Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1. Синтез пурпновых нуклеотидов у Escherichia coli 8
1.1. Синтез пуриновых нуклеотидов de novo 9
1.2. Взаимопревращения пуриновых нуклеотидов 12
1.3. salvage путь биосинтеза пуриновых нуклеотидов 14
2. Бактериальная цитоплазматичсская мембрана и мембранные белки 16
2.1. Строение и функции цитоплазматической мембраны 16
2.2. Мембранные белки 19
2.2.1. Пространственная структура мембранных белков 19
2.2.2. Функции мембранных белков 21
2.3. Перенос различных веществ через цитоплазматическую мембрану и
транспортные белки 23
2.3.1. Виды транспорта 23 2.3.1.1.Простая и облегченная диффузия 24 2.3.1.2.Первичные активные транспортеры 24 2.3.1.3.Вторичные активные транспортеры 26 2.3.1 АТранспортные системы с транслокацией группы 28
2.3.2. Классификация транспортных белков 29
3. Транспорт предшественников нуклеиновых кислот в клетку Escherichia coli 31
3.1. Транспорт через внешнюю мембрану 31
3.2. Транспорт нуклеозидов через цитоплазматическую мембрану 32
3.2.1. Системы транспорта нуклеозидов в клетку 32
3.2.2. Регуляция транспорта нуклеозидов 34
3.2.3. Источники энергии для транспорта нуклеозидов 37
3.3. Транспорт оснований 37
4. Экскреция различных веществ из клеток бактерий 38
4.1. Системы множественной лекарственной устойчивости -MDR транспортеры у Escherichia coli 38
4.1.1. Классификация MDR транспортеров 40
4.1.2. Системы экспорта антимикробных агентов 42 4.1.3. Регуляция экспрессии MDR транспортеров 46
4.1.3.1. Локальные регуляторы 47
4.1.3.2. Двухкомпонентные регуляторные системы 49 4.1.3.2. Глобальные регуляторы 49
4.2. Экскреция аминокислот из клеток бактерий 53
4.2.1. Экскреция аминокислот у Corynebacterium glutamicum 54
4.2.2. Экскреция аминокислот у Escherichia coli 57
4.3. Экскреция углеводов у Escherichia coli 63
4.4. Экскреция производных пуринов и пиримидинов 66
4.4.1. Экскреция пуриповых производных у Bacillus subtilis 66
4.4.2. Накопление клетками Escherichia coli продуктов деградации нуклеиновых кислот 68
Материалы и методы 71
1. Бактериальные штаммы, фаги, плазмиды, олигонуклеотиды и среды 71
2. Методы работы с ДНК 76
3. Проведение полимеразной цепных реакций (ПЦР) 76
4. Определение точки начала транскрипции 76
5. Трансформация, трансдукция, электротрансформация и интеграция в хромосому Е. coli 77
6. Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) 78
7. Трансформация штамма Bacillus subtilis 168 и трансдукция фагом Е40 78
8. Определение скорости экскреции инозина 80
9. Проведение ферментации в пробирках со штаммами-продуцентами Е. coli 81
10. Проведение ферментации в пробирках со штаммом-продуцентом Bacillus amyloliquefaciens A J1991 81
11. Определение активности р-галактозидазы 82
Результаты и обсуждение 83
1. Поиск и идентификация генов, амплификация которых обеспечивает устойчивость Е. coli к аналогам пуриновых оснований 83
1.1. Идентификация генов ydeD и yij'E, обеспечивающих устойчивость к 8-азааденину 83
1.2. Влияние амплификации генов ydeD, yijE и rhtA на устойчивость клеток Е. coli к 8-азааденину и продукцию инозина соответствующим штаммом- продуцентом 85
1.3. Влияние амплификации генов ydeD, yijE и rhtA на продукцию инозина штаммом-продуцентом Е. coli 86
2. Идентификация гена yicM и компьютерный анализ кодируемого им белка 87
2.1. Поиск генов Е. coli, амплификация которых обеспечивает устойчивость
к инозину и/или гуанозину штамма GS72 87
2.2. Определение сайтов инициации транскрипции и трансляции гена yicM 89
2.3. YicM - мембранный белок, относящийся к MFS транспортерам 91
3. Исследование участия YicM в экскреции пурииовых иуклеозидов из
клеток Е. coli 92
3.1. Влияние инактивации и сверхэкспрессии гена yicM на устойчивость клеток Е. coli к пуриновым нуклеозидам и аналогам 92
3.2. Сверхэкспрессия гена yicM снижает скорость роста Е. coli на минимальных средах, содержащих пуриновые рибонуклеозиды в качестве единственных источников углерода и энергии 96
3.3. Сверхэкспрессия гена yicM приводит к накоплению инозина в культуралыюй среде штаммом Е. coli с инактивированной пурин нуклеозидфосфорилазой 99
3.4. Сверхпродукция YicM снижает индукцию внутреннего промотора deoP3 оперона deoCABD пуриновыми нуклеозидами 100
3.5. Влияние сверхэкспрессии гена yicM на скорость экскреции инозина из клеток Е. coli и зависимость этой экскреции от присутствия протонофора карбонилцианида-т-хлорфенилгидразона (СССР) 102
