Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы. 5
1. Транспорт веществ через бактериальную мембрану. 5
1.1. Общая характеристика транспортных белков. Типы и классификация, 5
1.2. Белки множественной лекарственной устойчивости и их регуляция 13
1.3. Транспортеры аминокислот у разных организмов. .21
1.3.1. Экспортеры аминокислот у Corynebacterium glutatnicum 24
1.3.2. Импортеры аминокислоту Corynebacterium glutatnicum ЗО
1.3.3. Экспортеры аминокислот у Escherichia coli ЗО
1.3.4. Импортеры аминокислот у Escherichia coli 37
1.3.5. Системы устойчивости к низким рН у Ecoli. 41
2. Общие принципы регуляции генной экспрессии у прокариот. Глобальные и локальные регуляторы .42
2,1. Глобальный регулятор Lrp. 46
2.1.1. Строение белка Lrp 47
2.1.2. Регуляция экспрессии lrp, 48
2.1.3. Фенотип мутантов. 50
2.1.4. Сайты связывания Lrp. Влияние экзогенных аминокислот 51
2.1.5. Гены, экспрессию которых регулирует Lrp. 54
2.1.6. Взаимодействие с другими факторами 59
2.1.7. Семейство AsnC-Lrp 61
3. Заключение. 63
II. Материалы и методы. 64
1. Бактериальные штаммы, ростовые среды, плазмиды и фаги 64
2. Проведение PCR 67
3. Клонирование генов, кодирующих белки семейства RhtB 67
4. Определение Минимальных Ингабирующих Концентраций (МИК) 68
5. Интеграция rcimyeaS под Р-я^,о промотором в хромосому Ecoli, 69
6. Проведение ферментации 69
7. Вьщеление, очистка ДНК, клонирование, трансформация и трансдукция 72
8. Конструирование трансляционных слияний беспромоторного гена \асТ и регуляторных областей генов rhtB, rhtC,yeaS nyahN 74
9. Определение уровня экспрессии генов. .75
10. Инактивация генов в хромосоме E.colt 76
11. Проведение primer extension 77
III. Результаты и обсуждение 78
1. Клонирование генов yfiK, yggA и yahN, кодирующих белки - члены семейства RhtB, и изучение влияния их сверхэкспрессии на устойчивость клеток Escherichia colt к аминокислотам и их аналогам, а также на накопление аминокислот клетками соответствующих штаммов-продуцентов . 78
2. Исследование гена yeaSr 84
2.1. Компьютерный анализ белка YeaS по предсказанной аминокислотной последовательности 84
2.2. Влияние амплификации гена yeaS на устойчивость накопление аминокислот модельными штаммами-продуцентами E.coli .85
2.3. Влияние сверхэкспрессии гена yeaS иа накопление аминокислот модельными штаммами-продуцентами E.coli 88
2.4. Влияние разобщителя на накопление лейцина клетками E.coli, .91
2.5. Индукция экспрессии renayeaS аминокислотами 92
3. Исследование регуляции генов, кодирующих белки семейства RhtB, на примере генов rhtB,rhtC, yeaS и yahN 94
3.1. Исследование регуляторной области rcimyeaS .94
3.2. Компьютерный анализ регуляторных областей генов, кодирующих белки семейства RhtB .95
3.3. Экспрессия генов, кодирующих белки семейства RhtB, зависит от фазы роста культуры и состава среды культивирования, 96
3.4. Экспрессия генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN практически не зависит от а!-субъединицы РНК-полимеразы и регулируется глобальным регулятором Lrp 97
3.5. Влияние экзогенных аминокислот на уровень экспрессии генов, кодирующих белки семейства RhtB 101
3.6. Влияние физиологических стрессов на уровень экспрессии генов rhtB,rhtCtyeaS\iyahN. 106
3.7. Уровень экспрессии генов, кодирующих белки семейства RhtB, не зависит от OmpR, Crp, Fis, MarR, AcrR, RelA и SpoT Ill
4.8. Уровень экспрессии гена еа^не регулируется продуктом тепйуеаТ 112
IV. Заключение 118
V. Выводы 120
VI. Список литературы
- Транспорт веществ через бактериальную мембрану.
