Содержание к диссертации
Введение
Часть I* Обзор литературы 7
Глава I. Мутагенез и репарация ДНК 7
I. Общая характеристика 7
2. Мутагенез и репарация ДНК в Е.сопри действии нитрозогуанидина 13
Глава II. Антимутагенез 21
I. Генетический контроль антимутагенеза 22
Часть II 40
Глава I. Материалы и методы 40
I. Бактериальные штаммы 40
2. Характеристика мутантов 41
3. Питательные среды и растворы 43
4. Химические соединения 45
5. Учет выживаемости 45
6. Определение действия с токоферола на частоту индуцированных мутаций в клетках, находящихся в стационарной фазе роста 46
7. Определение антимутагенной активности и -токоферола при индукции мутаций в клетках,находящихся в логарифмической фазе роста 46
8. Эффект ос -токоферола на выживаемость клеток при действии УФ-света и комбинированного воздействия ультрафиолета и нитрозогуанидина 47
9. Влияние ос -токоферола на частоту мутаций,индуцированных УФ-светом и комбинированным воздействием ультрафиолета и нитрозогуанидина... 47
10. Определение антимутагенной активности od-токоферола при индукции мутации у штаммов E.coli, дефектных по ДНК-полимеразе I и III 48
II. Определение зависимости частоты мутаций от времени инкубирования при повышенной температуре... 48
12. Изучение кинетики выхода мутаций в зависимости от времени инкубации клеток в присутствии od-токофе рола после воздействия мутагеном. 48
13. Определение антимутагенной активности OL -токоферола в клетках Salmonella 49
14. Учет результатов 50
Глава II. Экспериментальные результаты и обсуждение 51
I. Влияние генотипа линий на выживаемость клеток E.coli при действии нитрозогуанидина 51
2. Влияние генотипа линий на эффективность мутационного процесса в клетках E.coli при действии нитрозогуанидина 52
3. Зависимость антимутагенного действия ос -токоферола от фазы клеточного роста 59
4. Роль индуцибельных rec/, lexA*-зависимых функций в антимутагенном эффекте оС -токоферола 60
5. Совместное воздействие УФ-облучения и нитрозогуанидина с ос -токоферолом и без него 63
6. Роль ДНК-полимераз клеток E.coli в антимутагенномдействии ос -токоферола 69
7. Антимутагенный эффект ос -токоферола в клеткахSalmonella typhimurium 75
Заключение 80
Выводы .83
Литература 85
- Мутагенез и репарация ДНК в Е.сопри действии нитрозогуанидина
- Бактериальные штаммы
- Влияние генотипа линий на выживаемость клеток E.coli при действии нитрозогуанидина
Введение к работе
Проблемы, связанные с охраной окружающей среды и, в частности, охраной генофонда различных видов, в тон числе и человека, приобрели в последнее время глобальное значение. Это и понятно, поскольку в результате деятельности человека в среду его обитания введены и постоянно вводятся многие тысячи химических соединений, которые являются мутагенами, либо потенциальными мутагенами.
Впервые с мутагенными факторами и проблемой оценки их действия на организм человечество столкнулось при изучении ионизирующего излучения. Хотя основные принципы биологического и генетического действия радиации поняты достаточно давно (Ли, 1963; Корогодин, 1966 ; Тимофеев-Ресовский и др., 1968 ; Лучник, 1968 ; Дубинин, Тарасов, 1969), его количественная оценка и проблема защиты от действия радиации наследственных структур клетки до конца не разработаны и сегодня (Померанцева, 1982). В случае химических мутагенов сложность проблемы многократно возрастает в связи с тем, что мы имеем дело не с одним, а с тысячами химических соединений, отличающихся по механизму своего действия на ДНК хромосомы клеток. В этих условиях исследования механизмов мутагенеза и антимутагенеза в отношении конкретного мутагенного фактора, являются бесперспективными. Единственно разумным путем может оказаться выделение определенных типов первичных повреждений ДНК, индуцированных мутагенами,которые ведут себя одинаково в процессах репарации и возникновения мутаций (Тарасов,1982). Действительно, в настоящее время показано, что процессы репарации и мутагенеза протекают качественно идентично в отношении широких групп первичных повреждений. Более того, мутации возникают не непосредственно в результате взаимодействия квантов излучения, либо молекул химических мутагенов с ДНК, а в ходе последующих процессов репарации или репликации ДНК. Как правило, при протекании этих процессов даже в случае наличия повреждений в ДНК восстанавливается ее нативная исходная структура. Мутации возникают вследствие ошибок при протекании репликации и репарации. Причем, процессы репарации (это относится к эксцизионной,так и особенно к пострепликативной репарации) имеют несколько относительно независимых путей, для осуществления которых требуются разные ферменты. Лишь некоторые из этих путей связаны с индукцией мутаций, другие протекают точно без ошибок, и при их протекании мутации не возникают. Последнее обстоятельство открывает принципиальную возможность стимуляции процессов безошибочной, точной репарации и, напротив, подавление звеньев клеточного метаболизма, принимающих участие в формировании мутаций при действии мутагенов, имеющих различную природу. Конечно, реализация такого подхода требует более углубленных знаний, чем мы имели до сих пор о механизмах мутационного процесса и репарации и сопоставления данных такого рода с результатами, полученными при исследовании механизмов действия конкретных веществ, обладающих антимутагенной активностью. Хотя проблема антимутагенеза возникла достаточно давно (Uovick, Szilard, 1952), реализация этого подхода началась сравнительно недавно (Clarke, Shankel, 1975). В настоящее время известны многие соединения, обладающие способностью эффективно снижать как индуцированный, так и спонтанный мутагенез. Эти вещества относятся к различным классам химических соединений,таких как некоторые аминокислоты (Clarke, Shankel ,1975), ингибиторы свободно радикальных процессов (Алекперов и др.,1975),вещества,интеркалирующие в структуру ДНК (Кларк, 1972), фармокологические средства (Гончарова, Турбин,
1965 ; 1967) и другие. К их числу можно отнести и некоторые витамины, например С и Е (shanberger,, Rudolph,1966 ; Slaga, Bracken, 1977), Последние являются наиболее перспективными в связи с возможностью их практического использования в качестве профилактических агентов для лиц, профессионально контактирующих с различными вредностями (Алекперов и др., 1977 ; Абуталыбов и др.,1978). Несмотря на сравнительно большое число публикаций по выявлению антимутагенов, механизм их действия остается практически не изученным.
