Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Теоретико-экспериментальные аспекты изучения эпигенных систем 9
1.2. Генные сети 13
1.2.1. Конструирование искусственных генных сетей 15
1.2.2. Организация генной регуляторной сети Е. coli 16
1.2.3. Функционально-генетическая изменчивость генных сетей 21
1.3. Физиолого-генетические механизмы адаптивной изменчивости 24
1.3.1. Системы ответа бактериальных клеток на стресс 26
1.3.2. Системы программируемой клеточной смерти у прокариот 29
1.3.3. Система коллективного выживания у бактерий 33
1.4. Молекулярные механизмы адаптивного мутагенеза прокариот 35
1.4.1. Точковые мутации, как результат адаптивной изменчивости 37
1.4.2. Адаптивные изменения в структурно-функциональной организации хромосом 39
1.4.3. Закрепление результатов адаптивного мутагенеза в эволюции 41
1.4.4. Адаптивные механизмы преодоления межвидовых генетических барьеров 43
ГЛАВА 2. Объект и методы исследования 47
2.1. Объект исследования 47
2.2. Среда и условия роста 47
2.3. Выявление клеток, синтезирующих Р-галактозидазу 47
2.4. Определение относительной концентрации белка GFP в клетках 49
2.5. Выделение и очистка плазмидной ДНК 49
2.6. Трансформация клеток E.coli 50
2.7. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 51
2.8. Лигирование фрагментов ДНК 51
2.9. Расщепление одноцепочечных участков ДНК нуклеазой S1 52
2.8. Электрофорез в агарозном геле 52
2.9. Извлечение ДНК из легкоплавкой агарозы 53
2.10. Статистический анализ 53
2.11. Штаммы E.coli и плазмиды 53
2.12. Ферменты 54
2.13. Реактивы 54
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 55
3.1. Конструирование плазмидных циклических дигенных сетей с отрицательными обратными связями 55
3.2. Изучение функциональной активности циклических дигенных систем путем рассева до единичных колоний 63
3.3. Экспериментальное моделирование дупликаций, изменяющих функциональную активность циклической дигенной системы 78
3.4. Влияние аминокислотного голодания на работу циклической дигенной системы 84
Заключение 89
Выводы 91
Список литературы
- Теоретико-экспериментальные аспекты изучения эпигенных систем
- Организация генной регуляторной сети Е. coli
- Выявление клеток, синтезирующих Р-галактозидазу
- Конструирование плазмидных циклических дигенных сетей с отрицательными обратными связями
Введение к работе
Актуальность проблемы
Изменчивость является одной из фундаментальных характеристик живых систем. В последнее время, кроме наследственной и ненаследственной (модификационной) изменчивости стали выделять эпигенетическую изменчивость, объединяющую явления, основанные на различных механизмах и не укладывающиеся в традиционные представления. Возобновился интерес к, казалось бы, давно забытой проблеме наследования приобретённых признаков (Jablonka, Lamb, 1989; Landman, 1991; Голубовский, 2000; 2001); обсуждаются и необычные филогенетические феномены, такие как стресс-индуцируемая эволюция (Маркель, 2000). Более того, формируется новая ветвь генетики -эпигенетика, изучающая наследственные изменения генной экспрессии, которые происходят без изменения нуклеотидной последовательности ДНК (Riggs, Porter, 1996; Wolffe, Matzke, 1999).
Одним из механизмов эпигенетической изменчивости является наследование признаков, основанное на регуляторных взаимодействиях в циклических генных сетях. Гипотеза о существовании эпигенов - особых наследственных единиц, имеющих не менее двух режимов функционирования подчинённых им генов, способных сохранять каждый из режимов в последовательном ряду поколений, была выдвинута в 1975 году (Чураев, 1975). Существование эпигенов как наследственных единиц следующего уровня сложности, чем гены, было доказано в рамках теоретической математической модели системы управления онтогенезом общего вида (Tchuraev, 2000). Так же было показано наличие бистабильных генетических модулей, имеющих свойства эпигенов (Tchuraev, 2006) в генных сетях, управляющих ранним развитием Drosophila.
