Введение к работе
Актуальность проблемы. Пуриновые соединения, полученные микробиологическим синтезом, широко используются в фармацевтической и пищевой промышленности. Так, соли пуриновых нуклеотидов инозинмонофосфата (ИМФ) и гуанозинмонофосфата (ГМФ) наряду с глутаматом натрия обладают высокой способностью усиливать вкус и поэтому являются важными компонентами пищевых добавок. Из-за очень высокой способности инозината и гуанозината усиливать вкус пищи добавление этих соединений к глутамату натрия позволяет использовать в четыре раза меньше такой пищевой добавки по сравнению с чистым глутаматом натрия. ИМФ и ГМФ получают как прямой ферментацией, так и путем ферментации до пуриновых нуклеозидов - инозина и гуанозина - с последующим ферментативным фосфорилированием до соответствующих мононуклеотидов (Mori et al, 1997). Кроме того, инозин используют непосредственно для получения различных медицинских препаратов (инозин пранобекс, рибоксин), которые применяют как иммуномодуляторы, кардио- и гепатопротекторы.
Штаммы Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens обладают большим потенциалом для биотехнологического производства инозина и гуанозина (Ishii and Shiio, 1972; Matsui et al, 1977; Zakataeva et al, 2005). Так как производство и потребление пуриновых производных с каждым годом возрастает, дальнейшее повышение продуктивности соответствующих штаммов-продуцентов на основе Bacillus с помощью методов метаболической инженерии является актуальной задачей. Один из подходов к ее решению состоит в усилении экспрессии генов, продукты которых обеспечивают экскрецию пуринов из клеток. Увеличение внутриклеточной концентрации целевого продукта в клетках продуцентов может ингибировать активность ферментов пути его биосинтеза, репрессировать гены и опероны, кодирующие эти ферменты, а также влиять на глобальные регуляторные системы, контролирующие метаболизм клетки. Все это может негативно воздействовать на биосинтез и накопление целевого продукта. Поэтому при создании штаммов-продуцентов большое значение приобретает способность клетки активно выводить синтезируемый продукт в культуральную среду. В связи с этим поиск генов, участвующих в экскреции пуриновых нуклеозидов у бактерий, является очень важной практической задачей.
Пути синтеза пуринов de novo, усвоения и превращения пуринов (salvage путь) у Escherichia coli и В. subtilis достаточно хорошо изучены (Nygaard, 1983; Neuhard and Nygaard, 1987; Zhang et al, 2008). Имеется в литературе и информация о генах, продукты которых осуществляют транспорт пуриновых оснований и нуклеозидов в клетки. Так, у В. subtilis известно несколько транспортеров для усвоения пуринов: NupG -транспортер пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов, обладающий
широкой специфичностью, PbuG - транспортер гуанина и гипоксантина, PbuX - транспортер ксантина и NupC - транспортер аденозина и пиримидиновых нуклеозидов (Christiansen, 1997; Saxild and Nygaard, 1987). Однако о системах вывода (экскреции) пуриновых производных из клетки известно очень мало. Так, к моменту начала настоящего исследования был найден и охарактеризован только один ген, продукт которого осуществляет экскрецию пуриновых нуклеозидов - пері(уісМ) из Е. coli (Gronskiy el al., 2005). Был также описан экспортер пуриновых оснований, в частности, аденина - белок PbuE (YdhL) из Я subtilis (Johansen et al., 2003; Nygaard and Saxild, 2005). Дальнейшее изучение систем выведения пуриновых соединений из клеток бактерий позволит глубже понять метаболизм пуринов и механизмы контроля внутриклеточных пулов этих важнейших для клетки соединений.
Исходя из вышеизложенного следует, что поиск и изучение генов, продукты которых вовлечены в экскрецию пуриновых соединений у бактерий, представляется актуальной задачей не только с практической, но и с научной точки зрения.
Цель и задачи работы. Работа посвящена поиску и изучению генов, участвующих в экскреции пуриновых производных из клеток Bacillus и Е. coli, а также изучению влияния повышенной экспрессии этих генов на продуктивность соответствующих штаммов-продуцентов. В процессе работы решались следующие задачи:
-
провести поиск генов, участвующих в экскреции пуриновых нуклеозидов у Bacillus;
-
клонировать ген pbuE из В. amyloliquefaciens и изучить регуляцию его экспрессии в клетках Е. coli, определить субстратную специфичность экспортера PbuE;
..3. на примере штаммов-продуцентов показать эффект повышенной экспрессии pbuE на продукцию инозина, гуанозина и аминоимидазолкарбоксамид рибонуклеозида (AICAr);
-
изучить возможность функционирования экскреторных белков из грамположительных бактерий в грамотрицательных и наоборот;
-
провести поиск новых генов, которые могут принимать участие в экскреции пуриновых соединений у Е. coli, фенотипически охарактеризовать их и изучить некоторые аспекты их регуляции.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе клонирован и изучен ген pbuE из В. amyloliquefaciens, исследована регуляция его экспрессии под собственными регуляторными элементами в Е. coli. Для его продукта, белка PbuE, ранее охарактеризованного как экспортер пуриновых оснований, в частности, аденина, показана новая функция: экскреция пуриновых нуклеозидов аденозина, инозина и гуанозина, а также AICAr. Установлено, что мембранные белки экскреции PbuE и его гомолог из Е. coli NepI способны функционировать как в
грамположительных, так и грамотрицательных бактериях. Практическая значимость исследования продемонстрирована на примере увеличения продукции пуриновых рибонуклеозидов штаммами-продуцентами В. amyloliquefaciens и Е. coli. Путем создания библиотеки генов на фазмиде Mu d5005 с последующей селекцией вставок по устойчивости к ингибирующим концентрациям инозина и гуанозина осуществлен поиск транспортеров пуриновых производных у Е. coli. Найден ген yidY, продукт которого обладает низкой специфичностью к пуриновым нуклеозидам. Показано, что гены rhtA, leuE (yeaS), ydeD и ygaZH, известные как гены, кодирующие транспортеры экскреции аминокислот, усиливают при повышенной экспрессии экскрецию пуриновых соединений. Показана зависимость экспрессии генов ІеиЕ и ygaZH от метаболизма пуринов, а именно от аллельного состояния генов purR и deoD, а также зависимость экспрессии ІеиЕ от наличия в среде культивирования пуриновых нуклеозидов и аналогов пуринов в качестве индукторов.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 2 печатные работы в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 сообщение в материалах Международной научной конференции (Лиссабон, Португалия, декабрь 2009 г.). Материалы диссертации дважды докладывались автором на конкурсе молодых ученых НИИ Аджиномото-Генетика (июнь 2007 г., июнь 2009 г.), а также были представлены на III Международной конференции по микробиологии окружающей среды, промышленной и прикладной микробиологии BioMicroWorld2009 (Лиссабон, Португалия, декабрь 2009 г.).
Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре НТС НИИ Аджиномото-Генетика и секции «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 20 декабря 2010 года.
Стуктура и объем работы. Диссертация состоит из 7 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на №Р страницах, включая |S/ рисунка и &[ таблиц. Список цитируемой литературы содержит f_Tисточника, в том числе 5_ на русском языке.