- Сайты связывания Lrp. Влияние экзогенных аминокислот
- Клонирование генов yfiK, yggA и yahN, кодирующих белки - члены семейства RhtB, и изучение влияния их сверхэкспрессии на устойчивость клеток Escherichia colt к аминокислотам и их аналогам, а также на накопление аминокислот клетками соответствующих штаммов-продуцентов
- Компьютерный анализ регуляторных областей генов, кодирующих белки семейства RhtB
Введение к работе
Актуальность темы. Штаммы Escherichia coli широко используются для получения продуцентов различных биологически активных веществ, в частности, аминокислот. Аминокислоты применяют в различных отраслях, в основном в пищевой, кормовой и фармацевтической промышленности. Мировой объем продукции аминокислот составил в 1998 году 3 миллиарда долларов США, и эти показатели растут на 5-10% каждый год.
Для создания штаммов-продуцентов с заданными свойствами и высокой эффективностью продукции требуется детальное знание метаболических путей и процессов регуляции, контролирующих клеточный метаболизм.
В последнее время появляется все больше данных о том, что немаловажную роль в увеличении эффективности продукции биологически активных веществ штаммами-продуцентами Е. coli играют белки, осуществляющие транспорт из клетки конечного продукта. У эффективных продуцентов концентрация целевого метаболита может достигать значительной величины, например, при ферментации треонина штаммом-продуцентом Е coli концентрация последнего в культуральной жидкости составляет 100-120 г/л. В этих условиях может происходить подавление активности ферментов и роста клетки продуктами собственного метаболизма. Поэтому для увеличения выхода продукта необходимо уменьшать его внутриклеточную концентрацию. Одним из способов такого уменьшения является активация экскреции метаболитов.
В процессе ферментации может изменяться множество параметров среды: доступность различных питательных веществ, концентрации кислорода и углекислого газа, рН и осмотический статус среды и т.д. В этих условиях активируются так называемые глобальные или мультигенные регуляторные системы. К ним относятся, в частности, системы, защищающие клетку от стрессов, в том числе, системы осмотического стресса, перехода в стационарную фазу роста, в состояние анаэробиоза и др. Поскольку для получения максимального выхода продукта необходимо культивировать штамм-продуцент в наиболее подходящих условиях, чрезвычайно интересным представляется изучение влияния глобальных регуляторов на различные компоненты ферментных и транспортных систем клетки.
Поиск и изучение генов, продукты которых ответственны за транспорт метаболитов из клетки, а также опрсделеЬгііРЩШі^о^ФММЯіІ их экспрессии
различных глобальных регуляторных систем является важной задачей, которая имеет большое научное и практическое значение.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение генов Е. coli, кодирующих белки, входящие в состав семейства RhtB. Эти гены являются паралогами ранее описанного гена rhtB, продукт которого осуществляет экскрецию гомосерина и треонина из клеток Е. coli.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние сверхэкспрессии генов - паралогов rhtB на устойчивость клеток к аминокислотам и их аналогам.
Изучить влияние сверхэкспрессии этих генов на накопление аминокислот штаммами Е. coli - продуцентами аминокислот.
Провести компьютерный поиск возможных сайтов связывания белков -регуляторов в регуляторных областях генов rhtB, rhtC, yeaSviyahN.
Сконструировать вектор на основе малокопийной плазмиды pMW119 для исследования уровня экспрессии генов на основе определения активности (З-галактозидазы.
Определить индукцию экспрессии исследуемых генов аминокислотами.
Изучить влияние аллельного состояния генов, кодирующих белки регуляторы, на уровень экспрессии исследуемых генов.
Изучить влияние некоторых физиологических стрессов на уровень экспрессии исследуемых генов.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе были исследованы гены, кодирующие белки - члены семейства RhtB: yfiK, yeaS, yggA и yahN. Впервые показано, что амплификация каждого из них повышает устойчивость клеток Е. coli к нескольким аминокислотам и/или их аналогам и увеличивает продукцию ряда аминокислот модельными штаммами-продуцентами. При этом сверхэкспрессия гена yeaS приводит к значительному увеличению накопления в среде культивирования лейцина, и в меньшей степени -метионина и гистидина. Эти данные представляют практический интерес при получении промышленных штаммов-продуцентов аминокислот на основе Е coli. В работе также исследовалась регуляция генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN. Установлено, что экспрессия гена yeaS индуцируется такими аминокислотами, как лейцин, а-аминобутират и, в меньшей степени, треонин, метионин, лизин,
гистидин, аланин и гомосерин. Показано, что для осуществления этой индукции необходимо присутствие в клетке белка Lrp, который является репрессоромyeaS.
Экспрессия генов rhtB, rhtC и yahN также регулируется белком Lrp. Кроме того, обнаружено, что уровень экспрессии гена yahN значительно падает при добавлении в среду лейцина, и это падение также зависит от присутствия в клетке белка Lrp.
