Введение к работе
Актуальность темы. Формирование дифференцированной клетки рассматривают в настоящее время как результат определенной специализации в функционировании ее генетического аппарата. Конкретным отражением такой специализации становится генетическое детерминирование синтеза целого набора белков, которые, в конечном счете, обеспечивают свойства дифференцированной клетки. Исследование этой проблемы в отношении клеток лимфоидного ряда вызывает значительный интерес в связи с многими важными функциями, выполняемыми лимфоцитами в организмах высших зукариот.
Клетки лимфоидного ряда традиционно являются одним из интенсивно используемых объектов для изучения различных генетических проблем. Они оказались достаточно удобными и для анализа кариотипа. и для оценок генетического полиморфизма, и для выявления генотоксических эффектов от воздействия различных внешнесредовых факторов (Hamaguchi 1982, 1984; Kondo 1984а. 1988b; Ankina 1991; Keppen 1992; Holmberg.1993; Спит-ковский .1992). В работах некоторых авторов применялись методы анализа белков лимфоцитов для решения отдельных генетических задач, в частности, для генетического картирования (Kondo 1985; Goldman 1991).
Новые возможности в изучении особенностей функционирования генетического аппарата в клетках лимфоидного ряда возникли благодаря прогрессу биохимической и молекулярной генетики, обосновавшей фундаментальные положения о взаимоотношениях между генами и белками, а также создавшей методологию анализа белков как продуктов генной экспрессии (Льюин 1987; Anderson. Anderson 1982. 1984; Klose 1989; Cells et al 1992).
Появление высокоразрешающего двумерного электрофореза (O'Farrell 1975), позволяющего параллельно анализировать сотни и тысячи индивидуальных продуктов генной экспрессии, стало началом для формирования комплексного подхода к изучению особенностей функционирования генетического аппарата в клетках разных типов. Этот подход, получивший название "системный", находит уже применение в изучении геномов ряда организмов и, в частности, человека (Inter.Meet. "2D Electrophoresis: from protein maps to genomes" 1994).
В настоящее время несколько групп исследователей активно применяют системный подход к изучению продуктов генной экспрессии в клетках лимфоидного ряда человека (Cells et al 1989. 1990. 1991; Hamaguchi et al 1981. 1982; Hanash 1994). Поставлена и стала решаться задача построения компьютерных банков данных об этих белках. Однако, из-за методических различий и при больших количествах анализируемых признаков встречаются трудности при сопоставлении результатов. Вероятно, проведение некоторой унификации в технологии анализа дало бы возможность преодолеть выявившиеся затруднения.
Вместе с тем, значительный потенциал рассматриваемого подхода остается пока неполностью задействованным. Например, при достаточно высоком уровне разрешения сравнение белковых спектров разных клеточных линий, относящихся к лимфоидному ряду, могло бы позволить охарактеризовать как специфику дифференцйровки по лимфоидному типу, так и вариабельность этой дифференцйровки. обеспечивающую различия между клеточными линиями. Вполне актуальными представляются также поиски новых полиморфных белков, белков-маркеров действия генотокси-ческих агентов (в частности, ионизирующих излучений) и белков, экспрессия которых изменяется при генетически обуслов-
ленных заболеваниях.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение комплекса наиболее представленных продуктов генной экспрессии в лимфоцитах периферической крови человека и клетках некоторых лимфоидных линий с использованием стратегии системного подхода, а также поиски лимфоцитарных белков, изменяющихся после воздействия на клетки малых доз ионизирующего излучения.
В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:
-
На основе метода двумерного электрофореза по О'Фар-реллу и ряда других методов охарактеризовать физико-химические свойства наиболее представленных белков лимфоцитов человека и построить усредненную схему распределения этих белков - двумерную карту.
-
Идентифицировать на двумерной карте некоторые лимфо-цитарные белки и использовать карту для выявления возможных электрофоретических вариантов белков.
-
Провести сравнительный анализ продуктов генной экспрессии (на уровне белков) в покоящихся мононуклеарах и ми-тоген-индуцированных пролиферирующих клетках.
-
Исследовать воздействие малых доз ионизирующей радиации на генную экспрессию (на уровне белков) в лимфоцитах человека и других лимфоидных клетках.
