Введение к работе
Актуальность темы
В связи с ограниченными запасами доступной нефти, ростом парка автомобилей и некоторыми проблемами экологического, экономического и политического характера, возрастает интерес к биотопливу (альтернативным источникам энергии из возобновляемого сырья). Биомасса является четвертым по величине источником энергии после угля, нефти и природного газа.
Одним из основных видов биотоплива являются спирты, прежде всего этанол, который может быть добавлен к бензину, как для его экономии, так и для улучшения его некоторых параметров. Однако, у этанола есть сильный конкурент – бутанол, который полностью заменяет бензин для двигателей автомобилей. Бутанол может использоваться как в смеси с бензином, так и выступать в качестве ко-растворителя в дизельной топливной смеси. Возможность получения бутанола из биомассы была открыта еще в ранние 1900-е. В течение двух Мировых Войн заводы по производству биобутанола были построены в США, России, Китае, Индии, Южной Африке и т.д. Однако, с развитием нефтяной индустрии, производство бутанола микробиологическим путем отошло на второй план из-за потери рентабельности [He Huang, 2010].
За последние несколько лет возобновился интерес к бактериям рода Clostridia и к подобным микроорганизмам, как к возможным способам получения органических веществ, особенно бутанола, в настоящее время получаемого из нефтяного сырья. Clostridium аcetobutylicum наиболее часто используется для промышленного производства бутанола.
C. acetobutylicum, осуществляет ацетонобутиловое брожение углеводов в две стадии: на первой накапливаются ацетат и бутират, во второй стадии продолжается утилизация глюкозы, в результате чего кислоты конвертируются в органические растворители н-бутанол, ацетон и этанол [Qureshi N, 2001; Zverlov V.V., 2006]. Такой двухстадийный процесс обеспечивает клетки АТФ как во время интенсивного роста культуры, так и при подготовке к споруляции, однако значительно затрудняет промышленное производство бутанола и делает его нерентабельным, по сравнению с производством из нефтяного сырья. Кроме того, C. acetobutylicum является строгим анаэробом и обладает низкими показателями роста, что приводит к его низкой продуктивности. Недостаточно изученная генетическая система и физиология Clostridia затрудняют модификацию метаболических путей, необходимую для эффективной продукции бутанола [Lee J.Y., 2010]. Известны многочисленные попытки конструирования рекомбинантных штаммов на основе различных микроорганизмов, содержащих чужеродные клостридиальные гены биосинтеза бутанола [Pamela P. Peralta-Yahya, 2012; Yang Gu, 2011; Yan-Ning Zheng, 2009]. Использование E.coli в качестве реципиента генов клостридий позволяет применить разработанную методологию конструирования рекомбиниантных штаммов. Однако конструирование промышленных продуцентов бутанола предполагает не только высокий уровень экспрессии клонированных генов, но и высокую устойчивость культуры к бутанолу, - качество, которым известные штаммы E.coli и многие другие реципиенты не обладают.
Попытки конструирования продуцентов бутанола путем клонирование генов клостридий в различных микроорганизмах не привели к созданию эффективных штаммов, более того, в результате возникли существенные правовые ограничения в использовании генов клостридий для создания рекомбинантных продуцентов бутанола. Поскольку процесс биосинтеза бутанола может быть представлен как инвертированный процесс -окисления жирных кислот, возникло предположение о возможном биосинтезе бутанола в клетках E.coli без использования чужеродных генов.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было выяснение возможности биосинтеза бутанола культурой E.coli без использования чужеродных генов посредством обращенного пути -окисления жирных кислот. Кроме того, целью настоящей работы было получение штамма E.coli, обладающего повышенной толерантностью к бутанолу и исследование его фенотипических характеристик.
Для достижения указанных целей были сформулированы следующие задачи:
-
Конструирование штамма E.coli, усваивающего бутанол, как единственный источник углерода, с последующим обращением этого процесса при выращивании мутанта на среде с глюкозой.
-
Оптимизация метода получения бутанол-толерантного мутанта E.coli MG1655 ButR;
-
Проведение экспериментов по изучению различных фенотипических свойств полученного в ходе направленной микроэволюции мутанта MG1655 ButR;
-
Изучение влияния бутанола на экспресию in vivo лидерной области гена ompC у мутанта MG1655 ButR и родительского штамма MG1655;
Научная новизна и практическая значимость
В силу хорошей изученности, способности роста как в аэробных, так и в анаэробных условиях, Escherichia coli является одним из наиболее привлекательных объектов для конструирования рекомбинантных продуцентов бутанола. В геноме E.coli присутствуют гены, потенциально способные осуществить все этапы биосинтеза бутирата и бутанола. В рамках настоящего исследования была произведена реконструкция пути биосинтеза бутирата и бутанола на основе естественного метаболического пути -окисления жирных кислот. Впервые была показана возможность обращения этого процесса с целью получения продуцентов бутирата и бутанола. Тем не менее, E.coli обладает высокой чувствительностью к таким токсическим факторам как органические растворители и в частности к бутанолу. Таким образом, вторым не менее важным направлением исследования является решение проблемы толерантности E.coli к бутанолу. В процессе селекции был получен штамм E.coli, толерантный к бутанолу и обладающий рядом фенотипических особенностей: гиперчувствительность к осмотическому шоку, устойчивость к этанолу и изопропанолу, устойчивость к сурфакцину, отсутствие агрегации клеток в среде с бутанолом. Определен липидный состав мембраны бутанол-толерантного мутанта. Установлено, что бутанол является фактором регуляции экспрессии основных мембранных белков – поринов. Экспрессия гена ompC, кодирующего порин OmpC, возрастает под действием бутанола. Нуклеотидные замены, обнаруженные в регуляторной области гена ompC мутанта ButR, обуславливают более низкий уровень экспрессии в нормальных условиях и обеспечивают более высокий уровень синтеза в присутствии бутанола. Выявление основных механизмов и ключевых генов, задействованных в повышении толерантности клеток к органическим растворителям, позволит оптимизировать создание штаммов-продуцентов бутанола и других органических растворителей и сделать более рентабельным их производство.
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались на международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология Наука XXI века» (г. Пущино, 16 – 21апреля 2012 года).
Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИГенетика» 12 октября 2012 года.
Публикации
По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы, из них три в журналах, входящих в список, рекомендованный ВАК.
Структура работы
Диссертация изложена на 101 странице печатного текста, включая 25 , рисунков и 5 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, выводов и списка цитируемой литературы ( 135 наименования).