3.6. Влияние сверхэкспрессии гена yicM на продукцию пурииовых производных штаммами-продуцентами Е. coli 104
3.7. Сверхэкспрессия yicM в клетках Bacillus amyloliquefaciens увеличивает накопление пурииовых иуклеозидов штаммом-продуцентом 106
4. Исследование регуляции экспрессии гена yicM 109
4.1. Влияние состава питательной среды на экспрессию гена yicM 109
4.2. Изучение влияния фазы роста на экспрессию гена yicM 111
4.3. Изучение влияния аллельного состояния гена rpoS на экспрессию гена 112
4.4. Изучение экспрессии гена уісМ в условиях теплового и осмотического шока 113
4.5. Изучение влияния различных веществ на уровень экспрессии гена уісМ 114
Заключение 116
Выводы 119
Список литературы
- Синтез пурпновых нуклеотидов у Escherichia coli
- Строение и функции цитоплазматической мембраны
- Транспорт через внешнюю мембрану
- Системы множественной лекарственной устойчивости -MDR транспортеры у Escherichia coli
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы появилось много работ по изучению транспорта различных веществ из клетки бактерий. Системы экскреции (эффлюкса) сообщают клеткам более высокий уровень устойчивости к различным токсичным веществам, таким как, например, антибиотики, детергенты, красители и др. (Li and Nikaido, 2004.). Также существует несколько работ, в которых охарактеризованы системы экспорта нормальных метаболитов, например, белок LysE отвечает за транспорт лизина из клеток Corynebacterium glutamicum (Vrljic et al, 1996), белок PbuE (YdhL) из Bacillus subtilis, вероятно, способен экскретировать пуриновые основания (Johansen et al, 2003). У Escherichia coli охарактеризовано несколько систем экскреции различных метаболитов: белок YdeA экскретирует сахар арабинозу (Bost et al, 1999), белок YdeD транспортирует различные метаболиты пути биосинтеза цистеина (Dassler et al, 2000), белки RhtA, RhtB и RhtC способны экскретировать аминокислоты треонин и гомосерин (Zakataeva et al, 1999; Livshits et al, 2003). Физиологическая роль этих систем до конца не ясна, однако, они могут иметь большое значение при создании высокоактивных продуцентов различных биологически активных соединений. У эффективных продуцентов концентрация целевого продукта в среде может достигать очень больших значений, при этом увеличивается и концентрация продукта в клетке. В связи с этим, способность клетки экскретировать синтезируемый продукт в культуральную среду имеет большое значение. Увеличение внутриклеточной концентрации конечного продукта биосинтеза способно напрямую ингибировать активность ферментов пути биосинтеза, а также репрессировать гены и опероны, кодирующие эти ферменты. Более того, увеличение внутриклеточного пула целевого продукта может воздействовать на глобальные регуляторные системы, осуществляющие общую перестройку метаболизма клетки под влиянием различных факторов, что может отрицательно сказываться на способности культуры продуцировать целевой продукт. Также повышение концентрации продукта в клетке способно активировать системы его деградации, что является нежелательным при конструировании высокоактивных штаммов-продуцентов. Кроме того, может наблюдаться ингибирование роста клеточной культуры связанное с тем, что сверхпродукция одного метаболита вызывает репрессию оперонов и/или ингибирование ферментов, участвующих в биосинтезе других соединений, необходимых клетке. В связи с вышесказанным, большое значение приобретают системы экскреции, способные снижать внутриклеточную концентрацию продукта сверхсинтеза, что в свою очередь способно увеличить конечный выход целевого продукта. Поиск и изучение генов, кодирующих транспортные системы,
способные экскретировать различные метаболиты из клетки, является важной задачей, имеющей как научное, так и практическое значение. Гены, кодирующие эффлюксные системы, могут быть использованы для увеличения накопления конечного продукта штаммами-продуцентами.
Известно, что при переходе в стационарную фазу роста Escherichia coli накапливает в среде продукты деградации нуклеиновых кислот (Rinas et al, 1995). По-видимому, должны существовать транспортные системы, способные экскретировать нуклеозиды и/или основания из клетки.
Цель и задачи работы. Диссертационная работа посвящена поиску и изучению генов Е. coli, участвующих в транспорте пуриновых производных из клетки, а также изучению возможности применения этих генов для повышения продукции нуклеозидов штаммами-продуцентами.