Одним из классов эпигенов являются циклические системы генов. Экспериментальное изучение функционирования искусственных циклических дигенных систем с отрицательными обратными связями (ЦДС^) в клетке, позволяет расширить представление об особенностях эпигенетической изменчивости и оценить влияние внешних и внутренних факторов на устойчивость наследования альтернативных фенотипических состояний.
Цель и задачи исследования
Цель работы - изучение функционирования ЦДС^ в клетках Escherichia coli, по фенотипическим изменениям в бактериальных популяциях, подвергшихся действию различных индуцирующих факторов. Конкретные задачи работы включали:
Конструирование ЦДСН, содержащей ген lad под контролем промотора Pl и ген clssi термочувствительного репрессора бактериофага X под контролем промотора Piac.
Экспериментальное тестирование ожидаемых функциональных свойств полученной рекомбинантной плазмиды.
Сравнение свойств ЦЦС9, отличающихся особенностями регуляторных районов или областями репликации плазмид- носителей.
Исследование функционирования ЦДС^ в составе трёхгенной системы.
Исследование устойчивости режимов работы ЦДС^ к стрессовым воздействиям среды.
Научная новизна исследования
Впервые сконструирована особая наследственная единица (эпиген), которая может кодировать, хранить и передавать в ряду клеточных поколений изменения функционального состояния, вызванные внешними
7 специфическими сигналами, без изменения ДНК-последовательностей, входящих в систему генов. Исследовано наследование и переключение фенотипов бактериальных клеток, содержащих ЦДСЯ, в процессе роста колонии на индикаторной среде в постоянных условиях.
Впервые показана зависимость функционирования ЦДС^ от области репликации плазмиды носителя.
Экспериментально смоделировано изменение динамики функционирования генных сетей, при дупликации структурной части одного из генов ЦДС("\
Впервые показано влияние стрессовых факторов на функциональные свойства ЦДС("1
Научно-практическая значимость работы
Результаты исследования способствуют пониманию возможной роли ЦДС^ в эпигенетической изменчивости, как структуры, реагирующей на внешние временные сигнальные воздействия переключением регуляторных режимов функционирования генов. В связи с этим, большое значение приобретает изучение взаимодействия бистабильных модулей клеточной памяти с регуляторными системами клетки. Также ЦДС(-) могут быть использованы для управляемого биосинтеза и контроля клеточного роста в биотехнологии. Принимая во внимание, что такие генетические системы по существу представляют ячейку памяти, способную "запоминать" двоичные сигналы, в дальнейшем возможно использование ЦДСН для создания искусственной генной памяти систем управления онтогенезом клетки, а также в генной терапии - для адресного воздействия и включения компенсаторных генов в нужный момент при лечении наследственных заболеваний.
8 Апробация работы
Результаты исследования были представлены на II (Санкт-Петербург, 2000) и III (Москва, 2004) съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 9 и 10 Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005), международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2005).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объём диссертации
Работа изложена на 109 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 204 источников (47 работ отечественных и 157 работ зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 2 таблицами, 4 схемами, 7 диаграммами и 23 фотографиями.
Благодарности
Считаю своей приятной обязанностью выразить признательность моему научному руководителю д.б.н. проф. Чураеву Р.Н., сотрудникам лаборатории математической и молекулярной генетики м.н.с. Ступак Е.Э., к.б.н. Галимзянову А.В., к.б.н. Галимзяновой Н.Ф., к.б.н. Миграновой И.Г., сотрудникам института Органической химии к.х.н. Астахову С.С, к.х.н. Алябьеву А.С.