Также показано, что продукт гена уеаТ, расположенного рядом с геном yeaS на хромосоме Е coli и кодирующего LysR-подобный регулятор, не оказывает влияния на экспрессию генауеаЗ'.
Кроме того, изучено влияние некоторых физиологических стрессов на уровень экспрессии генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN. Показано, что в случае ряда стрессов уровень экспрессии всех четырех генов увеличивается в несколько раз.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на конференции ВОГИС «Генетика в XXI веке» (Москва, 6-12 июня 2004 г.) и на смотре-конкурсе работа сотрудников ЗАО «АГРИ» (Москва, 14-18 июня 2005 г.). Диссертация была апробирована на заседании секции по молекулярной генетике ученого совета ГосНИИГенетики 27 апреля 2005 года.
Публикации. По теме диссертации опубликовано две печатные работы, из них одна в отечественном журнале, и два тезисных сообщения в материалах научной конференции.
Структура работы. Диссертация изложена на 135 страницах печатного текста, включая 32 рисунка и 15 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы по теме диссертации, описания методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, заключения, выводов и списка цитированной литературы (184 наименования).
Транспорт веществ через бактериальную мембрану.
Белки, осуществляющие транспортные функции, весьма различны как по своему строению, так и по субстратной специфичности. При помощи компьютерного разница в консервативности разных доменов транспортных белков, по мнению автора, предполагает либо незначительное участие петель в функционировании белка, либо их роль в обеспечении специальных функций, характерных для каждого конкретного белка, например, связывание субстратов.
ABC и MFS надсемейства, возможно, произошли в эволюции раньше остальных, примерно 3,5 миллиарда лет назад. МІР семейство возникло следом, примерно 2,5 миллиарда лет назад, RND семейство возникло примерно 2 миллиарда лет назад, причем оно не имело источников в ABC или MFS семействах; после возникновения эукариот возникло семейство MCF, примерно 1,5 миллиарда лет назад, и последними возникли зависимые от заряда на мембране Na+ и Са2+ каналы, менее 1 миллиарда лет назад [137],
Порины. Белки наружной бактериальной мембраны, порины, образуют каналы во внешней бактериальной мембране и способствуют осуществлению через нее неселективного транспорта многих веществ. Они имеют структурное сходство с белками, образующими неионные каналы в наружных мембранах митохондрий эукариот [21]. Бактериальные порины, имеющие антипараллельную р-структуру, структурно не похожи на другие транспортные белки, которые будут описаны ниже. И хотя все известные порины имеют сходную вторичную структуру, нет данных, позволяющих отнести их к какому-либо одному семейству [137].
Бактериальные сахарные пермсазы (TTS). Все белки этого надсемейства катализируют транспорт Сахаров. В норме активный комплекс состоит из двух белков, ответственных за связывание энергии, Энзима 1 и НРг, и трех сахар-специфичных белков или белковых доменов, обычно обозначаемых как комплекс II, состоящий из ПА, ИВ и НС доменов или субъединиц. Иногда эти домены связаны ковалентно, а иногда они связаны гибкими связями. Существует два типа таких связей, названных АР (аланин-пролин-богатая) и Q (глутамат-богатая) связи, которые гибко соединяют несколько более жестких доменов [137].
PTS пермеазы используют энергию, полученную за счет дефосфорелирования фосфоенолпирувата. Сначала фосфорелируется Энзим I, далее фосфат переносится на маленький (примерно 85 остатков), термостабильный белок НРг. Он затем фосфорелирует сахар-специфичный комплекс II (сначала ПА, а затем ІІВ домен или субъединицу этого комплекса), и тогда комплекс может осуществлять транспорт сахара при помощи домена или субъединицы ІІС [137].
Подразделение этих белков по подсемействам основано на специфичности к сахару, который переносит тот или иной белок, а также на дивергентном эволюционном расхождении организмов, у которых он встречается. Так, все проанализированные пермеазы сахарозы (а-гликозид), трепшозы (другой а-гликозид) и ароматических р-гликозидов формируют один кластер; все проанализированные пермеазы глюкозы и N-ацетилглюкозамииа формируют второй кластер; фруктозо- и машштол-пермеазы формируют третий кластер; и лактозо- и целлобиозо- ф-галактозид) пермеазы вместе формируют четвертый кластер большого семейства сахарных пермеаз. Более того, внутри каждого кластера, пермеазы, специфичные к какому-то конкретному сахару, кластеризуются друг с другом, несколько отличаясь от белков другой специфичности [137].