В процессе работы решались следующие задачи:
• найти и идентифицировать гены, амплификация которых повышает устойчивость штаммов Е. coli к аналогам пуриновых оснований, а также к пуриновым нуклеозидам инозину и гуанозину;
• определить точки начала транскрипции и трансляции обнаруженных генов, а также провести компьютерный анализ белков;
• исследовать влияние сверхэкспрессии и инактивации найденных генов на фенотип клетки, на экскрецию пуриновых производных из клетки и на продукцию пуриновых оснований и нуклеозидов соответствующими штаммами-продуцентами;
• экспериментально исследовать регуляцию обнаруженных генов. Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе
обнаружено, что сверхэкспрессия генов ydeD, yijE, rhtA и уісМ обеспечивает устойчивость штаммов Е. coli к ингибирующим концентрациям аналогов пуриновых оснований. Амплификация генов ydeD, yijE и rhtA улучшает продукцию инозина штаммом-продуцентом.
Сверхэкспрессия гена уісМ обеспечивает устойчивость к пуриновым нуклеозидам чувствительного к этим соединениям штамма Е. coli. Определены точки начала транскрипции и трансляции гена уісМ. Получены различные данные, указывающие на участие белка YicM в экскреции пуриновых нуклеозидов из клетки, а также на зависимость этой экскреции от протон-движущей силы. Показано, что сверхэкспрессия уісМ повышает накопление инозина штаммом-продуцентом. Исследовано влияние
различных условий культивирования, возможных субстратов YicM, а также аллельного состояния гена rpoS на уровень экспрессии yicM.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 137 листах машинописного текста, включая 17 рисунков и 17 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы содержит 232 источника, в том числе 5 на русском языке.
Апробация работы. Материалы исследования по теме диссертации изложены в 6 публикациях: в четырёх патента РФ, статье в зарубежном журнале и тезисах Всероссийской конференции. Материалы диссертации докладывались на Смотрах-конкурсах работ сотрудников ЗАО "АГРИ" в июне 2004 года и июне 2005 года. Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре ЗАО "АГРИ" и Секции Учёного Совета "Генетики" ФГУП ГосНИИГенетика 15 декабря 2005 года.
Синтез пурпновых нуклеотидов у Escherichia coli
Путь биосинтеза инозин 5 -монофосфата (IMP) из фосфорибозилпирофосфата, состоящий из 11 ферментативных реакций, показан на Рисунке 1. Для сборки пуринового кольца IMP требуется две амидные группы от глутамина, аминогруппа аспартата, два атома углерода и аминогруппа глицина, а также три одноуглеродных фрагмента: НСОз" и атомы углерода от двух молекул 10-формилтетрагидрофолата. Одиннадцать генов, участвующих в синтезе IMP организованы в девять оперонов. Четыре гена, purT, purL, purC и ригВ, являются моноцистронными оперонами. Из полицистрониых оперонов только ген purF ассоциирован с генами, не имеющихлтюшения к биосинтезу пуриновых иуклеотидов. Вместе эти гены образуют оперон: cvpApurFdedF. Остальные гены пути биосинтеза IMP образуют следующие опероны: purllD, purMN и ригЕК. Два гена, кодирующие ферменты биосинтеза AMP из IMP, организованы в моноцистронные опероны: ригА и ригВ. Гены, кодирующие ферменты биосинтеза GMP организованы в один оперон: guaBA. Стоит отметить, что ген ригВ кодирует фермент необходимый для девятого этапа биосинтеза IMP, а также для финального этапа синтеза AMP.
Регуляция экспрессии генов биосинтеза пуриновых иуклеотидов зависит от двух факторов: белка-репрессора, кодируемого геном purR, и ДНК операторного сайта для связывания этого репрессора. PurR связывается с полиндромом, состоящим из 16 пар оснований, с консенсусной последовательностью: ACGCAAACGTTTGCGT (Rolfes and Zalkin, 1988). Эта консервативная последовательность, с небольшими вариациями, имеется перед всеми генами пути биосинтеза de novo. Операторный сайт связывания PurR обычно расположен в промоторном регионе между позицией -38 и стартом транскрипции. Гипоксантин и гуанин являются корепрессорами in vivo и улучшают связывание PurR с операторным сайтом in vitro (Rolfes and Zalkin, 1990). Экспрессия всех генов биосинтеза IMP репрессируется белком PurR в 11-17 раз, в то время как белки биосинтеза AMP и GMP репрессируются в 2-5 раз. Для всех генов, кроме ригА и giiaBA, не обнаружено дополнительной регуляции. Такое различие в уровне репрессии может быть объяснено тем, что пурины, образующиеся при деградации РНК или поступающие в клетку из окружающей среды, репрессируют de novo путь биосинтеза IMP, в то время как AMP и GMP могут быть синтезированы при помощи различных реакций взаимопревращений пуринов (см. Рисунок 1).
