Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Общеклеточные механизмы регуляции с участиш пуриновых нуклеотидов
1. Катаболитная репрессия т0
2. Неї -контроль 19
3.Взаимодействие Eel -контроля и катаболитной репрессии 27
Глава 2. Основные пути метаболизма и реутилизации пу^ риновых нуклеотидов и их предшественников 30
1.Регуляция биосинтеза пуринов de novo ЗО 2.Взаимопревращения пуринових нуклеотидов.
а) Биосинтез АМФ из ИМФ 35
б) Синтез ГМФ из ИМФ 35
в) Фосфорилирование АМФ и ГМФ в АТФ и ГТФ 36
г) Превращение адениловых нуклеотидов в ИМФ 37
д) Превращение гуаниловых нуклеотидов в ИМФ 38
3.Реутилизация пуринових оснований и нуклеозидов ( "salvage pathway" )... 38
а) Пуринфосфорибозилтрансферазы 40
б) Генетический контроль усвоения рибо- и дезоксирибонуклеозидов . 43
4.Транспорт пуринових оснований и нуклеозидов В КЛеТКах Е. coli И S. typhimurium 49
Глава 3. Материал и методы . 55
Глава 4. STRONG Генетическое и биохимическое изучение мутаций, нарушающих усвоение 6- оснований
пуриновым ауксоторофом Е. coli STRONG 62
1. Изучение роли гена hpt в усвоении гипоксантина и гуанина 63
2.Картирование мутации hpt . 66
З.Картирование гена guaC 69
Глава 5. Особенности фенотипического проявления мутаций hpt и gpt в геном пуринового ауксотрофа Е. Coli .
1. Влияние двойного мутационного блока hpt gpt на утилизацию экзогенных пуринових и пиримидиновых предшественников 73
2.Изучение природы фенотипа Rei" у мутантов puxD hpt gpt 77
Глава 6. Влияние мутаций по генам регуляторнои системы "строгого" контроля relc и spot на экспрес сию генов катаболизма 83
Глава 7. Влияние мутаций hpt gpt на экспрессию ката-болитчувствительных генов 95
Обсуждение 102
Основные выводы 109
Список цитированной литературы
- Катаболитная репрессия
- Фосфорилирование АМФ и ГМФ в АТФ и ГТФ
- Изучение роли гена hpt в усвоении гипоксантина и гуанина
- Влияние двойного мутационного блока hpt gpt на утилизацию экзогенных пуринових и пиримидиновых предшественников
Введение к работе
Актуальность темы. Настоящая работа посвящена изучению генов, участвующих в контроле метаболизма предшественников нуклеиновых кислот, в частности генов, вовлеченных в реутилизацию ПуриНОВЫХ ОСЯОВаЯИЙ И НуклеОЗИДОВ У Escherichia coli К-12.
Пурияовые основания и нуклеозиды являются структурными компонентами нуклеиновых кислот, кофермеятов и витаминов, участвуют в регуляции экспрессии различных оперонов, входя в состав низкомолекулярных эффекторов таких общеклеточных регулятор-ных систем как катаболитная репрессия и "строгий" контроль клеточного метаболизма, осуществляют сохранение и перенос клеточной энергии.
Синтез нуклеиновых кислот и регуляция клеточного метаболизма требуют наличия оптимальных количеств и сбалансированных соотношений различных классов нуклеотидов, в частности, нуклео-тидов аденина и гуанина. Необходимый уровень пула различных пуринових нуклеотидов у бактерий поддерживается благодаря регуляции, действующей на уровне синтеза нуклеотидов ае novo » а также на уровне взаимопревращений пуринов. Помимо самостоятельного значения, которое имеет разработка вопросов генетической регуляции пуринового метаболизма для генетики бактериальной клетки, интерес к метаболизму пуриновых оснований возрос в связи с накопившимися за последнее время данными об участии гуано-зин-5-дифосфат-3-дифасфата ( ppGpp ) в регуляции транскрипции генов рибосомных белков, рРНК, тРНК ( rei -контроль), исследование которой связано с решением таких фундаментальных проблем как регуляция клеточного роста, регуляция синтеза яематричяых РНК, координация транскрипции и трансляции и др. Однако значение ppGppB регуляции метаболизма бактерий не исчерпывается влиянием на транскрипцию рибосомных оперонов. От способности клеток быстро синтезировать ppGpp зависит скосрость дерепрессии аминокислотных биосинтетических оперонов. При этом ppGpp играет роль позитивного регулятора, способствующего ускоренному накоплению ферментов, необходимых для образования дефицитных аминокислот. Таким образом ppGpp представляет собой уникальный регулятор экспрессии обширной группы оперонов, контролирующих скорость синтеза суммарного клеточного белка.