Транспортные АТР-азы.
Существует пять основных типов транспортных АТР-аз: Р, F, V, А и ABC типы. Все АТР-азы Р-типа входят в состав одного надсемейства, F и V типы вместе образуют второе надсемейство, А тип образует небольшое отдельное семейство, и АТР-азы АВС-типа, возможно, формируют дивергентное надсемейство, хотя степень гомологии их последовательностей невысока, Р-тип АТР-аз не проявляет гомологии с другими белками, как и F и V типы. У А и ABC АТР-аз, напротив, существуют гомологи, не обладающие транспортной функцией [137].
Кроме того, некоторые бактериальные АТР-азы имеют гомологию с митохондриальньши трансгидрогеиазами, которые осуществляют транслокацию протона через мембрану митохондрий. В целом, их N-концевой домен более важен для превращения энергии, закрепления в мембране и/или поддержания структуры, в то время как С-концевой домен более важен для обеспечения специфичности работы этих белков [137].
АТР-азы ABC-типа. Каждый из этих белков имеет интегрированный мембранный «канальный» белок, а также один или два цитоплазматических АТР-связывающих домена, которые гидролизуют АТР для обеспечения всего транспортного комплекса энергией. Такие пермеазы могут экспортировать из бактериальной цитоплазмы во внеклеточную среду белки, пептиды, капсулярные полисахариды, модифицированные олигосахариды и лекарства [55, 131], причем степень гомологии этих белков друг с другом коррелирует с субстратной специфичностью [137].
Эти белки образуют две большие филогенетические группы, в одной из которых АТР-связывающий домен ковалентно связан с мембран-интегрированным доменом (группа А), а в другой этот домен образует отдельную субъединицу (группа В). Бактериальные экспортные пермеазы группы А в основном экспортируют белки и пептиды, в то время как пермеазы группы В экспортируют капсулярные полисахариды, олигосахариды и лекарственные вещества [137]. анализа, Saier [137] выявил несколько семейств таких белков (табл.1).
АТР-азы Р-типа, Исследования показали, что все секвениро ванные АТР-азы, которые в процессе осуществления транспорта формируют фосфорелированные интермедиаты (так называемые АТР-азы Р-типа) образуют одно большое надсемейство, которое подразделяется на четыре семейства. Эти белки осуществляют транспорт катионов, используя для этого энергию гидролиза АТР. Члены одного из семейств этого подсемейства транспортируют Са и описаны в растениях, животных и у низших эукариот. К этому же семейству относятся белки, осуществляющие транспорт Mg2+ у бактерий, В состав другого семейства входят специфические Na+ и К+ или ЇҐ и К+ транспортеры, которые описаны только у высших эукариот. Третья группа АТР-аз Р-типа осуществляет транспорт протонов у грибов и низших эукариот. Некоторые не секвенированные бактериальные АТР-азы, специфичные к Са+, Na+ и Н+, возможно, также относятся к этому семейству.
Члены четвертого семейства АТР-аз Р-типа отличаются по своей субстратной специфичности и направленности транспорта. Эти белки описаны в основном для прокариот. Одним из членов этого семейства является К+-помпа в клетках Е. соїі. Два других члена этого семейства катализируют поглощение и выброс Са2+ в клетках Enterococcus hirae, и четвертый катализирует выброс Cd2+ у Staphylococcus aureus.
Одна из известных эукариотических АТР-аз Р-типа катализирует выброс Си2+ у человека, ее нарушение вызывает болезнь Менкеса. Эта АТР-аза и две других бактериальных АТР-азы, ответственные за выброс меди, обладают сходной структурой, что еще раз свидетельствует в пользу того предположения, что гомология последовательности транспортных белков коррелирует с общностью их субстратной специфичности [137].
АТР-азы А-типа. Эти транспортные белки, кодируемые различными бактериальными плазмидами, обеспечивают устойчивость к арсенату, антимониту и теллуриту. Интересно, что их мембранный домен обнаруживает значительную гомологию с мембранными доменами АТР-аз АВС-типа.
Унипортсры, «импортеры и антипортеры. Многие транспортные белки осуществляют транспорт внутрь или наружу клетки, используя химическую энергию для осуществления такого транспорта. Такие белки разделяют на симпортеры, когда транспорт осуществляется совместно с веществом, транспортируемым по градиенту концентрации (симпорт) и антипортеры, осуществляющие противонаправленный транспорт с веществом, транспортируемым по градиенту (антипорт).