Данная работа посвящена анализу антимутагенного эффекта оС -токоферола (витамина Е) в клетках Е.соїі для которых наиболее полно и детально изучен генетический и энзиматический контроль мутационного процесса. В качестве мутагена были использованы ни-тро зо метил мочевина (НММ) и наметил- н'-^нитро- N * -нитрозогуанидин (НГ), являющиеся типичными представителями алнилирующих мутагенов. Указанные соединения индуцируют в ДНК широкий спектр первичных повреждений, часть которых вызывают мутации вследствие ошибок репарации, тогда как другие - в ходе ошибок репликации. Кроме того, для НГ в большей, а для НММ в меньшей степени характерно избирательное повреждение ДНК в видке репликации хромосом наряду с прямым алкилированием покоящейся ДНК.
Основная цель данной работы заключалась в выяснении генетического и в определенной степени энзиматического контроля антимутагенного действия оС -токоферола при индукции мутаций в клетках Е.соїі. При этом ставились следующие основные задачи:
1) Изучить генетический контроль антимутагенного действия ос -токоферола, в частности, участие в этом контроле гесА+,1ехА+ зависимых функций клеток ;
2) Проанализировать зависимость антимутагенного эффекта <*- токоферола от фазы роста клеток Е.соїі (стационарная,логарифми-
7 ческая), влияющая на соотношение эффективности прямого алкилиро-вания и избирательного мутирования в вилке репликации хромосом;
Изучить роль различных типов ДНК - полимераз в антимутагенном действии ос -токоферола ;
Изучить возможности использования индикаторных штаммов Salmonella typhimurium для анализа эффектов различных антимутагенов.
Часть I. Обзор литературы Глава I. Мутагенез и репарация ДНК
I. Общая характеристика
В последние 20-25 лет представления о механизмах мутационного процесса претерпели существенные изменения. Оказалось, что между элементарными актами взаимодействия квантов излучения,либо молекул химических мутагенов с ДБК хромосом и биологическим ответом на это взаимодействие, не существует однозначной связи. Это обстоятельство заставило пересмотрть принципы теории мишени,господствовавшие в 30-50-е годы в радиобиологии вообще и радиационной генетике в частности. В основе формирования новых представлений о механизмах мутационного процесса лежит открытие процесса так называемого пострадиационного восстановления. Во второй половине 50-х годов рядом зарубежных (Swaneon, 1955 ; Кимбол, 1963) и отечественных (Корогодин, 1958 ; Лучник, 1959) авторов было показано, что возникающие при действии радиации повреждения имеют потенциально мутагенный, либо летальный характер. Уже после действия радиации в клетках протекает ферментативный процесс пострадиационного восстановления, в результате чего происходит восстановление исходной, нативной структуры ДНК хромосомы. Лишь часть повреждений реализуется в мутации. Вероятность перехода потенциально мутагенных повреждений в фиксированные мутации зависит, в основном, от эффективности работы систем, контролирующих протека- ниє процессов пострадиационного восстановления. Представление о потенциальном характере повреждений ДОС, индуцированных мутагенами, и существовании в клетках процесса пострадиационного восстановления сложилось, как мы уже отмечали, в конце 50-х -начале 60-х годов. Эти феноменологические представления получили молекулярную основу после открытия процесса репарации ДНК (Setlow, Carrier, 1964; Воусе, Howard-Flanders, 1964 a,b ). Оказалось, что в процессе темновой репарации, которая в отличие от фотореактивации эффективно протекает в темноте, происходит восстановление ДОК хромосом в случае воздействия не только радиации и ультрафиолета, но и широкого класса химических мутагенов. Более того, сейчас уже очевидно, что системы клетки, осуществляющие репарацию, принимают участие в таких фундаментальных процессах как репликация, рекомбинация ДНК и, возможно, перемещение мобильных элементов генома и т.д.
В настоящее время принято делить темновую репарацию на два процесса: эксцизионную и пострепликативную (толерантную) репарации. В ходе эксцизионной репарации из ДНК удаляются повреждения и возникающая при этом брешь застраивается с использованием комплементарной нити в качестве матрицы. В результате восстанавливается исходная структура ДНК. В случае пострепликативной, или толерантной, репарации субстратом являются не сами повреждения, а бреши, возникающие напротив повреждений во вновь синтезированных нитях ДНК. Как эксцизионная, так и особенно пострепликатив-ная репарация являются сложными многоэтапными процессами, включающими в себя несколько относительно независимых путей (Howard-Flandera,I968 , Howard-Flanders et al.,I968).