Теоретико-экспериментальные аспекты изучения эпигенных систем
Открытие в начале 60-х годов Ф. Жакобом и Ж. Моно принципов регуляции активности прокариотических генов (Моно, Жакоб, 1964) и подразделение генов на структурные и регуляторные позволило предположить, что структурная информация об элементах системы записана в нуклеотидной последовательности, а информация о состоянии системы записана вне генома присутствием или отсутствием определённых регуляторных белков (Ратнер, Чураев, 1971). Иными словами информация может храниться не только структурным способом (в нуклеотидной последовательности молекул ДНК, содержащих все гены генома), но и динамическим, посредством циркуляции регуляторных молекул (Чураев, 1975, Ratner, Tchuraev, 1978).
Наследственная единица, имеющая не менее двух режимов функционирования подчиненных ей генов и способная сохранять, каждый из режимов в последовательном ряду поколений была названа эпигеном (Чураев, 1975). Основной особенностью эпигенов является возможность изменения содержащейся в ней части наследственной информации без изменения первичной структуры нуклеотидных последовательностей. Эпигены отличаются от генов по 3-м кардинальным признакам: способу хранения, кодирования и передачи части наследственной информации. В генах наследуемая информация хранится структурным способом в линейно упорядоченной молекуле ДНК, кодируется 4-х буквенными (A,G,C,T) словами (элементами этой структуры) и передается потомству посредством конвариантной редупликации. Напротив, эпигены хранят содержащуюся в них часть наследуемой информации динамическим способом, посредством циркуляции молекулярных сигналов (репрессоров, активаторов) в циклических генных подсетях; информация в них может кодироваться бинарным кодом (т.е. наличием или отсутствием пороговых доз специфических регуляторных молекул) и передаваться при последовательных клеточных делениях путем распределения регуляторных белков между дочерними клетками (Чураев, 1975).
Согласно неканонической теории наследственности (Tchuraev, 2000; Чураев, 2005) гены, кодирующие информацию структурным способом, являются ячейками структурной, а эпигены - функциональной подпамяти общей наследственной памяти (ОНП). ОНП является устройством, обеспечивающим хранение наследственной информации в некоторых кодах в онтогенезе и при передаче ее от одного поколения к другому.
Молекулярные системы, содержащие эпигены, называются эпигенными системами (Tchuraev, 2000). В работе (Maynard Smith, 1989; Jablonka et al., 1992) системы, которые обеспечивают стабильное наследование функциональных состояний в клеточных линиях, предложено называть эпигенетическими наследственными системами (epigenetic inheritance systems, EIS).
Эпигенные системы могут иметь различные функционально-эквивалентные молекулярно-генетические механизмы (Tchuraev, 2000; Чураев, 2005), в частности динамический, транспозиционный и модификационный, примерами которых служат генетический триггер бактериофага А, (Ратнер, Чураев, 1971), система переключения типов спаривания у Schizosaccharomyces pombe (Dalgaard, Klar, 1999) и метилирование/деметилирование ДНК (Bird, 2002) соответственно. Рассмотрим более подробно каждый из классов.
Динамические механизмы реализуются за счёт циклических связей между генами посредством управления экспрессией, как на уровне транскрипции, так и на посттранскрипционном уровне.
В качестве примера динамического механизма с управлением на транскрипционном уровне рассмотрим эпиген А,-фага, представляющий собой часть системы управления развитием этого фага и состоящий из генов его и сі, считывающихся с промоторов PR И РЯШ, соответственно (Nijkamp et al., 1971; Пташне, 1989). Устойчивость любого из двух состояний -лизогенного и литического - охватывает практически любое число последовательных циклов репликации бактериофага. Так, профаг в геноме лизогенной бактерии при делении передаётся дочерним клеткам с сохранением своего состояния, а в фазе литического роста реплицирующийся геном фага даёт дочерние геномы, тут же вступающие в последующие циклы репликации. Таким образом, геном фага кодирует возможные состояния, а выбор конкретного состояния определяется наличием или отсутствием соответствующего белка-репрессора (Ратнер, Чураев, 1971).