Изучение генетической регуляции пуринового метаболизма представляет также интерес в связи с возможностью практического использования знаний в этой области. Так, некоторые мутанты с блокированными реакциями реутилизации пуринов выделяют пурино-вые производные в среду и могут быть использованы для микробиологического синтеза инозиновой кислоты, инозина и ксантозина, которые находят все более широкое применение в медицинской и пищевой промышленности.
В лаборатории генетики бактерий института БНИИгенетика, где выполнялась эта работа, в течение длительного времени проводились исследования пуринового метаболизма Е. СОІІ , в частности генетического контроля усвоения аденина и его производных, роли пуриннуклеозидфосфорилазы в реутилизации и метаболизме пуринових производных и т.д. (Лившиц 1973; Лившиц, Суходолец 1973? Лившиц, Суходолец 1974; Кочарян, Суходолец 1976; Кочарян 1976; Кочарян, Смирнов 1977). Настоящая работа является продолжением этой серии исследований, в частности, изучения генов, ответственных за утилизацию и реутилизацию гуанина, ксантина и гипо-ксаятина.
Состояние вопроса. В усвоении экзогенных пуриновых оснований и их нуклеозидов у Е. СОІІ принимают участие несколько групп ферментов,1 в частности, две пуриннуклеозидфосфорилазы (кодируемые генами deoD и хар ), фосфорибозилтрансферазы (гены apt , gpt и hpt ), инозин-гуаяозинкиназа (ген gsk ) (смі рис, 2), а также продукты генов, ответственных за транспорт нуклеозидов. Среди указанных генов ведущая роль принадлежит генам apt , gpi? и hpt , кодирующим фосфорибозилтрансферазы, катализирующие одноступенчатое превращение пуринових оснований в процессе взаимодействия их с фосфорибозилпирофосфатом в соответствующие нуклеотиды. Одновременно с превращением оснований в нуклеотиды эти ферменты осуществляют их транспорт через бактериальную мембрану по принципу переноса радикалов. Роль фофсорибозилтрансфераз не ограничивается утилизацией экзогенных пуринов. Как известно в процессе жизнедеятельности в бактериальной клетке происходит не только синтез, но и постоянное разрушение нуклеиновых кислот. Особенно интенсивно обновляется мРНК. Процессы репарации и рекомбинации сопровождаются вы-щеплением фрагментов из ДНК. "Отработанные" нуклеиновые кислоты и их фрагменты разрушаются нуклеазами до отдельных нуклеотидов, часть которых под влиянием фосфомоноэстераз (фосфатаз и нуклео-тидаз) преврвщается в яуклеозиды. Усвоение продуктов обмена собственных нуклеиновых кислот - еще одна важная функция фосфори-бозилтрансфераз и других компонентов пути реутилизации.
К моменту начала выполнения данной работы было известно, что утилизация гуанина, ксаятина и гипоксантина у Е.СОІІ происходит при участии двух фосфорибозилтрансфераз, кодируемых генами gpt и hpt . Однако не было известно о точной локализации гена hpt , кодирующего одну из фосфорибозилтрансфераз, а также о местоположении гена guaC » контролирующего одноступенчатую реакцию превращения ГМФ в ШФ (см. рис. 2). Не было ясно, какова субстратная специфичность ферментов, продуктов генов gpt и hpt в отношении 6-оксипуриновых оснований. Не был изучен и фенотип двойных мутантов hpt gpt с полным блоком утилизации гуанина , ксантина и гипоксантина. Кроме того отсутствовали какие-либо данные, касающиеся влияния таких мутаций в штаммах с нарушенным синтезом пуринов de novo на состояние системы строгого контроля клеточного метаболизма. Вместе с тем можно было предположить, что метаболизм пуринових оснований влияет на геї -систему, поскольку эффектором ее, как уже было известно к началу работы, является гуанозинтетрафосфат.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было получение и исследование мутантов с нарушенным синтезом фосфо-рибозилтрансфераз гуанина, ксантина и гипоксантина у Е. СОІІ К-І2; В соответствии с поставленной целью необходимо было получить и картировать мутации по генам, контролирующим синтез этих ферментов, то есть выявить гены, ответственные за соответствующие реакции. Необходимо было изучить фенотип полученных мутантов, в частности форм с полным блоком утилизации гуанина, ксаншина и гипоксантина, другими словами изучить in vivo состояние метаболизма в таких клетках. Свойства таких мутантов представляли интерес и с точки зрения их возможного влияния на выражение rei-контроля, поскольку у пуринових ауксотрофов с блокированным синтезом пуринов de novoOCHOBHHM "поставщиком исходных компонентов для синтеза ppGpp (АТФ и ГТФ) является путь реутилизации экзогенных предшественников, в частности, реакции, катализируемые фосфорибозилтрансферазами.