Известно, что эксцизионная репарация включает в себя так называемые пути репарации "короткими" и "длинными" участками ( Cooper, Hanawalt, 1972 а, Ъ). Первый является относительно простым процессом, катализируемым, в основном, в клетках Е.соїпо- лимеразой I. Этот фермент обладает, наряду с полимеразной,двумя экзонуклеазными активностями, одна из которых связана с репарационной функцией полимеразы, а другая с трансляцией надреза ("ника") в ходе репликации ДНК. В ходе протекания эксцизионной репарации "длинными" участками оперирует больше ферментов, а именно полимераза III, одна из свободных экзонуклеаз е. coli, экзонуклеаза У, кодируемая генами гесВ-*и гесС+ , продукт гена uvrD+, а также регуляторный белок гена 1ехА+ (Masker et al», 1973 ; Goldmark, Linn,I970, 1972 ; Kara et al.,I973 ; Mackay et al., 1974; Youngs, SmithI973). Этот тип репарации начинается с зндонуклеалитического надрезания нитей ДНК вблизи повреждения и стабилизации этого возникающего надреза. В случае пиримидиновых димеров и некоторых других первичных повреждений ДНК эти этапы катализируются комплексом белков, кодируемым генами uvrA+, uvrB+ и uvrC+.B случае других типов первичных повреждений, возникающих в ДНК, например при действии алкилирующих соединений, эти функции берут на себя другие энлонуклеазы, кодируемые, в частности, локусом xthA. Не всегда первый этап эксцизионной репарации является одноактным процессом, как мы рассматривали выше.В некоторых случаях первый шаг осуществляется ДНК-гликозилазами, которые гидролизуют И -7-гликозидную связь поврежденного азотистого основания в структуре молекулы ДБК. В результате возникают апури-новые или апиримидиновые сайты. Лишь на втором этапе при действии эндонуклеазы, специфичной в отношении этих типов повреждений, возникает эксцизионный надрез в нити ДНК (Lindahl, 1974 ; Туе, Jehman, 1977).
Показано, что генетический контроль пострепликативной репарации еще более сложен. В настоящее время можно видеть, по крайней мере, шесть независимых путей пострепликативной репарации (Тарасов,1982). Кроме того, что протекание каждого из этих путей контролируется специфическими генами, все эти пути зависят от функции гена гесА+ (Rupp, Howard-Plander, 1968; Smith, Meun, 1970 ; Sedgwick, 1975 a, b ), а также от функции гена гесР+,либо uvrA+. По крайней мере, в мутанте гесА и двойных мутантах uvrA гесР пострепликативная репарация практически полностью подавлена (Rothman, Clark,1977 a, b).
Наряду с описанными выше процессами репарации, существуют и другие типы репарационного процесса, например коррекция молекулярных гетерозигот (Кушев, 1971) и репарация межнитевых сшивок ДНК, при протекании которой необходимо участие как элементов экс-цизионной, так и пострепликативной репарации ( Bauts et al.,
1968; Lacks, 1966 a, bj Ephrussi-Taylor et al., 1965; Ephrussi-Taylor, 1966, Gray, Ephrussi-Taylor, 1967).
Весьма существенным оказалось обнаружение индуцибельного процесса репарации. Показано, что одни процессы являются конститутивными, тогда как другие в норме репрессированы в клетке, и их выражение происходит лишь в определенных, так называемых условиях. Такие условия возникают в клетке при определенном нарушении процесса репликации ДНК, в частности при действии некоторых мутагенов Aitkin, 1974; Radman,I975 а, Ъ; Bridges, 1972). Эти индуцибельные функции клеток E.coli находятся под совместным контролем генов гесА* и lexAt Продукт последнего представляет собой репрессор своего собственного синтеза (fritkin, 1976), белка Re сА (Clark, 1973), продукта гена uvrA+ (Bridges, Sedgwick, 1975) и некоторых других белков ( Sinden, Cole, 1978). В sos -условиях происходит активация белка RecA, в результате чего он оказывается способным расщеплять некоторые.репрессоры, в том числе белок LexA . В результате это: приводит, во-первых, к экстравыражению гена гесА+и, во-вторых, к активации других индуцибельных оперонов, репрессоры которых чувствительны к про- теолитическому действию ЕесА белка ( Gudas, Pardee, 1976 ; Mount et al., 1976). Например, таким репрессором яв ляется репрессор фага Л ( Roberts, Roberts, 1975).
В настоящее время обнаружен, по крайней мере, еще один тип индуцибельной репарации в клетках E.coli.Оказалось, что обработка клеток некоторыми химическими соединениями, в частности алки-лирующими мутагенами, в низких концентрациях приводит к временному увеличению резистентности и снижению мутабильности при последующей обработке мутагенами из этой же группы в более высоких концентрациях ( Samson, Cairns,1977 ; Jeggo et al., 1977). Для индукции этой системы репарации, являющейся антимутагенной, а не мутагенной, как sos-репарация, требуется синтез белка de novo ( Jeggo et al,, 1978). Показано, что при протекании указанного типа репарации из ДНК удаляется, в основном, 0 -метилгуанин в результате работы фермента, названного метилтрансферазой (Olsson, Idndahl, 1980).