К настоящему времени накоплено достаточно экспериментальных данных о существовании в генных сетях эукариот циклических моногенных систем с положительной обратной связью, которая осуществляется через белки-активаторы транскрипции. Математическое моделирование эукариотических моногенных систем с положительными обратными связями методом обобщенных пороговых моделей показало, что такие системы имеют по крайней мере два устойчивых стационарных состояния активности гена, сохраняющихся, как в течение жизни клетки, так и при последовательных клеточных делениях (Чураев, 1993). Экспериментально выявлены циклические моногенные системы с положительной обратной связью, которые действуют на посттранскрипционном уровне (Голубовский, 1996).
Организация генной регуляторной сети Е. coli
Гены и связи между ними через регуляторные белки образуют регуляторную генную сеть организма. В свете последних данных регуляторная сеть E.coli предстаёт перед нами как система, состоящая из нескольких глобальных каскадов и множества небольших частных регуляторных контуров.
Характерной особенностью организации генных сетей бактерий является их способность к саморегуляции, которая осуществляется с помощью замкнутых регуляторных контуров с отрицательными и положительными обратными связями. Подобные регуляторные контуры способны стабилизировать параметры генной сети на определённом уровне или, напротив, отклонить их от исходного значения. Молекулярной основой таких контуров является наличие регуляторных сайтов в ДНК, РНК и белках, с помощью которых, через ДНК-ДНКовые или ДНК-белковые взаимодействия, осуществляется циркуляция сигналов по генной сети в ответ на воздействия внешних индуцирующих факторов. Благодаря этим двум типам регуляторных контуров возможно поддержание определённого функционального состояния генной сети или её переход в другой режим функционирования, в том числе и под влиянием факторов внешней среды.
У прокариот гены, кодирующие белки одного и того же метаболического пути или определяющие близкородственные функции часто объединены в одном опероне. Под опероном понимается группа генов с общими регуляторными районами, транскрибирующаяся в виде единой полицистронной молекулы РНК (Jacob, Monod; 1961). Преимуществом оперонной организации является быстрота и четкость регуляции экспрессии, а также экономия на размере ДНК и на числе молекул-регуляторов (Brenner, 1997; Blattner et al., 1997). В тоже время, такая структура оперона создаёт затруднения в тонкой регуляции каждого гена, а также увеличивает чувствительность оперона к повреждениям (Жимулёв, 2002). Например, мутации в общем регуляторном районе или ниже старта транскрипции выводят из строя весь оперон или нарушают стехиометрию синтеза белковых продуктов.
Координированную экспрессию бактериальных генов обеспечивают центральные белковые регуляторы, которые по способу функционирования можно разделить на две большие группы: сигма-факторы (а-факторы) и транскрипционные факторы.
Сигма-фактор играет ключевую роль в узнавании промоторов и контроле транскрипции определённых генов. Все исследованные бактерии содержат множественные сигма-факторы. Это обусловлено тем, что для распознавания промотора у бактерий требуется образование активного холофермента (Ее), включающего в себя кор-фермент (Е) РНК-полимеразы, состоящей из субъединиц рр аа, и а-субъединицу (Патрушев, 2000).
У Е. coli в настоящее время известно семь видов о-субъединиц (Хмель, 2005). Основной а-фактор Е. coli с молекулярной массой около 70 Ша, обозначающийся а или RpoD, контролирует синтез большинства генов, экспрессирующихся во время активного роста клеток в экспоненциальной фазе. Альтернативный фактор а участвует в транскрипции генов, экспрессирующихся при переходе клеток в стационарную фазу роста и при воздействии стрессовых факторов. Фактор он инициирует транскрипцию генов, кодирующих белки теплового шока. Примерно половина генов, транскрибируемых с участием oN, связана с метаболизмом и ассимиляцией азота (Buck et al., 2000). oF необходима для транскрипции генов, ответственных за образование жгутиков и хемотаксис. аЕ связана с транскрипцией генов, обеспечивающих целостность клеточной оболочки. стресІ входит в состав холофермента, транскрибирующего гены, ответственные за транспорт цитрата железа (Maeda et al., 2000).