Сайты связывания Lrp. Влияние экзогенных аминокислот
Как видно из представленных консенсусов, крайне сложно сконструировать какой-то универсальный мотив, в котором Lrp связывает ДНК. Мы, в нашей работе, в качестве такого универсального консенсуса использовали образец, представленный в международной базе данных DPI (http://arep.med.harvard.edu/dpinteract).
Было показано, что Lrp может связывать несколько сайтов в регуляторной области регулируемых им генов на расстоянии -10 - -150 нуклеотидов [152]. Для гена lysU было показано связывание Lrp внутри участка в 100 нуклеотидов от -60 до -160 от старта транскрипции, причем наличие всех 100 нуклеотидов было необходимо для осуществления Lrp-зависимой транскрипции [90].
Для оперона dadAX было показано, что связывание Lrp происходит с двумя разными промоторами [183]. При связывании Lrp с одним из промоторов, происходит репрессия оперона. В то же время при связывании Lrp с другим промотором, в присутствии лейцина и аланина (в большей степени), происходит активация оперона. Алании и лейцин уменьшают сродство Lrp к «репрессорному» сайту, практически не влияя на его сродство к «активаторному» сайту [183].
Добавление экзогенного лейцина изменяет действие Lrp на многие гены. Так, существует группа генов, которые Lrp регулирует только в присутствии лейцина. В эту группу входит в частности ген UvJ, который кодирует белок, участвующий в транспорте разветвленных аминокислот внутрь клетки [28]. Другую группу генов Lrp регулирует только в отсутствии лейцина. В нее входит, в частности, ген, кодирующий белок транспорта пептидов, оррА. К третьей группе относятся гены, транскрипцию которых Lrp регулирует как в присутствии, так и в отсутствии лейцина. К таким генам относятся, в частности, ген livK, кодирующий один из белков - импортеров лейцина, gltB и osmY [28]. Кроме того, существует ряд генов, для которых Lrp в присутствии лейцина играет роль активатора, а в его отсутствии - репрессора [32, 108].
Увеличение концентрации лейцина, при фиксированной концентрации Lrp, в случае gltBDF оперона приводит к уменьшению эффективности связывания Lrp с промоторной ДНК, причем этот эффект не наблюдается, если вместо лейцина были добавлены изолейцип, валин или глутамат [54]. Надо отметить, что такая картина наблюдается только при концентрации лейцина меньше 20 тМ. При более высоких концентрациях не происходит дальнейшего ухудшения связывания Lrp с промоторной ДНК при дальнейшем увеличении концентрации лейцина [54] (см. рис.11).
Было показано [165], что связывание Lrp с промотором HvIH оперона происходит в два этапа. При низкой концентрации Lrp происходит высоко кооперативное взаимодействие с двумя сайтами, расположенными более чем в 200 нуклеотидах от начала транскрипции. При дальнейшем увеличении концентрации Lrp образуется вторичный комплекс, в котором Lrp димер связывает четыре дополнительных сайта около старта инициации транскрипции. В этом вторичном комплексе димеры Lrp связывают шесть сайтов, и он и является необходимым для старта транскрипции tfv/tf оперона [165].
При этом связывание Lrp с промотором этого оперона вдвое уменьшается в присутствии лейцина [54]. Более того, промотор оперона gltBDF, относительно мало чувствительный к присутствию экзогенного лейцина, обладает большим сродством к Lrp, чем промотор UvIH, обладающий значительной чувствительностью к лейцину [54]. Основываясь на полученных результатах, авторы предложили модель, согласно которой влияние экзогенного лейцина на действие Lrp зависит от сродства Lrp к промотору того или иного гена - если Lrp связывается с промотором с высокой эффективностью, влияние лейцина на его связывание с таким промотором будет минимальным, а при низкой эффективности взаимодействия Lrp с промотором, экзогенному лейцину гораздо легче уменьшить эффективность такого связывания [107].
Эффективность связывания Lrp с промотором lysU гена также уменьшается в присутствии экзогенного лейцина [90].
В ряде случаев, было показано, что экзогенный аланип обладает действием, аналогичным действию экзогенного лейцина на работу Lrp [32, 107]. Интересно, что в случае сїр гена, транскрипцию которого активирует Lrp, добавление в среду алапина приводит к полному прекращению транскрипции с clp промотора, в то время как добавление лейцина не оказьгоает какого-либо заметного действия на активность этого промотора [45]. Было показано, что в этом случае аланип, подобно лейцину в других ситуациях, уменьшает сродство Lrp к промотору.