В настоящее время принято считать, что мутации возникают как ошибки при протекании двух процессов: репарации и репликации ^76) ( Drake, Baltz Возникновение мутации в ходе репарации характерно для сравнительно "грубых" повреждений, возникающих в ДНК, например, при действии УФ и некоторых химических соединений: митомицина С, 4-нитрохинолин-оксида и др. ( Ishii, Kondo, 1975). Для других типов первичных изменений, которые являются менее "грубыми", мутации возникают в ходе репликации. В случае алки-лирующих агентов мы имеем дело со смешанным мутагенезом ( Walker, 1977; Jeggo et al., 1977). К их числу относится, в частности, и нитрозогуанидин (НГ). При действии НГ в ДБК возникает целый спектр первичных повреждений, часть которых может вызывать мутации вследствие ошибок ре-
12 парации, тогда как другие - в ходе ошибок репликации. Кроме того, при его действии мутации возникают при протекании двух процессов. Во-первых, при прямом алкилировании покоящейся ДНК и, во-вторых, в результате поражения ДНК в вилках репликации хромосом (siccardi et al., 1976; Dawes et al.,I977). Эффективность мутагенеза как в случае ошибок репарации, так и в случае ошибок репликации определяется точностью работы ДНК-полимераз при протекании,соответственно, репарационного и репликационного синтеза ДНК (Тарасов, 1982). Как мы уже отмечали, с ДНК-полимеразами клеток E.coli ассо-цированы две экзонуклеазные активности. Одна из них, З'-б' экзо-нуклеазная активность,выполняет корректорские функции при протекании репликации ДНК. В том случае, если в процессе репликации ошибочно возникает некомплементарная пара оснований, 3»-5* энзонук-леаза, ассоцированная с ДНК-полимеразой Ш, удаляет это ошибочное основание, и акт полимеризации повторяется снова.При наличии в ДНК "слабых** сублетальных повреждений типа модифицированных оснований ошибки при протекании синтеза ДНК-полимеразой пропускаются чаще, и мы имеем индуцированный мутагенез, связанны с ошибками репликации. В случае индукции в ДНК более "грубых" повреждений, таких, например, как пиримидиновые димеры или мутационные моно-аддукты, синтез ДНК напротив этих повреждений не протекает вообще, и в результате во вновь синтезированных нитях ДНК возникают бреши, размер которых определяется расстоянием от места повреждения до новой точки инициации репликации.
Однако, в sos-условиях ослабевают требования к матрице, на которой происходит синтез ДНК. В этих условиях возможна неспецифическая застройка ДНК напротив повреждения, приводящая к возникновению мутаций. Это определяется тем, что в этих условиях либо подавляется активность коррекционной экзонуклеазы, работающей конститутивно в клетках E.coli, либо происходит индукция новой полимеразы, у которой эта активность отсутствует, либо резко сни- ІЗ жена. Претендентом на эту индуцибельную полимеразу, по-видимому, является полимераза II клеток E.coli (Kenyon, Walker, 1980).
Таким образом, репарация ДНК является многоэтапным процессом, протекающим по нескольким независимым путям. Некоторые из этих путей не связаны с возникновением мутаций, тогда как в ходе других мутации эффективно формируются. Это создает принципиальную возможность осуществить антимутагенез либо путем активации немутагенных путей, либо подавлением путей, связанных с возникновением мутаций.
2. Мутагенез и репарация ДНК в клетках Е.соїіпри действии нитрозогуанидина (В» -метил-и" -нитро- Я* -нитрозо-гуанидин)
Специфика мутационного процесса и репарации в значительной степени определяется спектром повреждений, индуцированных конкретным мутагеном в ДНК хромосомы. В настоящее время известно, что ультрафиолет индуцирует различные типы повреждений в ДНК, такие как гидраты цитозина, пиримидиновые аддукты, в небольшом количестве сшивки ДНК-белок, ДНК-ДНК, а также разрывы, однако основной его эффект связан с пиримидиновыми димерами циклобута-нового типа (Setlow, Setlow, 1962 ; Setlow, 1966, 1968 ; Steward, Humphrey, 1966). В случае ультрафиолета можно идентифицировать основной продукт, ответственный за биологический ответ на облучение. Такими же свойствами обладают и некоторые химические мутагены, например 4-нитрохинолин-оксид, индуцирующий четыре типа повреждений типа моноаддуктов: хинолин с гуанином - два типа, хинолин с аденином и наконец 4-аминохинолин-1-оксид (АХО), являющийся, по-видимому, продуктом распада нестабильной фракции аддуктов хинолина с гуанином (Ikenoga et. al., 1975). Специфическая индукция аддуктов характерна также и для двух других типов мутагенов: и -ацетокси- к -ацетил-1-аминофлуорен ( В -ацетокси-ААФ) и 7-бромометилбенз(а)антрацен (БМБА)(Yamasaki et al. ,1977; Dipple et al. , 1971). Индуктором повреждений определенного типа в ДНК является хорошо известный в практике онкологии блеомицин. Для него характерно преимущественное возникновение в ДНК апиримидиновых сайтов и, в меньшей степени, разрывов в ДПС ( Povirk et al., ,1978). К числу мутагенов, специфически повреждающих молекулу ДНК, относится сенсибилизированный светом псорален ( Johnson et al. , 1977), фотоалкирующие агенты ( Leonov et al. ,1973), ацетофенон и его производные (bamola, 1969) и др.