PurR репрессирует в 2-3 раза экспрессию гена риг А, однако есть данные о дополнительном аденин-зависимом контроле экспрессии этого гена (Не and Zalkin, 1993). Экспрессия оперона giiaBA в пять раз репрессируется PurR (Meng, 1990) и более чем в 15 раз моделируется белком DnaA (Tesfa-Selase and Drabble, 1992). Регуляция экспрессии guaBA оперона белком DnaA требует наличия двух сайтов связывания белка-регулятора. Один сайт расположен примерно в 220 нуклеотидных парах перед стартовым кодоном трансляции guaBA, а второй перекрывается с -10 областью промотора. Репрессия оперона guaBA высоким уровнем белка DnaA может являться частью механизма координации биосинтеза нуклеотидов и репликации ДНК.
Ключевым ферментом пути биосинтеза de novo пуриновых нуклеотидов является глутамип фосфорибозилпирофосфат (PRPP) амидотрансфераза, кодируемая геном purF. Этот фермент катализирует начальную реакцию биосинтеза IMP (см. Рисунок 1) и представляет собой тетрамер идентичных субъединиц (Messenger and Zalkin, 1979). Глутамин PRPP амидотрансфераза Е. coli содержит два домена: состоящий из 264 аминокислотных остатков С-концевой домен для связывания PRPP и для регуляции адениновыми и гунаниновыми нуклеотидами, а также N-концевой глутаминамид трапсферный (GAT) домен из 240 аминокислотных остатков. Одним из важнейших свойств глутамин PRPP амидотрансферазы является то, что этот фермент подвержен ретроингибированию пуриновыми нуклеотидами. AMP и GMP являются наиболее сильными ингибиторами, причем GMP эффективнее, чем AMP ингибирует активность фермента. Ингибирование AMP и GMP является синергетическим. С помощью рентгеноструктурного анализа (Smith et ah, 1994) и сайт направленного мутагенеза (Zhou et ah, 1993) у глутамин PRPP амидотрансферазы Е. coli было выявлено два сайта связывания пуриновых нуклеотидов: аллостерический А-сайт и второй сайт, перекрывающийся с каталитическим С-сайтом. Синергетическое ингибирование является результатом связывания AMP и GMP с двумя сайтами субъединицы гомотетрамера фермента (Zhou et al, 1994). Хотя каждый нуклеотид может связываться с обоими сайтами, для достижения наибольшего эффекта необходимо чтобы GMP связался с А-сайтом, а AMP с С-сайтом. Замены лизина-326 и пролина-410 предотвращают связывание нуклеотидов с А- и С-сайтами и, как следствие, снижают ингибирование активности глутамин PRPP амидотрансферазы продуктами биосинтеза.
Кроме глутамин PRPP амидотрансферазы ретроингибированию подвержены еще два фермента пути биосинтеза AMP и GMP: аденилсукцинат синтетаза и IMP дегидрогеназа. Аденилсукцинат синтетаза, кодируемая геном ригА, катализирует первую из двух реакций биосинтеза AMP из IMP (см. Рисунок 1). Данный фермент является димером, состоящим из идентичных 48 кДа субъедиииц (Poland et al, 1993). Некоторые нуклеотиды, включая AMP, GMP и ppGpp, ингибируют активность аденилсукцинат синтетазы in vitro. Наиболее сильным ингибитором является ppGpp (Kj=50 мкМ). Данный факт может быть объяснен тем, что при аминокислотном голодании, сопровождаемым синтезом ppGpp, может снижаться скорость синтеза AMP, в частности за счет ингибирования аденилсукцинат синтетазы (Stayton et al, 1983; Hou et al, 1999). ppGpp ингибирует аденилсукцинат синтетазу как аллостерический эффектор и/или конкурируя за связывание с GTP (Hou et al, 1999).
IMP дегидрогеназа кодируемая геном guaB, катализирует первую из двух реакций биосинтеза GMP из IMP (см. Рисунок 1). Данный фермент, выделенный из Е. coli (Gilbert el al, 1979), является тетрамером, состоящим из 58 кДа субъединиц. IMP дегидрогеназа ингибируется GMP (Kj=55 мкМ), который конкурирует с IMP (Km=l 1 мкМ). Регуляторная роль данного ингибирования до конца не выяснена. Установлено, что IMP дегидрогеназа активируется моноволентными катионами, такими как К+, Rb+, NH/ и Cs+ (Kerr et al, 2000).
Строение и функции цитоплазматической мембраны
В Е. coli salvage путь биосинтеза выполняет несколько функций. Во-первых, этим путем происходит утилизация экзогенных оснований и нуклеозидов и использование их для синтеза нуклеотидов, во-вторых, реутилизируются эндогенно образующиеся продукты деградации нуклеотидов и, в-третьих, этим путем усваиваются пентозные остатки и аминогруппы экзогенных пуринов, как источники углерода и азота соответственно. Когда свободные основания или нуклеозиды представлены в ростовой среде, то синтез нуклеотидов идет по salvage пути. Одновременно подавляется путь биосинтеза de novo, причем подавление происходит как за счет ретроингибирования активности ферментов биосинтеза, так и за счет репрессии синтеза этих ферментов. Большое количество рибонуклеозид монофосфатов, образующихся в клетке главным образом при деградации мРНК, реутилизируются либо напрямую, либо после их превращения в нуклеозиды или основания (Nygaard, 1983). Эти реакции реутилизирования являются очень эффективными, поскольку в нормальных условиях во внутриклеточном пуле не обнаруживается свободных оснований и нуклеозидов (Burton, 1994).