Выявление клеток, синтезирующих Р-галактозидазу
Исследования проводили на клетках E.coli штамма JC158 Hfr РОЇ, thil, serA6, lacI22, relAl (Murphy, Pembroke, 1995), содержащих циклическую дигенную систему с отрицательными обратными связями (ЦДС("0, локализованную на плазмидах pCEPI (Tchuraev, Stupak et al., 2000), pCIA2 или рСІКЗ (Чураев, Ступак и др., 2006) (рис.1).
Клетки культивировали в средах LB и М9 (Миллер, 1976), при 30С или 42С. Среды содержали необходимые для поддержания плазмид антибиотики: ампициллин (Ар) 100 мкг/мл, канамицин (Km) 80 мкг/мл. Для аэрации использовали качалку (160 об/мин). Логарифмическую фазу роста поддерживали периодическими разведениями свежей средой, оптическая плотность культуры составляла 0.02-0.3 ед. при длине волны бООнм. Для индукции экспрессии с Ріас-промотора использовали изопропил-P-D-l-тиогалактопиранозид (ИПТГ) в концентрации 1мМ.
Бактериальные клетки, синтезирующие Р-галактозидазу, выявляли по окраске колоний на чашках Петри со средой LB, содержащей 40 мкг/мл хромогенного субстрата X-Gal (5-бром-4-хлор-5-индолил-Р-0 галактопиранозид). Клетки рассевали до единичных колоний растиранием суспензии бактериальной культуры по поверхности агара шпателем. При гидролизе X-Gal Р-галактозидазой образуется ярко-синий краситель 5-бром 4-хлориндиго, который гистохимически окрашивает клетки в синий цвет (Миллер, 1976).
Схемы генной сети, состоящей из циклической дигеннои системы с отрицательными обратными связями (ЦДС ), локализованной на плазмиде, и маркерного гена lacZ на хромосоме.
Термочувствительный репрессор CI подавляет транскрипцию lad гена с PL промотора и инактивируется температурным воздействием. Lac-penpeccop подавляет транскрипцию сі гена с Р[ас (или Ptrc) промотора и транскрипцию маркерного гена и инактивируется ИПТГ. А. ЦЦС(_) локализованная на плазмиде рСЕРІ. Б. ЦДСН локализованная на плазмиде рСІКЗ и рС1А2.
Клетки бактериальной культуры отмывали от среды и ресуспендировали в буфере следующего состава: 60 мМ Na2HPC 4, 20 мМ NaH2P04, 60 мМ NaCl, рН=7.4. Флуоресценцию измеряли на флуориметре MPF-4 фирмы Hitachi, по длине волны 508 нм при длине волны возбуждающего света 430 нм. Относительная концентрация GFP соответствует показаниям флуориметраЛЭбоо культуры.
Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Харди, 1990). 1. Бактерии выращивали 16 часов в 3 мл среды LB при 37С, 160 об/мин. 2. Далее культуру в объёме 1,5 мл помещали в пробирку Eppendorf, центрифугировали 3 мин при 12 тыс. об/мин, удаляли супернатант. 3. Ресуспендировали осадок в 100 мкл раствора "I" (50 мМ глюкоза, 25 мМ Tris-Cl, рН 8.0, 10 мМ ЭДТА с лизоцимом до 5 мг/мл), встряхивали 5 сек, в течение 30 мин. выдерживали при комнатной температуре. 4. Образец ресуспендировали в 200 мкл раствора "П" (0.2 н NaOH, 1% SDS), перемешивали, выдерживали 5 мин при 0С. 5. К лизату клеток добавляли 150 мкл 5 М формиата калия (24.4 г ацетата калия растворяли в примерно 60 мл дистиллированной воды, добавляли 5 мл 90%-ной муравьиной кислоты и доводили объем до 100 мл), суспензию осторожно смешивали до образования творожистого осадка. 