Однако, для большинства изученных к настоящему времени мутагенов характерным является индукция в ДНК широкого спектра повреждений, когда продукт, вносящий основной вклад в биологические эффекты мутагенов, не идентифицирован, либо такового не существует вообще. К последним относятся алкилирующие мутагены и, в частности, И*-метил- Е^'-нитро- Н'-нитрозогуанидин (НГ). НГ был синтезирован в 1947 г. ( McKay, Y/right ,1947) и имеет следующую структурную формулу:
Известно, что НГ осуществляет алкилирование ДНК как в системе in vivo , так и в системе in vitro (Lawley, 1966 ; Singer, 1975, 1979 ; Roberts , 1978 ; и др.). Результаты по соотношению и типам возникающих при действии НГ повреждений в ДНК несколько различаются (Lawley, Orr, 1970; Strauss, 1979; Lawley, Thatcher, 1970; Bowden, Boutwell, 1974; Altamirano-Dimae, 1979 однако суммарно спектр возникающих повреждений можно представить следующим образом: 85% всех индуцированных НГ повреждений ДНК составляют метилированные основания: 7-метилгуанин - 73%, 3-метиладенин - 13%,
О -метилгуанин - 8?б, 3-метилгуанин - 2,296, 3-метилцитозин - 2,2%, 1-метиладенин - 1,1%. Кроме того, НГ индуцирует фосфотриэфиры и с низкой эффективностью межнитевые сшивки и разрывы ДНК (Тарасов, 1982). Из этих данных можно видеть, что при действии НГ большая часть повреждений представлена метилированными основаниями,в основном гуанина, в меньшей степени поражается аденин, и практически остаются интактными пиримидины. Некоторые из повреждений, возникающих от НГ, также как и 7-метилгуанин и 3-метиладенин, являются нестабильными и спонтанно распадаются, в результате чего возникают апуриновые сайты. Известно, что обработка НГ приводит к возникновению брешей во вновь синтезированных нитях ДНК (Degre-Couve, Mamet-Bratley, 1973; Матеt-Bratley, 1974). В связи с этим при действии НГ протекает как эксцизионная репарация, так и пострепликативная репарация. В случае эксцизионной репарации первый этап процесса, а именно опознавание и надрезание нити ДНК вблизи повреждения, определяет специфическая эндо-нуклеаза. В клетках E.coli такой эндонуклеазой является эндо-нуклеала II ( Kirtikar, Goldthwait, 1974).
В настоящее время известно, что в некоторых случаях эксцизионная репарация может протекать в два этапа. На первом этапе происходит удаление поврежденного азотистого основания. Это удаление катализируется специальным ферментом ДНК к-гликозилазой ( Idndahl, 1974). В результате возникает апуриновый или апиримиди-новый сайт, который опознается, и около него происходит разрезание в результате работы другой эндонуклеазы, специфической для повреждений именно этого типа. Эндонуклеазы такого рода обнаружены в клетках многих организмов растений ( Verly et al., 1973),млекопитающих ( Verly, Paquette,I973 ; Bose et al. ,1978) и микроорганизмов ( Yajko, Weiss, 1975 ; Clements et al., 1978). В клетках E.coli эту функцию выполняет эндонуклеаза УІ (Kirtikar et al., 1976,1977]
В 1979 г. найдена гликозилаза, удаляющая к -7-метил-гуанин из ДНК клеток E.coli (Chetsanga, Idndahl, 1979).Однако, эти данные получены в системе in vitro , и остается неясным, протекает ли этот процесс в системе in vivo .Значительно более ясная ситуация существует в отношении 3-метиладенина. Показано, что как в клетках прокариотов, так и эукариотов обнаруживается гликозилазная активность, удаляющая это повреждение из ДНК хромосомы. В случае E.coli структурным геном этой гликозилазы является ген tag+ (Каггап, 1980). Удаление 0 -метилгуанина связано с индуцибельной немутагенной репарацией, названной адаптивным ответом. Оказалось,что обработка клеток Е.соїзНГ в низкой концентрации приводит к возрастанию резистентности и уменьшению эффективности мутагенеза в отношении последующего воздействия НГ или другими алкилирующими агентами в значительно больших концентрациях (Samson, Cairns, 1977 ; jeggo et al.I977). Такая адаптация клеток после действия мутагена низкими концентрациями сохраняется в клетках в течение четырех часов и не происходит в том случае, если обработку клеток мутагеном проводили в присутствии хлорамфеникола. Показано, что в результате адаптации клеток происходит более эффективное исчезновение 0 -метилгуанина (Schendel, Robins, 1978). В настоящее время известен ген в E.coli, отвечающий за адаптивный ответ клеток ada -ген (Jeggo, 1979). Показано, что этот тип репарации связан не с удалением поврежденного основания из молекулы ДНК, а с деметилированием этого основания. Этот процесс осуществляет специальный фермент метилтрансфераза, который выделен из адаптированных клеток E.coli .Показано, что, по-видимому, метильная группа в процессе этой реакции переносится из 0 -метилгуанина на цистеин, в результате чего возникает s-метилцистеин ( Olson, Lindahl, 1980). По-видимому, ферменты такого типа существуют не только в клетках е. coli ,но и в других организмах, например в