Утилизация пуриновых оснований. Пуриновые основания усваиваются напрямую при помощи различных фосфорибозилтрансфераз. Превращение аденина в AMP катализирует аденин фосфорибозилтрансфераза, кодируемая геном apt (Hochstadt, 1978; Hershey and Taylor, 1986). Синтез этого фермента индуцируется при добавлении аденина, а его активность ингибируется AMP. Экзогенный аденин способен поддерживать рост пуриновых ауксотрофов, удовлетворяя потребности как в адениновых так и в гуаниновых нуклеотидах. Кт для аденина варьируется в пределах 1.3-20 мкМ (Hochstadt, 1978).
Усвоение гуанина, гипоксантина и ксантина также происходит через их превращение в нуклеотиды. У Е. coli существует две 6-оксопурин фосфорибозилтрансферазы: гипоксантин фосфорибозилтрансфераза и гуанин фосфорибозилтрансфераза, кодируемые генами hpt и gpt соответственно. Оба фермента подвержены ингибированию со стороны ppGpp. Гипоксантин фосфорибозилтрансфераза в основном участвует в утилизации гипоксантина, ее активности в отношении гуанина достаточно для удовлетворения потребности клетки в гуаниновых нуклеотидах, но не для общего синтеза пуриновых нуклеотидов. Гуанин фосфорибозилтрансфераза, напротив, способна утилизировать гуанин, гипоксантип и ксантин и полностыо удовлетворять потребности клетки в пуриновых нуклеотидах. Выделенная из Е. coli гуанин фосфорибозилтрансфераза имеет Кт 2.5, 40 и 170 мкМ для гуанина, ксантина и гипоксантина соответственно (Deo, et al, 1985). Двойные мутанты по генам hpt и gpt не способны метаболизировать гипоксантип или гуанин (Nygaard, 1983). Активность обоих ферментов значительно ингибируется GMP (Deo, et al, 1985).
Утилизация пуриновых нуклеозидов. Аденозин и дезоксиаденозин могут метаболизироваться двумя различными путями (см. Рисунок 1) и являются хорошими источниками пуринов. Главный путь включает в себя дезаминирование до инозина (дезоксиинозина), катализируемое аденозин дезаминазой, и последующее образование гипоксантина, катализируемое пурин нуклеозид фосфорилазой. Прямой фосфоролиз аденозина (дезоксиаденозина) в аденин является минорным путем (Nygaard, 1983).
Гуанозин и дезоксигуанозин быстро деградируют под действием пурин нуклеозид фосфорилазы, только небольшие количества гуанозина избегают фосфоролиза и напрямую конвертируются в GMP гуанозин киназой. Дезоксигуанозин может быть метаболизирован только при помощи фосфоролиза. Оба нуклеозида могут быть использованы как источники пуринов. Пуриновые ауксотрофы с нарушенной системой деградации нуклеозидов, например, ригЕ deoD двойные мутанты, не способны расти на гуанозине, как единственном источнике пуринов. Неспособность таких мутантов расти на гуанозине может быть частично суппрессирована мутациями в гене gsk, ведущим к синтезу гуанозин киназы с пониженной Кт для гуанозина и повышенной термостабильностью (Hove-Jensen and Nygaard, 1989).
Инозин и дезоксиинозин быстро деградируют под действием пурин нуклеозид фосфорилазы, что объясняет, почему оба нуклеозида являются хорошими источниками пуринов. Однако, инозин также может быть напрямую фосфорилирован до IMP гуанозин киназой. Нуждающиеся в пуринах deoD мутанты па инозине растут медленно, но значительно быстрее чем на гуанозине (Nygaard, 1983; Hove-Jensen and Nygaard, 1989).
Ген харА кодирует специфичную ксантозин фосфорилазу (Koszalka et al, 1988; Sceger et al, 1995), которая способна деградировать все пуриновые нуклеозиды кроме аденозина и дезокиаденозииа, Кт варьируется от 44 до 340 мкМ (Koszalka et al, 1988). В нормальных условиях внутриклеточный уровень этого фермента очень низок, так что он не играет значительной роли в утилизации пуринов, и ксантозин не может служить источником пуринов для клеток, выращенных на среде с глюкозой.