Научная новизна и значимость работы. В работе были изучены мутанты с нарушенным синтезом фосфорибозилтрансфераз гуанина, ксантина и гипоксантина. Утилизацию этих оснований контроли - 8 -руют два гена gpt и hpt , продукты которых, фосфорибозилтран-сферазы, катализируют реакции образования ИМФ, ГМФ и КМФ из соответствующих оснований и фосфорибозилпирофосфата. Локализация гена hpt ранее была определена ориентировочно. В даннойработе было проведено тонкое генетическое картирование района локализации гена hpt , в результате чего установлено его точное местоположение относительно близлежащих маркеров на хромосоме
Е. coli к-12 . Кроме того нами была установлена точная генетическая локализация гена guaC на хромосоме Е. coli , ранее практически не картированного. Определена активность фосфорибо-зилтрансфераз, продуктов генов gpt и hpt , у сконструированных нами штаммов, несущих отдельно либо мутацию hpt , либо gpt . Оказалось, что фермент, кодируемый геном gpt , катализирует утилизацию гуанина, ксантина и, в меньшей степени, гипо-ксантина, в то время как субстратами фосфорибозилтрансферазы, кодируемой геном hpt , являются гипоксантия и гуанин.
Изучен фенотип двойного мутанта hpt gpt у штамма, несущего мутацию purD (блокирование синтеза пуринов ае novo ). Бактерии такого штамма не могли усваивать экзогенные гуанин, ксантин и гипоксантин. У них было обнаружено появление интересных свойств, состоящих в приобретении ими истинного фенотипа Rei" t несмотря на интактность генов "строгого" контроля синтеза рРНК. В связи с этим было изучено влияние rei -контроля на активность генов катаболизма яуклеозидов. Оказалось, что максимальная экспрессия генов део-оперона и уридинфосфорилазного гена наблюдается в геноме клеток геі+ в условиях накопления гуанозинтетрафосфата. В то же время получены данные, из которых следует, что у бактерий генотипа purD hpt gpt, характеризующихся повреждением rei -регуляции, активность катаболитчуветви тельных промоторов генов део-оперона и уридинфоефорилазы угнетается.
Катаболитная репрессия
Пуриновые нуклеотиды занимают особое место среди низкомолекулярных компонентов бактериальной клетки в связи с тем, что два из.[Них, циклический аденозин-3,5-монофосфат и гуанозинтет-рафосфат являются медиаторами общеклеточных систем регуляции, известных в литературе как, соответственно, катаболитная репрессия /197/ и "строгий контроль" клеточного метаболизма ( техконтроль) /94/. Благодаря функционированию этих регуляторних систем в бактериальной клетке достигается согласованное выражение целых групп генов и оперонов, что наряду с механизмами регуляции отдельных генов и оперонов делает возможным координацию синтеза разнообразных клеточных компонентов.
Термин "репрессия катаболитами" предложили в 1961 г. Ма-гасаник с сотр. /163/, назвавшие так блокирование синтеза многих ферментов в бактериальной клетке глюкозой и рядом других углеродных соединений, не являющихся непосредственно строительными блоками для синтеза макромолекул, но служащих источниками для образования промежуточных метаболитов и энергии. Индуцибель-ные ферменты, синтез которых может быть подвержен катаболитной репрессии глюкозой стали называть катаболитчувствительными Так же стали называть и гены, ответственные за синтез катаболит-чувствительных ферментов, когда было доказано, что катаболитная репрессия относится к категории явлений, разыгрывающихся на генном уровне, т.е. при транскрипции /161, 180, 193, 195/. В связи с этим возникли вопросы, каким образом катаболиты ингибиру-ют транскрипцию? Взаимодействуют ли катаболиты с самим промото - II ром или FHK-полимеразой?