Аналогичное действие аланнна было показано и для dad оперона, экспрессию которого подавляет Lrp [101, 183].
Lrp регулирует экспрессию генов, ответственных за биосинтез и деградацию макро-и микромолекул, генов, кодирующих низкомолекулярные транспортеры, а также стрессовые белки. Интересно, что по крайней мере в одном случае, для гена yibJ, было показано, что Lrp репрессирует его только в стационарной фазе роста, во время экспоненциального роста было показано отсутствие эффекта Lrp на транскрипцию этого гена [154].
Наиболее полную картину состава Lrp-регулоиа удалось получить Hungs с соавторами [69] после проведения microarray анализа 1гр+ и Alrp штаммов. Полученные как в результате этих исследований, так и ранее, данные выявили большое количество генов (около 10% генома Е. coli), которые регулируются Lrp. Их общее соотношение представлено в табл.7.
Клонирование генов yfiK, yggA и yahN, кодирующих белки - члены семейства RhtB, и изучение влияния их сверхэкспрессии на устойчивость клеток Escherichia colt к аминокислотам и их аналогам, а также на накопление аминокислот клетками соответствующих штаммов-продуцентов
Проведенный ранее в нашей лаборатории компьютерный анализ показал, что гены Escherichia coli rhtB, rhiC, yJiK, yahN, yeaS и yggA кодируют мембранные белки, входящие в состав семейства RhtB [13]. Белки RhtC, RhtB, YfiK, YahN и YeaS входят в состав подсемейства RhtB, в то время как белок YggA входит в состав подсемейства LysE. По другой классификации подсемейство LysE выделяется в отдельное семейство близкородственных белков [161].
В нашей лаборатории ранее были клонированы гены rhtB [181] и rhtC [8], кодирующие белки, для которых было показано участие в транспорте гомосерина, треонина и некоторых других аминокислот из клеток Е. coli. Эти данные были подтверждены и другими авторами [80],
В период выполнения настоящей работы появились публикации, в которых белки YfiK и YggA были охарактеризованы как транспортеры, осуществляющие выброс из клеток Е. coli соответственно цистеина и О-ацетил-серина [56] и аргинина [105]. Таким образом, литературные данные и данные, полученные ранее в пашей лаборатории, свидетельствовали о том, что в состав семейства RhtB входят мембранные белки, участвующие в экспорте аминокислот из клеток Е, соН.
Известно, что белки, объединенные структурной гомологией, очень часто обладают и сходными функциями [137]. Поэтому мы предположили, что два еще не охарактеризованных белка семейства RhtB, YahN и YeaS, также могут участвовать в экспорте из клеток Е. coli аминокислот и их аналогов.
Одним из свидетельств в пользу того, что мембранный белок участвует в экспорте какого-либо вещества, подавляющего рост клеток, является возникновение устойчивости клеток к этому веществу при сверхэкспрессии соответствующего гена [70, 73, 80, 163]. Поэтому для исследования свойств белков YfiK, YahN, YggA и YeaS мы с помощью PCR клонировали соответствующие гены Е. coli в многокопийпые вектора pUC21 и рОК12, и изучили влияние их сверхэкспрессии на устойчивость клеток штамма Е. coli TGI к различным аминокислотам и их токсичным аналогам (известно, что многие природные аминокислоты при очень высоких концентрациях подавляют рост бактерий на минимальных средах [80, 95,181]). Влияние сверхэкспрессии генах/?ЛГ на устойчивость клеток Е. coli к аминокислотам и их аналогам представлено в табл.9.
Из данных, представленных в табл.9, видно, что при амплификации гена yjiK максимальный уровень устойчивости наблюдался к пролину (в пять раз). Интересно, что, хотя белок, который кодирует ген yfiK, был описан как транспортер цистеипа и О-ацетил-серина [56], мы не наблюдали значительной устойчивости к цистеину при амплификации этого гена (устойчивость повышалась менее чем в два раза). Мы предполагаем поэтому, что основной функцией белка YfiK в клетке, если, как предполагаем и мы, и авторы [56], он участвует в экспорте аминокислот, является скорее участие в экспорте пролииа и, возможно, других аминокислот.
Кроме того, амплификация гена yftK сообщает клеткам Е. coli незначительную устойчивость к гистидину, глутамату, гомосерину, дегидропролину и треонину. Мы также исследовали влияние амплификации гена yfiK на многокопийной плазмиде на накопление аминокислот клетками соответствующих штаммов-продуцентов. Результаты представлены на рис. 13.