Утилизация пуриновых пуклеотидов. Е. coli может использовать экзогенные нуклеотиды как источники пуринов. Поскольку цитоплазматическая мембрана
непроницаема для нуклеотидов, они должны быть дефосфорилированы до соответствующих нуклеозидов периплазматическими ферментами. Четыре периплазматические фосфатазы, способные гидролизовать нуклеотиды, были идентифицированы у Е. coli (Zimmerman, 1992). Мутанты, дефектные по специфическим белкам, образующим поры во внешней мембране {отр мутанты), не способны утилизировать экзогенные нуклеотиды, даже несмотря на нормальный уровень периплазматических фосфотаз (van Alphen etal., 1978). Таким образом, специфичные поры во внешней мембране необходимы для того, чтобы экзогенные нуклеотиды стали доступны для гидролиза периплазматическими фосфатазами.
Пуршювые аналоги. Пуриновые аналоги 2,6-диаминопурин и 6-метиламинопурин, в концентрациях свыше 1 мМ, и 2-фтороаденин, в концентрации 0.1 мМ, являются токсичными вследствие их конверсии в токсичные нуклеотиды аденин фосфорибозилтрансферазой. Мутанты, устойчивые к этим аналогам, оказались дефектными по аденин фосфорибозилтрансферазе {apt). Однако, 2,6-диаминопурин и 6-метиламинопурин могут быть превращены в гуанозин и инозин, соответственно, последовательным действием пурин нуклеозид фосфорилазой и аденин дезаминазой. В низких нетоксичных концентрациях ( 0.1 мМ), эти аналоги поддерживают рост пуриновых ауксотрофов, хотя и с низкой эффективностью (Nygaard, 1984). В клетках дикого типа 6-меркаптопурин также может быть конвертирован в токсичный 6-меркаптопурин рибонуклеозид монофосфат, который ингибирует биосинтез пуринов или может взаимодействовать с PurR белком (Meng and Nygaard, 1990), репрессируя синтез ферментов пути биосинтеза пуринов. Мутации, придающие клеткам устойчивость к 6-меркаптоиурину, локализовались в генах hpt или purR (Levine and Taylor, 1981; Kilstrup et ai, 1989). Таким образом, ингибирование 6-меркаптопурином может быть снято предотвращением его конверсии в токсичный нуклеотид или повышением уровня ферментов биосинтеза пуринов.
Транспорт через внешнюю мембрану
Опыты с антибиотиком шоудомицином показали наличие у Е. coli двух систем транспорта нуклеозидов (Komatsu and Tanaka, 1970; Komatsu, 1971). Ингибирующее действие этого антибиотика снимается добавлением в среду нуклеозидов, за счет конкурирования за связывание с одними и теми же транспортными сайтами. Аденозин и пиримидиновые нуклеозиды являются строгими ингибиторами усвоения шоудомицина, но гуанозин и дезоксигуанозин, а также инозин и дезоксиинозин, почти не снимают ингибироваиие антибиотиком. Из этого следует предположение о существовании двух независимых систем транспорта нуклеозидов. Данное предположение также было подтверждено опытами, в которых измерялось усвоение нуклеозидов шоудомицинрезистентными штаммами. Такие штаммы нормально усваивали гуанозин и инозин, в то время как усвоение других нуклеозидов резко снижалось (Roy-Burman and Visser, 1972). Позднее было показано, что у Е. coli существует третья транспортная система, специфичная в первую очередь для ксантозина ХарВ (Seeger et al, 1995; Norholm and Dandanell, 2001).
Две основные высокоаффинные транспортные системы нуклеозидов обозначают как С-система и G-система, поскольку большая часть результатов по изучению этих систем была получена при использовании в качестве субстратов цитидина и гуанозина. (Munch-Petersen et al, 1979). Соответствующие белки кодируются генами пирС (Craig et al, 1994) и nupG (Westh Hansen et al, 1987). Мембранный транспортный белок NupC (ТС 2.A.41.1.1) состоит из 400 аминокислотных остатков, имеет расчетную молекулярную массу 43.6 кДа и девять трансмембранных сегментов (Craig et al, 1994). Белок NupC является членом семейства "Концентрирующих нуклеозидных транспортеров" (CNT семейство) (Busch and Saier, 2004). Транспортер NupG (ТС 2.А. 1.10.1) состоит 418 аминокислотных остатков, имеет расчетную молекулярную массу 45.3 кДа и двенадцать трансмембранных сегментов (Westh Hansen et al, 1987). Белок NupG является членом семейства "Нуклеозид:Н+ симпортеров" (NHS семейство), которое, в свою очередь, входит в состав MFS суперсемейства (Busch and Saier, 2004). Ген харВ, второй ген оперонахярЛЛ, кодирует мембранный белок ХарВ (ТС 2.А. 1.10.2). Данный белок состоит из 418 аминокислотных остатков, имеет расчетную молекулярную массу 46.1 кДа и 12 трансмембранных сегментов (Seeger et al, 1995; Norholm and Dandanell, 2001). XapB принадлежит к тому же семейству транспортных белков что и NupG (Norholm and Dandanell, 2001; Busch and Saier, 2004).