-
Изучить возможности двумерного электрофоретического анализа белков для выявления изменений генной экспрессии в мононуклеарах лиц. имеющих хромосомные аберрации.
-
Провести сравнительный анализ продуктов генной экспрессии в нескольких культивируемых лимфоидных клеточных линиях, генетический аппарат которых характеризуется специфи-
чесними особенностями.
Научная новизна работа. С помощью оригинальной модификации метода О'Фаррелла построена двумерная карта распределения 273 наиболее представленных белков лимфоцитов человека в диапазоне Мм 12,5-200 кДа и pi 4.8-7,20. Для всех 273 полипептидных фракций определены значения молекулярной массы и изоэлектрические точки. На построенной карте идентифицировано 11 белков и выявлено несколько электрофоретических вариантов белков. Впервые представлены данные об изменениях белков лимфоцитов человека и гибридом штаммов MLC-1 и К-48 при воздействии малых доз ионизирующего излучения. Продемонстрированы возможности использования метода двумерного электрофореза для изучения изменений генной экспрессии в лимфоцитах лиц, имеющих хромосомные аберрации. Получены также новые данные об особенностях белкового состава клеток нескольких лимфоидных линий.
Научно-практическая значимость. Предложена упрощенная и унифицированная методика для анализа двумерным электрофорезом белков в клетках лимфоидного ряда. Охарактеризован комплекс из 273 наиболее представленных белков в мононуклеарах периферической крови человека, который можно рассматривать как своеобразный "белковый портрет" этих клеток.
Построенная двумерная карта белков лимфоцитов человека открывает возможности изучать изменения белкового спектра лимфоцитов параллельно по 273 полипептиднкм Фракциям при различных физиологических и патологических состояниях.
Проведенное сравнение полипептидного состава интактных и облученных лимфоцитов позволило выявить изменения проявленности некоторых белков, характеризующие реакцию клеток на воздействия малых доз ионизирующей радиации.
Исследован состав белков лимфоцитов в семьях с делецией короткого плеча 5 хромосомы (синдром "кошачьего крика"). Для белка Е 2 обнаружена в ряду "норма-транслокация-делеция" корреляция с эффектом дозы гена, что свидетельствует в пользу предположения о локализации гена данного белка на коротком плече 5 хромосомы.
Полученные данные могут быть использованы при дальнейшем изучении белкового состава лимфоцитов человека при наследственной патологии.
Результаты работы позволяют перейти к систематическим исследованиям белков лимфоцитов крови и клеток лимфоидных линий человека с помощью метода двумерного электрофореза по О'Фаррелу.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Изучение комплекса наиболее представленных белковых продуктов генной экспрессии в мононуклеарах периферической крози человека; построение двумерной карта - схемы распределения 273 белковых фракций в координатах изоэлектрическая точка/относительная молекулярная масса.
-
Идентификация отдельных белковых фракций на двумерной карте и выявление электрсфоретических вариантов некоторых белков.
-
Показана принципиальная возможность определения изменений генной экспрессии по отдельным белкам в ответ на изменения условий культивирования клеток, воздействие малыми дозами ионизирующих излучений, а также в клетках с хромосомными аберрациями при наследственной патологии (делеция короткого плеча хромосомы 5).
-
При сравнении белковых наборов в 8 культивируемых клеточных линиях, относящихся к лимфоидному ряду и различаю-
щихся по кариотипу и происхождению, выявлены определенные особенности функционирования генетического аппарата (генной экспрессии).
Апробация работы. Материалы диссертации представлялись и обсуждались на Российском научном симпозиуме "Экологические факторы и кроветворение"(Москва, 1992). III конференции "Геном человека" (Черноголовка, 1993), IV конференции " Геном человека-94" (Черноголовка, 1994), Intern.Meeting "2D Electrophoresis: from protein maps to genomes" (Siena. Italy, 1994), I (III) Российском съезде медицинских генетиков (Москва. 1994), I съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), на Ученом Совете НИИ генетики человека МПЩ РАМН (1994).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, заключение, список литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована 9 таблицами и 24 рисунками. Список литературы содержит 224 источника, включая 183 работы зарубежных авторов.