17 клетках млекопитающих (Pegg, 1977,1978 ; Renard, Verly, 1980). В связи с наличием в клетке двух индуцибельных систем восстановления (мутагенной sos-репарации и антимутагенного адаптивного ответа) возникает вопрос о взаимодействии этих двух процеосов и их координации в клетке. Существующие косвенные данные свидетельствуют о независимости этих процессов (jeggo et al. 1977), однако позже было показано, что индукция адаптивного ответа может приводить к снижению 1ех+ -зависимого мутагенеза (Schendel et al., 1978). Кроме того, недавно получены данные, подтверждающие влияние адаптивного ответа на индукцию SOS-функций. Хотя адаптация клеток слабо влияет на УФ-мутагенез самих клеток E.coli оказалось, что практически весь -мутагенез,и, в меньшей степени, реактивация и индукция Я профага блокируются в адаптированных клетках (Defais et al.,I980). Для объяснения этого явления выдвинуто предположение, что "адаптационные" молекулы, а их в адаптированной клетке содержится несколько тысяч (Robins, Cairns, 1979), связываясь с RecA-белком, частично ингибируют инактивацию sos-penpeccopa. Возможно, что молекулы при этом подвергаются про-теолитическому расщеплению RecA-белком. Индукция адаптивного ответа практически полностью элиминирует мутагенное действие невысоких доз алкилирующих агентов, однако, при больших дозах мутагенез значительно растет. Рост мутагенеза в последнем случае резко снижается lexA-мутациями (Jeggo et al., 1977; Schendel et al.
1978). Эти результаты косвенно указывали на кооперативное функционирование систем адаптивного ответа и sospenapauim при значительных мутагенных воздействиях. Более поздние данные (Schendel, Defais, 1980) дают возможность предположить, что в гесА и 1ехА мутантах эффективность адаптивного ответа выше, чем в клетках дикого типа вследствие уменьшения гесА+зависимого протеолити-ческого расщепления "адаптационных" молекул (Defais et al., 1980).
18 При протекании мутационного процесса как в случае ошибок репарации, так и в случае ошибок репликации мутации возникают в ходе синтеза ДНК, то есть при работе ДНК полимераз. В случае пириииди-новых димеров было показано (Sedgwick, Bridges, 1974), что мутагенез является зависимым от (функционирования ДНК-полимеразы III в клетках E.coli.Однако, в других типах первичных повреждений это не наблюдается, и мутации могут формироваться при работе других полимераз E.coli.Например, при У -облучении ( Bridges, Motters-head, 1978) ДНК-полимерааа III не является абсолютно незаменимой. В последнее время появились данные о том, что ДНК-полимераза II является индуцибельным ферментом, находящимся под контролем ІЄХА-репрессора ( Kenyon, Walker, 1980). В связи с этим весьма вероятно, что именно эта ДНК-полимераза, функции которой долгое время оставались неясными, участвует в индуцибельной мутагенной репарации, в ходе которой формируются мутации. В случае НГ показано,что активность этой ДНК-полимеразы при воздействии этим мутагеном возрастает в системе in vivo (Miyoki et al., 1977).Однако,такая индукция ДНК-полимеразы II нитрозогуанидином не зависит от аллельного состояния гена recA ( Kondo, 1973 ; Kondo, Ichikawa, 1973 ; Yamamoto et al. ,1978). Характерной особенностью НГ является его способность индуцировать близко сцепленные мутации в вилке репликации ДНК в клетках E.coli (Hiroto etalI972 ; Hohlfeld, Yielmetter
,1973) и других организмах, таких как Streptomyces coelicolor ( Randazzo et; al. , 1973, 1976), Streptococcus sp. ( Metzer et al. , 1974), Bacillus eubtilis (Siccardi et al., 1976). Природа возникновения этих мутаций неясна. Показано, что этот тип мутагенеза не является гесА+ -зависимым, а зависит от гена uvrE+ ( Sklar, Strauss, ,1980). Не исключено, что НГ, реагируя с белками ( Cerda-Olmedo , Hanawalt , 1967), в частности с ДНК-полимеразой, способен вызывать клястер-мутации (Siccardi et al. ,1976; Hohlfeld, Yielmetter, 1973).Однако,выска-
19 зываются и другие предположения о природе этого типа мутагенеза.