Основное различие между двумя основными системами транспорта нуклеозидов состоит в том что G-система способна транспортировать гуанозин и инозин, а С-система нет. Основываясь на высоком сродстве С-системы к шоудомицину, были получены мутанты устойчивые к этому антибиотику (Roy-Burman and Visser, 1972). У этих мутантов присутствует только G-система. Несмотря на это, они способны транспортировать все нуклеозиды и усваивать их как единственный источник углерода. Последующая селекция на этих мутантах с использованием аналогов нуклеозидов (5-фтордеоксицитидина и 5-фтордеоксиуридина) приводит к появлению штаммов с нарушенной G-системой. Такие двойные мутанты не способны транспортировать любые нуклеозиды. Также при помощи генноинженерных манипуляций были получены мутанты, у которых функционировала только С-система (Munch-Petersen and Mygind, 1976). Такие мутанты транспортировали все нуклеозиды кроме гуанозина, инозина, дезоксигуанозина и дезоксиинозина, однако они росли на инозине и дезоксиинозине как источниках углерода (в мМ количествах), что указывает на существование низкоаффиной транспортной системы для этих нуклеозидов. Таким образом, G-система транспортирует все нуклеозиды кроме ксантозина, а С-система транспортирует все нуклеозиды кроме гуанозина, инозина и ксантозина.
Специфичность двух основных систем отражается и в взаимном ингибирующем действии различных нуклеозидов на транспорт друг друга различными системами. С-система имеет низкое сродство к гуанозину и инозину и, соответственно, эти нуклеозиды обладают очень маленьким ингибирующим эффектом на транспорт пиримидинов и аденозина в мутантах, содержащих только эту систему. G-система активна в отношении всех нуклеозидов, и было обнаружено взаимное ингибирование между пуриновыми и пиримидиновыми нуклеозидами в штаммах, имеющих только эту систему. Токсичные пиримидииовые аналоги, фтордезоксицитидии и фтордезоксиуридип, сильно ингибируют обе системы, в то время как тетрагидроуридин не оказывает влияния на транспорт нуклеозидов (Munch-Petersen and Mygind, 1983). Основания добавленные в 10-50 кратном избытке не влияют на нуклеозидный транспорт (Mygind and Munch-Petersen, 1975).
Изучение специфичности всех трех систем транспорта нуклеозидов проводилось также в специально сконструированном штамме, в котором не функционировали эти три транспортные системы (пирС nupG харВ мутант). В такой штамм вводились плазмиды, несущие пирС, nupG или харВ ген, и исследовалась способность таких штаммов расти на различных нулеозидах как источниках роста, а также усвоение меченых нуклеозидов (Norholm and Dandanell, 2001). В этих экспериментах было показано, что ХарВ пермеаза способна транспортировать все нуклеозиды, кроме уридипа. Данные, полученные для NupC и NupG транспортеров, совпали с полученными ранее (Munch-Petersen and Mygind, 1983). Однако стоит сделать два замечания. Во-первых, амплификация пирС гена на плазмиде позволяла тройному мутанту по транспортным системам расти на инозине, хотя рост был слабым. По-видимому, NupC способен транспортировать инозин, однако, сродство к инозину слишком мало для поддержания роста клеток дикого типа, в которых экспрессируется только одна копия гена пирС. Во-вторых, обнаружилось, что сверхпродукция NupG приводит к неспособности расти на аденозине, не смотря на то, что аденозин очень эффективно усваивается NupG в опытах с радиоактивно мечеными нуклеозидами. Можно предположить, что при амплификации на плазмиде гена nupG аденозин усваивается слишком эффективно, и что достигаемая при этом, высокая внутриклеточная концентрация аденозина ингибирует рост. Также стоит отметить, что рост на уридине был плохим во всех случаях.
Системы множественной лекарственной устойчивости -MDR транспортеры у Escherichia coli
Устойчивость бактерий к ядам, и особенно множественная лекарственная устойчивость, привлекает повышенное внимание многих исследователей. В дополнение к хорошо известным механизмам, таким как инактивация яда или изменение мишени, активный эффлюкс играет важную роль в устойчивости многих видов бактерий к антибактериальным агентам. Активный транспорт антибиотиков в бактериях был впервые продемонстрирован для тетрациклинов (Levy and McMurry, 1978). Эти специфичные помпы экскретируют только одно вещество или один класс веществ. Напротив, транспортеры множественной лекарственной устойчивости, MDR транспортеры (multydrug resistance - MDR), способны экскретировать широкий спектр веществ. Причем, часто эти вещества относятся к разным классам, имеют различное химическое строение и заряд.