Как видно из рис.13, амплификация гена yfiK приводит к увеличению накопления треонина, пролина, глутамата, гистидина и аланина, тогда как накопление изолеицина остается практически на том же уровне, что и у контрольного штамма, а накопление валина заметно снижается. Это может свидетельствовать о том, что белок, который кодирует ген yfiK, хотя и участвует в выбросе нескольких аминокислот, обладает определенной специфичностью и не участвует, например, в экспорте валина и изолеицина, устойчивости к которым мы не наблюдали при его сверхэкспрессии. Кроме того, его влияние на накопление цистеина клетками соответствующего штамма-продуцента было минимальным (данные не представлены). Эти результаты могут свидетельствовать о том, что YfiK, обладая довольно широкой специфичностью, обеспечивает экскрецию определенных аминокислот в зависимости от их внутриклеточных концентраций, что в свою очередь, определяется генетическими характеристиками штамма и условиями его культивирования. Важно подчеркнуть, что определение МИК позволяет получить первые и при этом довольно точные представления о наборе аминокислот, в отношении которых проявляется функция транспортера с множественной специфичностью.
Данные, представленные на рис, 13, согласуются с данными, представленными в табл.9, то есть при амплификации гена yfiK повышается накопление клетками штаммов-продуцентов тех аминокислот, фенотип устойчивости к которым появляется у клеток штамма TG1 при амплификации тенау/іК.
Компьютерный анализ регуляторных областей генов, кодирующих белки семейства RhtB
Мы провели более подробный компьютерный анализ регуляторних областей генов rhlB, гЫС, yeaS и yahN для поиска гипотетических сайтов связывания различных регуляториых белков при помощи программы Genome. В качестве образцов (pattern) для поиска гипотетических сайтов связывания использовались образцы, представленные на сайте DPI образцы, предоставленные Д.А.Родионовым и А.А.Мироновым.
Основываясь на полученных результатах, мы предположили, что экспрессия исследуемых нами генов может регулироваться несколькими регуляторами - Lrp, OmpR, FJs, MarR, AcrR и Crp. Однако гипотетические сайты связывания, которые нам удалось обнаружить в регулятори ых областях генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN, в каждом конкретном случае не вполне соответствовали консенсусным для каждого из регуляторов. Таким образом, данные компьютерного анализа не позволяли сделать вывод о том, регулируется или нет экспрессия исследуемых генов регуляторами, для которых были найдены сайты связывания. Поэтому была поставлена задача экспериментального исследования регуляции генов, кодирующих белки семейства RhtB. Для этого были сконструированы трансляционные слияния генов rhtB, rhtC и yahN с беспромоторным геном lacZ , подобно тому, как это было сделано для гена yeaS (см. Материалы и методы) и на основании активности р-галактозидазы судили об уровне экспрессии этих генов.
Необходимо отметить, что в экспериментах измеряли удельную активность р-галактозидазы, то есть при вычислении активности учитывалась оптическая плотность культуры [103].
Для определения зависимости экспрессии генов, кодирующих белки семейства RhtB, от состава среды культивирования и фазы роста культуры, мы выращивали штаммы TG1, несущие соответствующие вектора (pMLTrB - с трансляционным слиянием генов rhtB и lac??, pMWLTrC - с трансляционным слиянием генов гЫС и lacZ?, pMWLTyS - с трансляционным слиянием генов yeaS и ІасТ и pMWLTyN - с трансляционным слиянием генов yahN и lacZ1 (см. Материалы и методы)), в средах LB и М9, и определяли (І-галактозидазную активность в течение 25 часов. Результаты представлены на рис,21. универсальна. Так, в отличие от остальных трех генов, экспрессия reim yahN наблюдается только в позднем стационаре при культивировании клеток в минимальной среде.
Зависимость уровня экспрессии всех четырех генов от состава среды также не универсальна. Для генов rhtB и rhtC как в бедной, так и в богатой среде эта зависимость остается неизменной, хотя значение активности р-галактозидазы в богатой среде для гена rhtB значительно меньше, чем в бедной. Уровень экспрессии гена rhtC также падает в богатой среде, но не так заметно.
Зависимость уровня экспрессии генов yeaS и yahN от фазы роста меняется при переходе с минимальной на богатую среду культивирования - в случае гена yeaS при культивировании на богатой среде не происходит падения экспрессии в позднем стационаре, а в случае гена yahN на богатой среде экспрессия повышается не в позднем стационаре, а на стадии активного роста клеток, что характерно для всех четырех генов.