Например, участие в этом процессе мутагенной репарации (Scudiero, Strauss, 1976). Последнее предположение, по-видимому, не может объяснить полностью это явление, поскольку, с одной стороны, по оценке, проведенной Дрейком и Болтцем ( Drake, Baitz,1976), в клетках E.coli соотношение между мутагенезом, связанным с ошибками репликации, и эффективностью возникновения мутаций в ходе репарации равно 3:7 для НГ, а с другой, НГ индуцирует значительно больше мутаций в логарифмической фазе роста по сравнению со стационарной в клетках E.coli (Cerda-Olmedo, Hanawalt,I968). Еще одной причиной, определяющей близко сцепленные мутации, которые возникают в вилке репликации хромосомы ДНК, может оказаться способность этого мутагена преимущественно поражать однонитевые участки ДНК (Jimenez-Sanchez, Cerda-Olmedo, 1975). В любом случае для НГ характерна наряду с прямым алкилированием (в результате чего возникают одиночные мутации) индукция клястерных повреждений и соответственно групп близко сцепленных мутаций в вилке репликаций хромосом. Положение о том, что основной эффект НГ связан с ошибками репликации, находится в соответствии с данными, указывающими на то, что этот мутаген индуцирует либо специфически, либо, по крайней мере, преимущественно мутации типа замены пар оснований. Данные по этому вопросу не совсем однозначны: так, в одних работах показано, что НГ вызывает исключительно мутации типа замены пар оснований (Segol et al.,I973), в других же обнаружены наряду с возникновением мутаций типа замен пар оснований также мутации типа сдвига рамки считывания и протяженных делений (Ishii, Kondo,I975; Drake, McGuire, 1967 ;Mailing, Serres, 1968). Однако, тем не менее во всех работах отмечается, что основным классом мутаций, индуцированных НГ, являются замены пар оснований в отличие от УФ-света, мутагенез которого связан исключительно с ошиб- ками репарации. В последнем случае мутации типа сдвига рамки считывания и типа замены пар оснований возникают примерно в оди наковом соотношении (Drake, 1963 ; Hartman et al., 1971).
Мутагенез и репарация ДНК в Е.сопри действии нитрозогуанидина
К настоящему времени установлено, что существуют так называемые гены мутаторы и антимутаторы, дефекты которых приводят к увеличению, либо снижению спонтанного и индуцированного мутагенеза. Известно, что у гесА-мутантов E.coli мутагенез после УФ практически полностью подавлен ( Minro, Tomizawa, 1968 ; Witkin , 1968; Hondo et al. ,1970). Отсутствие мутабильности в клетках E.coli после действия УФ показано также и для lezA -мутантов ( Witkin ,1966; 1968, 1969 ; Mount et al. ,1973). Резкое подавление мутабильности в штаммах, дефектных по гесА -функции,характерно также для повреждений, вызванных сенсибилизированным светом псораленом (Igali et al. ,1970), 4-нитрохинолиноксидом, рентгеновыми лучами, митомицином С ( iehii, Kondo ,1975) и метилметансульфонатом ( Walker, ,1977; McCaun et al. ,1975). Однако, при действии других мутагенов, таких как гидроксиламин, аналогов оснований, мутагенез не зависит от аллельного состояния гена recA+ ( Witkin, Parisi, 1974 ; Rydberg , 1977 ; Hutchinson, Stein ,1977). Отсутствие recA+ -зависимого мутагенеза в основном характерно также для этилметансульфоната, и в значительной степени для метилнитрозогуанидина (ishii, Kondo, 1975). Таким образом, нормальное функционирование гесА+-гена необходимо для эффективного протекания мутагенеза в случае достаточно обширного класса первичных повреждений, на базе которых, в основном, возникают ошибки репарации. Ветви репарации,в ходе которых возникают мутации, находятся под контролем гена recA+ , а также lexA
В настоящее время полагают,что конститутивные полимеразы E.cold не в состоянии осуществлять синтез ДНК на матрицах, несущих повреждения определенного типа ( Degre-Couve, Mamet-Bratley, 1973 ; Mamet-Bratley, 1974; Benlow et al., 1974; Caillet-Pauguet et al., 1977 ; Kimball et al., 1978). В результате после цикла репликации ДНК вновь синтезированные нити несут бреши в местах, оппозитных повреждениям в родительских нитях ДНК. При определенных условиях, которые создаются ингибированием синтеза ДНК, происходит выражение ряда индуцибельных оперонов в клетке, которое контролируется координированно с генами гесА+ и 1ехА+ . В результате этой индукции, в частности, модифицируются свойства полимеразы (по-видимому, полимеразы III) ( Boltimore ,1974) таким образом, что она оказывается способной проводить синтез ДНК на матрице с повреждениями ( Caillet-Pauguet et al., 1977 ; Radman et al», 1977).
Поскольку в мутантах гесА мутационный процесс в значительной степени подавлен, казалось бы, напрашивается естественный путь для реализации антимутагенеза, связанный с подавлением ин-дуцибельной функции гена гесА+. Однако, в силу того, что белок ReoA+ обладает плейотропным действием, в частности, контролируя протекание всех звеньев пострепликативной репарации, дефект по этому продукту приводит к резкому увеличению гибели клеток при действии широкого класса мутагенных факторов. В силу этого прямое подавление функции гесА+ , по-видимому, является бесперспективным при разработке методов антимутагенеза.
Бактериальные штаммы
Мутанты E.coli группы rec определяют дефект процесса рекомбинации (гее -мутанты). Наиболее изученной является их роль в процессах рекомбинации, репарации и мутагенеаз.
а) Мутант reсА
Впервые мутант recA E.coli был выделен Кларком и Маргулисом в 1965 г. (Clark, Marguliss, 1965). На генетической карте ген гесА+ локализован на 52-й минуте ( Taylor, Trotter, 1972). В клетках с генотипом гесА практически подавлена рекомбинация,и, кроме того, такие клетки отличаются высокой чувствительностью к большинству изученных мутагенов (Clark, Marguliss, 1965 ; Howard-Flanders, Theriot, 1966) и отсутствием индуцированного мутагенеза под действием УФ-света и ряда химических агентов ( Kondo , 1974).