Грамотринательные бактерии более устойчивы к ядам благодаря наличию барьера, образуемого внешней мембраной, и экспрессии широко-специфичных MDR транспортеров. Экспорт антибактериальных агентов может быть организован двумя способами (см. Рисунок 2). Транспорт может осуществляться одиночным белком, осуществляющим перенос через цитоплазматическую мембрану. Также экскреция может осуществляться трехкомпонентной системой, состоящей из транспортера, локализованного во внутренней мембране, белка-порина, образующего канал во внешней мембране, и вспомогательного периплазматического белка, связывающего внешнюю и внутреннюю мембраны (membrane f usion p_rotein - MFP ). Этот комплекс катализирует перенос через обе мембраны грамотрицательных бактерий.
Как правило, для каждого MDR транспортера существует свой уникальный MFP, при чем обычно гены, кодирующие эти белки, организованы в один оперон. В тоже время, основным белком у Е. coli, образующим канал во внешней мембране и являющимся компонентом различных тройных транспортных системы, является белок ТоІС (ТС 1.В. 17.1.1) (Morona et ah, 1983). ТоІС функционирует как тример (Koronakis et ah, 1997). Эта структура образует пору во внешней мембране длинной 140 А и обеспечивает выход различных, больших и малых, субстратов во внешнюю среду. В свободном состоянии ТоІС открыт с внешней стороны, но закрыт со стороны периплазматического пространства. При образовании комплекса с MDR транспортером, внутренний выход открывается, и субстрат переносится из цитоплазмы в окружающую среду (Koronakis et ah, 2004).
В основу классификации MDR транспортных белков положены различия в источнике энергии, используемой для транспорта, в структурных особенностях транспортёров, таких, как размер, количество трансмембранных сегментов, тип связывающих мотивов и др. Все известные на сегодня бактериальные MDR транспортеры являются членами одного из пяти семейств:
Суперсемейство транспортеров с АТР-связывающей кассетой (ЛВС суперсемейство) (ТС З.Л.1). ABC транспортеры используют энергию гидролиза АТФ для транспорта многих веществ: Сахаров, аминокислот, ионов, полисахаридов, белков и различных антимикробных агентов (Higgins, 2001). ABC транспортеры бактерий часто состоят из интегрального мембранного белка, обычно с 6 трансмембранными сегментами, и АТР-связывающей субъединицей, расположенной на внутренней стороне цитоплазматической мембраны (Fath and Kolter, 1993). Эти два белка могут быть нековалентно ассоциированы или ковалентно связаны полипептидной цепью. Комплексная система обычно представляет из себя димер и содержит 12 (6+6) трансмембранных сегментов. Стоит отметить, что эффлюксные системы АВС-типа ГССУ;;- СГГ-:НПАЯ больше характерны для эукариот и не очень широко распространены в бактериях. Однако Е. coli содержит ядо-специфичную помпу этого АВС-типа - МасАВ (Kobayashi et al, 2001).
Major Facilitator Superfamily (MFS) (ТС 2.A.1). MFS это очень старое, большое и разнообразное суперсемейство, включающее в себя более тысячи секвенированных членов. Как правило, они используют энергию протонного потенциала для транспортирования субстрата по механизмам симпорта и антипорта. MFS транспортеры переносят сахара, метаболиты, аминокислоты, пептиды, анионы, различные яды и т.п. (Saier et al, 1999). Транспортеры этого суперсемейства обычно функционируют как одно компонентные системы, однако у грамотрицательных бактерий MFS транспортер может функционировать и в составе тройного транспортного комплекса, совместно с MFP и белком внешней мембраны. MDR транспортеры этого суперсемейства обычно имеют 12 или 14 трансмембранных сегментов и принадлежат к нескольким семействам в составе MFS. Внутри каждого семейства встречаются как субстрат-специфичные, так и MDR транспортеры. Из этого следует, что фундаментальных различий между помпами этих двух типов не существует.
Multi Antimicrobial Extrusion (MATE) Family (ТС 2.A.66.1). Члены MATE семейства имеют мембранную топологию схожую с топологией MFS транспортеров (Brown et al, 1999). Однако анализ аминокислотных последовательностей не обнаруживает гомологии между членами этих двух семейств. Бактериальные транспортеры МАТЕ семейства, как правило, состоят из 450 аминокислотных остатков и имеют 12 трансмембранных сегментов. Члены этого семейства используют электрохимические градиенты, часто градиент Na+, в качестве движущей силы транспортного процесса, организованного по механизму cy6cTpaT:Na+ антипорт. Small Multidrug Resistance (SMR) Family (ТС 2.A.7.1). SMR транспортеры w используют энергию протонного потенциала и функционируют по механизму субстрат:!! " антипорта. Эти белки состоят из 100-120 аминокислотных остатков и содержат четыре трансмембранных сегмента. Возможно они функционируют как тримеры (Chung and Saier, 2001). Хотя транспортеры этого семейства относятся к MDR помпам, их субстратная специфичность ограничена липофильными катионами, включая антисептики и дезинфектанты.