6. Образец центрифугировали 30 мин при 12 тыс. об/мин. 7. Супернатант переносили в пробирку с 500 мкл изопропанола, смешивали, оставляли на ночь при температуре -20С. 8. Образец центрифугировали 30 мин при 12 тыс. об/мин, осадок промывали 1 мл 70% этанола, центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. . Супернатант сливали, а осадок растворяли в 30 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-HCl, рН 7.4; 1 мМ ЭДТА, рН 8.0). Трансформацию проводили по оригинальной методике основанной на предложенных в работах Ханаана (1988) и Perbal (1988). 1. Клетками одной колонии засевали 3 мл LB-среды. Культуру выращивали в течение 14 ч при 37С. 2. 50 мкл культуры переносили в пробирку со свежей средой и выращивали культуру приблизительно 2-3 часа до D6oo=0.6. 3. Клеточную суспензию в объёме 1.5 мл переносили в пробирку Eppendorf, осаждали 30-40 с при 12 тыс. об/мин. 4. Супернатант сливали, а осадок промывали в 1.5 мл буфера ТЕ, осаждали 30-40 с при 12 тыс. об/мин. 5. Надосадочную жидкость сливали, осадок бактериальных клеток подсушили, затем ресуспендировали в 1 мл TFB1 (10 мМ MES, 100 мМ КС1, 10 мМ СаСІ2 2Н20, 50 мМ MgCl2 4H20), клетки оставляли на льду на 30 мин. 6. Охлаждённую суспензию клеток осаждали 30-40 с при 12 тыс. об/мин. 7. Осадок ресуспендировали в 20 мкл TFB2 (10 мМ MOPS, 10 мМ КС1, 75 мМ СаС12 2Н20, глицерин 15%) + 2-3 мкл DMSO, оставляли на льду на 10 мин. 8. Добавляли плазмидную ДНК, растворенную в TFB2, в объеме менее 5 мкл, смесь помещали на лёд на 30 мин. 9. Для теплового шока переносили пробирку в водяную баню при 42С на 1.5 мин, затем смесь помещали в лёд на 5 мин. 10. Охлаждённую суспензию клеток высевали на чашки Петри с селективной средой, инкубировали в течение ночи при 37С.
Конструирование плазмидных циклических дигенных сетей с отрицательными обратными связями
В главе 1 было показано, что гипотеза о существовании эпигенов получила теоретическое подтверждение при исследовании управляющих генных сетей. Другой путь доказательства существования эпигенов — конструктивный, а не дедуктивный или индуктивный (Чураев, 1982), -сконструировать генно-инженерными методами эпигены с наперед заданными управляемыми извне наследуемыми свойствами.
Для экспериментального исследования циклических дигенных сетей с отрицательными обратными связями (ЦДСН) была сконструирована векторная конструкция, содержащая ген ladE.coli под контролем промотора PL фага А, и ген СІ857 термочувствительного репрессора бактериофага X (дальнейшее обозначение сГ) под контролем промотора Piac (Рис. 1 А). Схема конструирования представлена на рис. 2. Фрагмент ДНК с геном ІасІ без собственного промотора, полученный посредством гидролиза рекомбинантной плазмиды pLACI в сайтах рестрикции BamHI и SalGI, лигировали с фрагментом плазмиды рСР2, расщепленной в сайтах BamHI и Aval. Лигазной смесью трансформировали клетки E.coli CSH36. На чашках с LB-агаром, содержащим X-Gal отбирали трансформантов, устойчивых к ампициллину и имеющих фенотип Lac" (белые колонии) при 42С и Lac+ (синие колонии) при 30С. Плазмиду, определяющую такой фенотип, обозначили pCPI. Затем большой фрагмент, полученный гидролизом плазмиды рСРІ в сайтах рестрикции Bgll и Bglll, лигировали с фрагментом плазмиды рЕТ-15Ь, обработанной эндонуклеазами рестрикции Bgll, Bglll. Полученную промежуточную плазмиду обозначили pEPI.