Макман и Сазерленд /166/ впервые связали эффект глюкозы с циклическим 3,5-АМФ (цАМФ), показав, что в присутствии глюкозы внутриклеточная концентрация этого нуклеотида снижается в 1000 раз. После удаления глюкозы из среды содержание цАМФ в клетке восстанавливалось. Логично было предположить, что снижение уровня цАМФ вызывает катаболитную репрессию. Действительно было показано, что репрессирующее действие глюкозы на синтез -галактозидазы и триптофаназы можно снять добавлением цАМФ /201, 253/.
Перлмая и Пастая /202/ выделили мутант по гену аденилат-циклазы ( суа ), катализирующей реакцию образования цАМФ из АТФ /127, 246/, и показали что такой мутант терял способность утилизировать лактозу, мальтозу, маннит, арабинозу и глицерин. Тот факт, что усвоение всех перечисленных Сахаров восстанавливалось под влиянием экзогенного цАМФ, показывает, что метаболические дефекты являются следствием нарушения синтеза этого нуклеотида. Эти же авторы показали, что цАМФ не стимулирует синтеза -галактозндазы в клетках Б. соїі на среде с глюкозой, если образование іас -мРНК блокировано профлавином, что свидетельствовало об участии цАМФ в регуляции синтеза именно мРНК /200/.
Среди мутантов с фенотипом уа были подучены формы, у которых однако способность к усвоению углеводов под влиянием цАМФ (в отличие от истинных мутантов суа ) не восстанавливалась /83, 272/. У таких мутантов ( crp )оказался поврежденным белковый фактор (СЕР ИЛИ CAP ), рецептор цАМФ /66, 272/. Андерсон с соавт. /31/ получили гомогенный препарат CRP , Используя этот очищенный белок в системе in vitro , содержащей ДНК 1а с -оперона, цАМФ, РНК-полимеразу и нуклеотидтрифосфаты, они доби - 12 -лись экспрессии лактозного оперона.
Пастан и Перлман предложили модель, которая легла в основу современных представлений о механизме действия ЦАМФ-CRP /198/. Согласно этой модели цАМФ не прямо взаимодействует с ДНК или РНК-полимеразой, а в комплексе с CRP.
Б настоящее время стало известно, что CRP представляет собойдимер, содержащий две идентичные субъединицы, каждая из которых способна взаимодействовать с одной молекулой цАМФ /83/, Мономер CRP имеет две функционально различные области: большой IT -концевой домен и малый - С-концевой /80, 149, 168/, В большом домене идентифицирован центр локализации цАМФ, связывание которого с CRP вызывает в структуре последнего сильные кон-формационные изменения, ответственные за активирование CRP И связывание его с ДНК. Для взаимодействия с ДНК служит малый С-концевой домен- CRP.
Механизм активирующего действия комплекса ЦАМФ-CRP на транскрипцию катаболитчувствительных генов наиболее полно изучен на лактозяом опероне с помощью генетического анализа промо-торяых мутаций по этому оперону /32, 40, 125, 221, 222/.
Были получены три класса промоторных мутаций, мутации первой группы, картированные в "левой" части промотора (сайт I) /32, 40/, снижали активность е -галактозидазы до 2 - 6% от активности у штамма дикого типа и приводили к нечувствительности lac -оперона к катаболитной репрессии. В такой же степени активность -галактозидазы снижается у мутантов суа или crp. В этом же районе картировались ранее полученные мутации L8 и Ы , приводящие к потере катаболитчувствительности синтеза в -галактозидазы /203, 221/.
Фосфорилирование АМФ и ГМФ в АТФ и ГТФ
ИМФ превращается в АМФ с образованием промежуточного продукта - сукцинил АМФ (см. рис.1, 2) под контролем, соответственно генов purA и purB ; Гени purA и purB на хромосоме Е. coli и s. typhimurium не сцеплены /35, 188/. Мутации по этим генам вызывают у бактерий специфическую ауксотрофность по аденину. Кроме того, поскольку фермент, продукт гена purB - бифункциональный и принимает участие в синтезе пуринов ie novo /97/ (см. рис.1), мутанты purB не способны синтезировать и гуанило-вне нуклеотиды.
