среду на уровень экспрессии с промотора микроцинового оперона. На Рис. 4.20. показана активность р- галактозидазы в клетках 1гр+ штамма EIM17 и Alrp мутанта EIM13, содержащих XDF, растущих на минимальной среде с 0,1% глюкозой в присутствии 1-лейцина и без него. В штамме Alrp уровень транскрипции, инициированной с промотора Ртсс, был существенно выше в экспоненциальной фазе роста, чем в штамме дикого типа. Добавление в среду 1-лейцина в концентрации 100 мкг/мл (0,769 мМ) снижало активность Р-галактозидазы и в штамме 1гр+ и в штамме Alrp. При 50 мкг/мл (0,3845 мМ) 1-лейцина активность р-галактозидазы также была снижена, но в меньшей степени. Эти концентрации 1-лейцина были выбраны в связи с результатами Landini et al. [132], показавших, что увеличение концентрации лейцина до 100 мкг/мл повышало экспрессию гена aidB.
В ряде других работ эксперименты in vivo и in vitro проводились с более высокими концентрациями лейцина, до 5-10 мМ [31]. Повышение концентрации 1-лейцина в среде выше 100 мкг/мл в наших опытах приводило к обратному эффекту - уровень экспрессии Pmcc-foc в период замедления роста клеток 1гр+ штамма возрастал с увеличением количества лейцина; при этом наблюдалась более ранняя активация транскрипции (Рис. 4.21.). Сходная закономерность была обнаружена и в клетках штамма, несущего Alrp.
Мы исследовали действие на экспрессию Рщсс- с еще нескольких аминокислот. Известно, что 1-аланин в большинстве изученных случаев действовал на экспрессию генов таким же образом, как и лейцин [31]. Однако, в нашем случае 1-аланин не оказывал подавляющего эффекта при добавлении его в среду в той же молярной концентрации, что и 1-лейцин (0,769 мМ), напротив, активность Р-галактозидазы в клетках повышалась. Увеличение уровня экспрессии Рщсс- гс (в период активации экспрессии) наблюдалось и при более высоких концентрациях 1-аланина и 1-пролина (Рис. 4.22.). Такая же закономерность была обнаружена при добавлении в среду пролина и гистидина в штаммах дикого типа и Alrp (данные не приводятся).
Таким образом, присутствие аминокислот в среде (кроме низких концентраций 1-лейцина) увеличивает уровень экспрессии оперона микроцина С51. При этом не было отмечено влияния даже высоких концентраций аминокислот (1.3 г/л, или
10 мМ) на скорость роста и оптическую плотность культуры в стационарной фазе роста. Что же касается снижающего экспрессию Vmcu-lac действия 50-100 мкг/мл 1-лейцина, то следует отметить, что этот эффект наблюдался как в клетках дикого типа, так и в Alrp-мутанте. Это показывает, что эффект лейцина, скорее всего, не связан с белком Lrp; по-видимому, лейцин оказывает действие на какие-то другие процессы в клетке, влияющие, в свою очередь, на экспрессию оперона микроцина С51.
В настоящей работе были исследованы закономерности регуляции экспрессии генов, определяющих биосинтез нуклеотидпептидного антибиотика микроципа С51, представителя новой интересной группы антибиотических веществ - микроцинов. Синтез микроципа С51, как и других антибиотиков, зависит от фазы роста клеток бактерий и активируется в фазе замедления роста и переходе культуры в стационарную фазу. В экспериментах, проведенных с использованием однокопийной конструкции Рты-lac, содержащей клонированную промоторную область оперона микроципа С51, слитую с беспромоторным /ас-опероном в составе векторного фага A.RS45, мы показали, что при переходе клеток в стационарную фазу наблюдается активация транскрипции, инициированной с этого промотора.
При исследовании функционирования промотора Ртсс в различных условиях выращивания наблюдалась отрицательная корреляция уровня экспрессии Ртсс-/ас и скорости роста клеток в экспоненциальной фазе. Эта же закоиоліериость была обнаружена для других промоторов, активируемых при замедлении роста (см. Раздел 2.3.). Однако, мы наблюдали эту закономерность не всегда: она проявлялась при росте клеток на минимальных средах с различными источниками углерода (глюкоза, глицерин, ацетат, глюкоза + 0,1% дрожжевого экстракта), при различных температурах роста, но не соблюдалась, когда клетки росли на богатой среде LB - в этом случае при повышении скорости роста клеток (по сравнению с минимальными средами) наблюдался более высокий уровень экспрессии Ртсс-/ас. Увеличение аэрации в среде также приводило к повышению скорости роста клеток в экспоненциальной фазе и к возрастанию экспрессии Ртсс-/ас. Таким образом, обратная корреляция скорости роста бактерий и уровня экспрессии Pmcc- c может нарушаться при действии на клетку каких-то дополнительных факторов.
Активация экспрессии Ртсс-/яс происходила не только при переходе клеток Е.соїі в фазу замедления роста, но и при перенесении клеток экспоненциальной фазы роста на среду без глюкозы (т.е. при резком голодании без глюкозы). Мы не наблюдали активации экспрессии Ртсс-/ас при других стрессовых воздействиях: при голодании без единственного источника азота NII4CI, повышении температуры до 40С, повышении осмотической силы среды (при добавлении 0,2 и 0,3M NaCl в минимальную среду с 0,2% глюкозы). Чем Ртсс отличается от других промоторов, активируемых таким, например, стрессовым воздействием, как осмотический шок, и какие особенности структуры промоторов определяют их способность отвечать на стрессовые воздействия активацией транскрипции, в настоящее время неизвестно.
В рамках настоящей работы была исследована роль различных сигма субъедишщ РНК-полимеразы и действие глобальных регуляторов транскрипции в регуляции экспрессии оперона микроцина С51.
Как известно, инициация транскрипции различных генов может происходить при участии разных сигма субъединиц РНК-полимеразы. Сигма субъединицы определяют узнавание промотора РНК-полимеразой. Использование различных сигма факторов является важным способом регуляции транскрипции, обеспечивающим включение различных генов (см. раздел 2.1, ссылки [149, 105]). ст субъединица существенна для нормального роста клеток, она отвечает за инициацию транскрипции генов, участвующих в основном метаболизме клетки. Большое количество генов грамотрицательных бактерий, экспрессирующихся в отсутствие активного роста клеток и при стрессовых воздействиях, транскрибируются с участием crs субъединицы РНК-полпмеразы [93, 105].
Промотор оперона микроцина С51 относится к числу as - зависимых промоторов. Однако, частичное сохранение экспрессии в rpoS мутантах показывает возможность участия в процессе транскрипции иной сигма субъедииицы РНК-полимеразы. Анализ иромоторной области оперона микроцина С51 показал, что в ней отсутствует консенсусная -35 последовательность, что характерно для многих других CTS -зависимых промоторов. В настоящее время стало ясно, что холофермент РНК-полимераза, содержащая а70, узнает -35 и -10 области промоторной зоны, в то время как as узнает главным образом -10 область [213, 37].
Для CTS -зависимых промоторов, не имеющих выраженной - 35 области, характерна большая сложность регуляции инициации транскрипции с этих промоторов, с участием дополнительных факторов, например, белка CRP, гистоноподобных белков (H-NS, IHF и др.), ppGpp, белков Lrp, OxyR и др. [129, 36, 133]. Что касается промотора оперона микроцина С51, то, как мы показали, в регуляции транскрипции с этого промотора участвует сложная регуляторная сеть, включающая активаторный комплекс белка CRP и с-АМР, а также два белка, оказывающих репрессирующее действие - Lrp и H-NS.