На заключительном этапе плазмиду pEPI последовательно обработали эндонуклеазой рестрикции Ncol и нуклеазой S1 и лигировали с фрагментом ДНК, содержащим ген сі, который был получен PvuII-гидролизом рекомбинантной плазмиды pLACcI. Лигазной смесью трансформировали клетки E.coli CSH36 и на индикаторной среде отбирали колонии трансформантов, устойчивых к ампициллину, имеющих фенотипы: Lac" при 42С, Lac+ при 30С, Lac+ при 42С с ИПТГ. Итоговую плазмидную конструкцию обозначили как pCEPI (Tchuraev, Stupak et al., 2000; Чураев, Ступак и др., 2001).
Согласно моделям циклической дигенной системы (Чураев, 1975; Tchuraev, 1997) можно, применительно ЦДС("\ локализованной на плазмиде pCEPI ожидать два устойчивых эпигенотипа lacfct и lactcf, которые проявляются на чашках с X-Gal по экспрессии маркерного гена lacZ, как альтернативные фенотипы: Lac+ (синяя окраска колоний) и Lac" (белая окраска колоний). Заметим, что эпигенотипом называется перечень генов с указанием их функционального состояния (Чураев, 1975). В данном случае: 1 - ген дерепрессирован, 0 - операторный участок гена связан с репрессором.
Согласно этой же работе эпигенотипы lacfcl1 и lactcf должны устойчиво наследоваться в ходе последовательных делений бактериальных клеток. Переключение одного эпигенотипа в другой осуществляется внешними метаболическими и температурными сигналами. Кроме того, возможны два нестабильных эпигенотипа lacfcf и lacfcf, которые в зависимости от условий переходят либо в эпигенотип lacfcl1, либо lacfcf.
Для проверки наследуемости и переключения, ожидаемых эпигенотипов, нами был поставлен следующий эксперимент. Плазмида была трансформирована в клетки штамма JC158. Далее культуру JC158(pCEPI) выращивали в Змл LB-среды при 30С, с помощью стеклянного шпателя клетки рассевали до единичных колоний на чашки LB и инкубировали 24 часа при 30С. Образовавшиеся колонии перенесли на чашки с ИПТГ и инкубировали при 30С. Выросли синие колонии, имеющие эпигенотип lacfcl. Присутствие в среде ИПТГ приводит к экспрессии lacZ гена и наработке репрессора CI, который подавляет синтез Lac-репрессора. Колонии с фенотипом Lac+ были пересеяны уколом бактериальной петли на свежие чашки согласно схеме, представленной на рис 3. В результате, на чашке 2, инкубировавшейся при 42С, все образовавшиеся колонии были белые, т.е. произошло переключение в эпигенотип lacfcf (Рис. 4А). Переход из lacfcl1 в 1ас1хсР происходит в результате разрушения димеров термочувствительного репрессора CI, что приводит к разблокированию синтеза Lac-репрессора, который подавляет транскрипцию гена lacZ (колонии белые) и гена сі. На чашке 3, инкубировавшейся при 30С, образовались белые колонии, т.е. эпигенотип lactcf устойчиво наследовался (Рис. 4В). При пересеве белых колоний на чашку с ИПТГ (6), инкубировавшуюся при 30С, получили синие колонии, т.е. произошла реверсия к эпигенотипу lacfcf (Рис. 5А). При последующем перекалывании на чашку без ИПТГ также образуются синие колонии, что подтверждает наследование эпигенотипа в течение ряда клеточных поколений после устранения условий, вызвавших переключение (Рис. 5В). На чашке 3 (ИПТГ, 42С) образовались синие колонии. Объясняется это тем, что ИПТГ, инактивируя Lac-penpeccop, снимает репрессию с lacZ и сі гена, а повышенная температура приводит к разрушению нарабатывающегося белка CI, что соответствует эпигенотипу lacfcl1. Этот эпигенотип нестабилен (Чураев, Ступак и др., 2006), и при последующей перепечатке на чашку 7 (без ИПТГ, 42С) образуются белые колонии (эпигенотип lacfcf). Таким образом, экспериментально показано, что ЦДС является элементарным эпигеном, т.е. может кодировать, хранить и передавать клеточному потомству вызванные внешними специфическими сигналами изменения функционального состояния без изменения ДНК-последовательностей, входящих в систему генов.