Исследованиями in vitro показано, что активность аденило-сукцинатсинтетазы, кодируемой геном purA , может иягибировать-ся аденозинмонофосфатом и гуаниловыми нуклеотидами, включая ppGpp. б) Синтез ГМФ из ИМФ. ГМФ синтезируется из ИМФ с образованием промежуточного продукта, ксантозинмонофосфата (КМФ), в реакциях, кализируемнх, СООТВеТСТВеННО,} ИМФ ДЄГИДР0ГЄЯа30Й (ПРОДУКТОМ Гена guaB ) и КМФ-амидотрансферазой (ген guaA ) /185, 199/. Гены guaA и guaB Объединены В КЛеТКЭХ Е. coli И S. typhimurium В ОПЄ роя guaA - guaB /234, 186, 151/. Мутанты по любому из этих генов характеризуются потребностью в гуанине (гуанозине). Кроме того рост мутантов guaB возможен в присутствии экзогенного ксантина. Экспрессия gua -оперона в клетках Е. СОІІ подавляется ГМФ и ppGpp /155/ и активируется при добавлении экзогенного аденина (даже в присутствии иягибирующих концентраций гуанина в среде) /76/.
в) Фосфорилирование АМФ и ГМФ в АТФ и ГТФ.
Пуриновые нуклеозидтрифосфаты АТФ и ГТФ обрауются путем последовательного фосфорилирования АМФ и ГМФ /157/. Образование дезоксирибонуклеозидов происходит на уровне дифосфатов /36, 138, 210/.
Синтез АДФ и ГДФ из АМФ и ГМФ, соответственно, катализируют высокоспецифичные к пуриновому основанию нуклеозидмонофос-фаткиназы, осуществляющие фосфорилирование как рибо-, так и дезоксирибонуклеозидмонофосфатов /116, 84/. У Е. СОІІ выделены температурочувствительные мутанты по структурному гену адени-латкиназы ( adk ) /84, 116/. При непермиссивной температуре та-кие мутанты теряют способность к росту на любых средах, что объясняется по-видимому недостатком у них АТФ. Оказалось также, ЧТО Некоторые ТеМПературОЧуВСТВИТеЛЬНЫе МутаЦИИ В Гене adk приводили к зависимости от температуры липидного синтеза и термолабильности глицерол-3-фосфатацилтрансферазы, что свидетельствует по-видимому об участии аденилаткиназы в биосинтезе липидов посредством образования комплекса с глицерол-3-фосфатацидтранс-феразой /84/.
Фосфорилирование АДФ и ГДФ в, соответственно, АТФ и ГТФ осуществляется нуклеозиддифосфаткиназой, характеризующейся широкой субстратной специфичностью /188/. Мутанты по гену ndk , кодирующему ЭТОТ фермент, Получены у S. typhimurium /214/.
г) Превращение адениловых нуклеотидов в ИМФ.
Адениловые нуклеотиды могут превращаться в нуклеотиды гуанина у большинства, если не у всех организмов /46, 178/. У эя-теробактерий прямое дезаминирование АМФ в ИМФ отсутствует /II, 271/ и исходным продуктом в таком превращении является АТФ. Образование ИМФ из АТФ может осуществляться по так называемому гистидиновому пути, либо через аденин и аденозин.
Первой реакцией пути биосинтеза гистидина является взаимодействие PRPP и АТФ /30, 172/. В одной из последующих реакций в качестве побочного продукта образуется AICAR /172/ (см. рис.1), промежуточный продукт биосинтеза пуринов. Таким образом, если в клетке возможны синтез гистидина de novo и образование АТФ, пропорциональное количество ИМФ из АТФ синтезируется через гистидиновый путь. Образование ИМФ из АТФ по этому пути зависит главным образом от внутриклеточной концентрации гистидина, поскольку гистидин ингибирует активность первого фермента своего биосинтеза /30/. Показано также, что синтез первого фермента гистидинового биосинтеза контролируется системой "строгого" контроля /188/. Синтез ИМФ из аденина и адеяозина, образующихся в клетках Е. сои и s.typhimuriuSPH деградации адениловых нуклеотидов, ПРОИСХОДИТ С ПОМОЩЬЮ salvage -фЄрМЄНТОВ, ПурИННукЛЄ03ИДф0С форилазы и аденозиндезаминазн (см. рис.2).