б) Мутанты гесВ и гесС
Также как и мутант гесА , гесВ и гесС мутанты впервые были выделены из клеток E.coli Кларком и Маргулисом в 1965 г. Гены гесВ+ и гесС+ картировании на 54,5-й минуте генетической карты ( Taylor, Trotter, 1972) и являются структурными генами для экзонуклеазы У ( Tomisawa, Ogawa, 1972). Мутации в генах гесВ (или гесС ) уменьшают рекомбинацию на одной из последних ее этапов ( Birge, LowJ974;
Bergmans et al., 1975). Нормальн$з$Щционирование генов СССР JLg; J; & ЙЮа 1 recBC необходимо для эффективного протекания одного из типов экс-цизионной репарации (репарации "длинными участками") (Goldmark, linn, 1970, 1972; Karu et al., 1973).
в) Мутант recF. Ген recF+ расположен на 82-й минуте карты хромосомы E.coli,который контролирует один из путей процесса рекомбинации ( Clark, 1974). Продукт гена recF контролирует независимый от генов гесБС путь пострепликативной репарации (Eothman, Clark, 1977а). Некоторые авторы полагают, что основная функция гена связана с репарацией в ДНК при действии мутагенов (Cooper, Hanowalt,1972; Youngs et al., 1974).
г) Мутант. ІехА . Этот ген картирован на 80,9-й минуте генетической карты E.coli (Taylor, Trotter, 1972).Нормальное функционирование гена 1ехА+необходимо для протекания зависимой от ростовой среды эксцизионной репарации "длинными участками" (Youngs, Smith, 1973). Продукт гена 1ехА контролирует один из путей пострепликативной репарации ( Sedgwick, 1975а, ъ » Youngs, Smitn, 1976). Мутации в гене 1ехА подавляют УФ мутагенез, и,в меньшей степени,мутагенез, индуцированный радиацией (witkin, 1967,1969 a, b ).Мутанты 1ехА обладают рекомбинационной способностью и менее чувствительны к мутагенам ( Moody et al., 1973).
д) Мутант xthA . Мутант xthA впервые выделен Милкареком и Вейсом ( Milcarec, Weise, 1972) и представляет собой деле ционный мутант по области xthA . Этот ген картирован на 38,2-й минуте генетической карты E.coli (White et al., 1976).
Мутанты по локусу xthA , в основном,лишены трех ферментативных активностей: экзонуклеазы Ш,эндонуклеазы II и апуриновой эндо нуклеазы ( Kirtikar et al. 1976,1977; Weiss, 1976).Позже было показано,что экзонуклеаза III ассоциирована в гликозилазной и эндонуклеазной в отношении апиримединовых и апуриновых сайтов активностями.
Влияние генотипа линий на выживаемость клеток E.coli при действии нитрозогуанидина
На рис Л и 2 представлены кривые выживаемости клеток использованных штаммов E.eoli в зависимости от времени обработки НГ. Можно видеть, что во всех случаях дефектные по репарации линии оказались более чувствительными к мутагену, чем клетки дикого типа. Это указывает на то, что все использованные нами гены в большей или меньшей степени принимают участие в контроле процесса репарации ДНК при индукции в ней повреждений НГ.
Среди серии мутантов K-I2 наиболее чувствительными оказались гесА и гесВС. мутанты. Значительно большую резистентность выявили мутанты xthA и recF мутанты (рис.I).При использовании штаммов E.eoli в/г 1ехА мутант показал более высокую чувствительность к мутагену, в то время как клетки uvrA мутанта лишь незначительно отличались по чувствительности от клеток дикого типа (рис.2).
Известно, что при действии УФ-света эксцизионная репарация является полностью uvrA +(uvrB)зависимой, т.е. единственным ферментом в клетках E.eoli, способным надрезать нить ДНК вблизи пиримидинового димера, является uvrA (uvrB) зависимая эндо-нуклеаза. В случае алкилирующих соединений функции эндонуклеа-тического надрезания нити ДНК вблизи повреждения выполняют другие ферменты, например, энзиматические активности, ассоциированные с экзонуклеазой III ( Yojko, Weiss, 1975). Уменьшение резистентности к действию НГ в мутантных клетках xthA и uvrA по сравнению с клетками дикого типа указывает на то, что первый этап эксцизионной репарации в ДНК, несущих повреждения, индуцированных НГ, могут осуществлять как эндонуклеазы УІ (или II), так и uvrA (uvrB) зависимая эндонуклеаза. Значительно большая чувствительность мутанта гесА при действии НГ по сравнению с линией xthA, дефектной по эксцизионной репарации, указывает на существенную роль пострепликативной репарации в общем процессе репарации ДНК хромосомы Е. соИ.Индуцибельные функции клетки, зависящие от гена 1ехА, по-видимому, вносят незначительный вклад в указанный процесс. Отличием процесса репарации ДНК после действия НГ от такового в случае УФ-облучения связано и с тем, что recF зависимый путь репарации играет менее существенную роль по сравнению с УФ-облучением. При действии УФ-света гесВС и гесУ мутанты обладают примерно одинаковой чувствительностью. Существенно, что введение с -токоферола практически не влияло на выживаемость клеток использованных штаммов E.coli при действии НГ (рис.3, 4). Этот результат указывает на то, что при введении токоферола эффективность общего процесса репарации практически не меняется.r