Таким образом, полученные результаты можно было трактовать как дополнительное подтверждение того, что существуют регуляторные механизмы, контролирующие экспрессию этих генов.
Из всех проверенных нами генов только ген yahN экспрессировался в позднем стационаре, что характерно для генов, регулируемых с -субъединицей РНК-полимеразы. Однако нам не удалось обнаружить четких консенсусных последователыгостей для связывания этой субъединицы в регуляторной области гена yahN. Мы решили экспериментально проверить влияние инактивации гена rpoS, кодирующего as-субъедишщу РНК-полимеразы, на уровень экспрессии исследуемых генов. Для этого мы воспользовались любезно предоставленным А.С.Мироновым инактивированным аллелем гена rpoS, который при помощи фага Plvir транедуцировали в штамм TG1, и затем полученный TGIArpoS штамм трансформировали соответствующими плазмидами. Результаты представлены на рис.22.
Из полученных данных видно, что аллельное состояния гена rpoS практически не оказывает влияния на уровень экспрессии генов rhtB, rhtC и yeaS. Уровень экспрессии гена yahN в TGI ArpoS штамме снижается в позднем стационаре, но это снижение весьма незначительно и составляет чуть больше двух раз. Так что можно говорить лишь о том, что экспрессия гена yahN незначительно зависит от as-субъединицы РНК-полимеразы.
Это тем более интересно, что ген yahN, единственный из исследованных генов, характеризуется индукцией экспрессии на стадии позднего стационара при культивировании в минимальной среде. Известно, что а5-субъединица РНК-полимеразы является транскрипционным фактором, необходимым для осуществления транскрипции с бблыней части промоторов генов, индуцирующихся в позднем стационаре [68]. Однако было показано, что и глобальный регулятор Lrp также способен регулировать транскрипцию с таких промоторов [154], причем как с ст5-зависимых, так и os-независимых.
В регуляторних областях исследуемых генов нами были обнаружены гипотетические сайты связывания этого глобального регулятора, который активирует или репрессирует транскрипцию около 10% всех генов Е. coli [154]. Мы инактивировали ген lrp, получив таким образом штамм TGlAlrp, и экспериментально проверили влияние инактивации гена Irp на уровень экспрессии генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN. Результаты представлены на рис.23.
Такую же роль он играет и в отношении двух других генов семейства, yahN и гЫС, хотя в этих двух случаях влияние инактивации lrp не столь драматично - уровень экспрессии yahN падает в 5 раз, a rhtC - всего в два раза.
Интересно, что экспрессию гена yeaS Lrp не активирует, а подавляет, причем его влияние весьма значительно - в отсутствии Lrp в клетке уровень экспрессии yeaS заметно увеличивается.
Полученные данные частично согласуются с данными, представленными на рис.21, об изменении уровня экспрессии исследуемых генов на богатой и бедной среде. Известно, что уровень экспрессии гена Lrp падает в богатой среде почти в 10 раз [38]. Для генов rhtB, rhtC и yeaS мы наблюдаем четкую корреляцию между регуляцией Lrp и изменением уровня экспрессии на богатой и бедной среде. Для гена yahN, для которого на бедной среде показана четкая регуляция Lrp, мы не видим заметного падения уровня экспрессии в богатой среде и наоборот, наблюдаем заметное увеличение экспрессии на стадии логарифма и раннего стационара. Это может свидетельствовать о том, что экспрессия гена yahN регулируется еще каким-то регулятором, индуктором, который практически не оказывает действия в бедной среде, но действие которого усиливается в богатой среде.
Надо отметить, что регуляция белком Lrp генов, участвующих в транспорте аминокислот, была описана у нескольких организмов. Так, в клетках Е. coli Lrp в присутствии лейцина репрессирует экспрессию гена UvJ и UvKHMGF оперона, которые кодируют белки, транспортирующие разветвленные аминокислоты внутрь клетки [123]. У С. glutamicum и В. subtilis гомологи Lrp регулируют белки, также участвующие в транспорте разветвленных аминокислот, но не в поглощении их, а в выбросе [14, 19]. Все эти транспортные белки входят в состав семейства LIV-E [19].
Однако белки, входящие в состав семейства RhtB, не гомологичны ни одной из этих транспортных систем. Более того, RhtB и RhtC участвуют в транспорте не разветвленных аминокислот, а треонина, гомосерипа и их аналогов. Таким образом, RhtB - это новое семейство транспортных белков, для которого показана регуляция Lrp. Эти данные расширяют наши представления о функции Lrp как глобального регулятора.