Изучение роли гена hpt в усвоении гипоксантина и гуанина
В настоящей работе в качестве исходного штамма использовали HfrH Hpt3 (см. табл.1), полученный Лившицем и Абалаки-ной /13/ как мутант, устойчивый к бчйеркаптопурину (МП) у штамма HfrH gpt 12 (purD gpt 12 deoD) ; Штамм HfrH gpti2 как содержащий мутацию gpt , неспособен к росту на среде с ксантином или гуанином как источниками пуринов /12/. В отличие от HfrH gpt 12 штамм HfrH Hpt3 с приобретением устойчивости к МП -аналогу гипоксантина, утратил способность к росту и на среде с гипоксантином как источником пуринов. Как было показано /13/, неспособность бактерий HfrH Hpt3 усваивать гипоксантин обусловлена присутствием двух мутаций: gpt и hpt .
Чтобы оценить вклад гена hpt в усвоение гипоксантина, а также подтвердить природу ранее полученной мутации /13/, как затрагивающей именно гипоксантинфосфорибозилтрансферазу, мы получали ПрОИЗВОДНые ШТаММа HfrH Hpt3 феНОТЙПа Gpt Hpt+ И Gpt+Hpt и определяли у них фосфорибозилтрансферазную активность в отношении различных пуриновых оснований. В трансдукционном скрещивании штамма HfrH Hpt3 с HfrH pur deoD (донор, фаг-РІ) на среде, содержащей в качестве источника пуринов гипоксантин, отбирали рекомбинанты Hpt+ . Поскольку, как было показано ранее /13, 133/, мутаций hpt и gpt не сцеплены, мы ожидали появления рекомбинантов двух типов, а именно форм, несущих дикого типа аллель гена hpt на фоне мутации gpt ( hpt+gpt ), а также рекомбинантов с генотипом hpt gpt+ . И те и другие должны были использовать гипоксантин для роста, тогда как ксан-тин и гуанин должны были утилизировать только бактерии, несущие аллель дикого типа гена gpt . Действительно, среди 200-т полученных трансдуктантов у 127-и сохранился дефект по способности к усвоению ксантина и гуанина. Остальные рекомбинанты могли расти на средах, содержащих ксантин и гуанин в качестве источников пуринов, то есть рекомбинанты этого типа по-видимому несли мутацию hpt на фоне аллеля gpt . Таким образом были получены штаммы: IB20I ( HfrH thi purD deoD hpt ) и ІБ202 ( HfrH thi purD gpt deoD )#
У полученных штаммов был изучен фенотип в отношении усвоения 6-оксипуриновых оснований и определена активность гуанин-, ксантин- и гипоксантин-фосфорибозилтрансфераз.
В табл.2 приведены результаты опытов по определению времени генерации бактерий штаммов IB20I и IB202, а также контрольных штаммов HfrH Hpt3 и HfrH purD deoD . Из данных табл.2 видно, что на среде с гипоксантином бактерии gpt hpt растут лить немногим хуже, чем бактерии дикого типа, а время генерации бактерий gptthpt также только в 1,3 раза больше, чем у штамма дикого типа. Следовательно мутация hpt самостоятельно не проявляется и только двойной мутант по генам hpt и gpt не способен использовать гипоксантин в качестве источника пуринов.
Результаты этих опытов также свидетельствуют о том, что для эффективной утилизации гуанина и ксантина необходимо присутствие аллеля дикого типа гена gpt.
У тех же штаммов было определена активность фосфорибозил-трансфераз по отношению к гуанину, ксантину и гипоксантияу. Результаты определения приведены в табл.3.
Из данных, представленных в табл.3, видно, что фосфорибо-зилирование гипоксантина и гуанина катализируют ферменты, кодируемые обоими генами - hpt и gpt . При этом специфичность фосфорйбозшгтрансферазы, продукта гена hpt, по отношению к гипоксантину значительно выше, чем у фермента, продукта гена gpt: 78 и 29$ от общей активности, соответственно. В то же время в отношении гуанина "удельная" активность для ферментов, кодируемых генами gpt и hpt ,- 74 и 27$, соответственно. Что касается фосфорибозилирования ксантина, то эта реакция катализируется почти исключительно (88% общей активности) ферментом, продуктом гена gpt.
Влияние двойного мутационного блока hpt gpt на утилизацию экзогенных пуринових и пиримидиновых предшественников
В реакциях пути реутилизации, как уже говорилось, главную роль играют фосфорибозилтрансферазы, которые обеспечивают также и транспорт оснований внутрь клетки. В связи с исключительно важной ролью, которую играют эти ферменты для метаболизма пуринов в клетке пуринового ауксотрофа можно было предположить, что потеря активностей фосфорибозилтрансфераз гуанина, ксантина и гипоксантина в результате двойного мутационного блока hpt gpt приведет к плейотропному влиянию на метаболизм бактериальной клетки в целом.
С целью изучения "двойных" мутантов hpt gpt были сконструированы штаммы, генотип и происхождение которых представлены в табл.7. В качестве исходного материала был использован HfrH Hpt3 , описанный выше, а также CMI07 (см. табл.1).
Полученные для выполнения этой части работы штаммы отличаются от использованных нами ранее (табл.4\ прежде всего наличием дикого типа аллеля гена deoD , кодирующего пуриннукле-озидфосфорилазу. Этот фермент катализирует обратимую реакцию фосфоролитического расщепления нуклеозидов, позволяющую клетке использовать их в качестве источников углерода и энергии /173/. Анаболическая функция этого фермента в отношении 6-оксипурино-вых оснований выражена в обычных штаммах (то есть gpt+hpt+ ) слабо /188/. Поэтому интересно было изучить возможное изменение в "поведении" пурйннуклеозйдфосфорилазы у мутантов hpt gpt.
Как следует из представленных данных, бактерии purD hpt gpt (СМ838) характеризутотся отсутствием роста на средах с гипоксантином, гуанином и ксантином в качестве источника пуринов несмотря на присутствие аллеля дикого типа гена deoD . Кроме того такие бактерии в отличие от одиночных мутантов и штаммов дикого типа ( hpt+gpt+ ) не способны использовать в качестве источников пуринов в отдельности аденин или инозин (или гуаяозин), а требуют для роста одновременного добавления этих предшественников. Из представленных в табл.8 данных видно также, что мутации hpt gpt приводят к неспособности пурино-вых ауксотрофов к росту на средах с инозином, а также дезокси-аденозином в качестве источников (одновременно) углерода и пуринов. В то же время способность утилизировать аденозин у та-киз бактерий сохраняется, что свидетельствует об интактности гена deoD , ответственного за фосфоролиз пуриновых нуклеози-дов /173/.
Бактерии Ш838 восстанавливают рост на среде с инозином при добавлении в нее аденина: при концентрациях аденина I, 10 и 20 мкг/мл время генерации бактерий составило 165, 70 и 140 мин., соответственно. Таким образом, возможно, что в условиях пуриновой ауксотрофности (мутация purD ) и полного блока реутилизации 6-оксипурияов (мутации hpt gpt ) в клетках бактерий создается дефицит не только по 6-оксипуринам но и по нуклео-тидам аденина.
Неожиданно обнаружилось, что мутанты purD hpt gpt перестают использовать в качестве источника углерода также тими-дин, сохраняя способность к росту на уридине и цитидине. Отсутствием роста на средах с дезоксирибонуклеозидами характеризу -гатся мутанты по дезоксирибоальдолазяому гену део-оперона -аеос /173/. Тиминовые ауксотрофи, содержащие мутацию по этому гену, как известно /173/, характеризуются сниженной потребностью в тимине и, кроме того, мутанты deoC не только не растут на дезокоирибонуклеозидах как источниках углерода, но также характеризуются чувствительностью к их присутствию в среде. Но потребность в тимине у штамма СМ837 (тимин-зависимого варианта штамма СМ838 - см. табл.7) остается такой же высокой, как и у штамма CM83I ( thy purD ) - 20 мкг/мл, а тимидин и дезоксиаде-нозин не ингибируют рост двойных мутантов на глюкозной среде. Следовательно бактерии штаммов СМ837 (иСМ838) не содержат мутации по гену deoC , и отсутствие их роста на тимидине и де-зоксиаденозине связано именно с "двойной" мутацией hpt gpt , вызывающей плейотропные нарушения в утилизации экзогенных предшественников пуриновых нуклеотидов.
