Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы. 10
1.1. Белки паутины ... : 10
1.1.1. Свойства белков паутины 10
1.1.2. Состав и структура белков-паутины ..13
1.1.3. Механизм, прядения нити шелка насекомыми и пауками. ; ...24
1.1.4. Искусственное прядение нитей паутины 30
1.1.5. Биоматериалы на основе белков шелка и их применение 32
1.2. Гены спидроина и их экспрессия в гетерологичпых организмах 38
1.3. Лихеназа (р-1,3-1,4-глюканаза) Clostridium termocellum как транскрипционный и трансляционный репортер ...-.46
Глава II. Материалы и методы 54
Глава III. Результаты и обсуждение. 67
3.1. Нуклеотидная последовательность синтетического гена спидроина и ее анализ с целью экспрессии в растениях ,...67
3.2. Получение транстенных растений гаплоида табака, экспрессируювдих синтетические гены спидроина 83
3.2.1. Конструирование экспрессионных векторов синтетических генов спидроина для трансформации растений табака. 84
3.2.2. Конститутивная экспрессия синтетических генов белков - аналогов спидроина в трансгенных растениях табака: ...87
3.3. Получение и анализ растений картофеля, экспрессирующих синтетические гены спидроина . 101
3.3. 1. Разработка методических приемов трансформации растений картофеля сортов отечественной селекции. :... 103
3.3.2 Молекулярно - биологический анализ растений картофеля, репрессирующих. синтетический ген спидроина 1 109
Заключение... .„... 129
Выводы ; . 132
Список цитируемой литературы
- Белки паутины
- Гены спидроина и их экспрессия в гетерологичпых организмах
- Нуклеотидная последовательность синтетического гена спидроина и ее анализ с целью экспрессии в растениях
- Получение и анализ растений картофеля, экспрессирующих синтетические гены спидроина
Введение к работе
Пауки и паутина - всегда вместе. К настоящему времени описано около: 34000 видов пауков, каждый из которых способен производить несколько различных нитей паутины, которые образуют паутинный шелк. Лучше всех изучены каркасные нити шелка паутины, которые образованы двумя белками - спидроином 1 и 2. Эти белки являются типичными представителями фибриллярных белков.
Литературные данные о структуре последовательностей к ДНК и генов белков паутины, свидетельствуют о том, что практически все они состоят из большого числа повторяющихся элементов. Наличие большого количества повторов в составе генов белков паутины обусловливают структуры этих белков, состоящих из повторяющихся пептидных мотивов (модулей), в которых полиаланиновые блоки чередуются с участками, обогащенными глицином. Выявлены консенсусные последовательности внутри повторяющихся пептидных модулей у многих белков паутины, которые, в свою очередь, повторяются множество раз по всей длине каждого белка. Благодаря своим структурным особенностям, белки каркасной нити являются удобными моделями для, изучения взаимосвязи между структурой и функциями фибриллярных белков, а также представляют собой уникальный биоматериал, сочетающий удивительную прочность и эластичность: Возможность использования этих белков как для фундаментальных, так и прикладных исследований обусловлена тем, что свойства большинства модулей белков паутины изучены достаточно хорошо у различных видов пауков, и выявлена удивительная корреляция между качественным- составом модулей каждого белка; и его физическими свойствами - эластичностью и/или прочностью. Таким образом, меняя последовательности исходных модулей и следя; за изменениями механо-химических; свойств1: соответствующих, фибрилл, можно , с одной: стороны, моделировать- структурно-функциональные взаимоотношения белков этого типа, а, с другой стороны, разрабатывать искусственные белки:- аналоги белков паутины с заранее заданными свойствами и-создавать на их основе: матер с различным сочетанием свойств прочности и эластичности,
В связи с этим: ряд: исследователей; попытались, выделить кДНК природных генов и\или получить генно-инженерные аналоги генов, кодирующих белки: паутины, и разработать эффективные системы, экспрессии, этих генов. Использование для:; этих целей бактерий/ не привело, однако, к; значительным успехам: выход целевого продукта бьит невелик, синтезировать белки размером более. 1000 аминокислотных остатков оказалось невозможным из-за преждевременной терминации трансляции, клонированные гены были нестабильны, вследствие своей периодической природы Несколько лучшие показатели были достигнуты/в случае использования дрожжей Piehia pastoris. Однако в этом случае успех ограничивалашроблема дорогостоящих: ферментации и сложной процедуры выделения искомых белков, из клеток—продуцентов. В "СВЯЗИ С: вышеизложенным, поиск и разработка новых эффективных систем экспрессии генов.; кодирующих бел ЇСИ;, шелка паутины являются актуальным- направлением исследований: В- качестве такой системы/ экспрессии могут быть предложены растения. Известно, что растения: в своем геноме стабильно1 поддерживают собственные протяженные гены с прямыми повторами и, эффективно синтезируют собственные еложные белки типа фибриллярных. Кроме того, р астения в качестве продуцентов обладают такими преимуществами, как наличие высокоэффективных методов трансформации, разработанных для многих видов растений, отлаженная технология сбора, хранения и переработки растительного материала- до их. использования, простота масштабирования производства. Помимо этого, использование природных полимеров позволит снизить токсичную нагрузку, оказываемую высокотехнологическими производствами, на природу.
Белки паутины
Пауки далеко не самые прекрасные живые существа на Земле, но, тем не менее, они привлекают внимание людей. Их способность создавать такие большие, по сравнению с размерами паука, паучьи сети правильной геометрической формы с ажурным рисунком, переливающимся на солнце, не может не вызывать восхищения. Пауки продуцируют 7 типов паучьего шелка, каждый из которых синтезируется в специализированной железе и обладает определенными механическими свойствами, которые строго специфичны выполняемым функциям. Пауки используют паучий шелк для самых разных целей: производства коконов для яиц, убежищ для зимовки, в качестве: «страховочного каната» при прыжках, ловчих сетей и многого другого.
В таблице 1.1. приведены семь различных типов нитей, образующихся у паука - кругопряда Nephila clavipes, функции каждой нити и железы, из которых они производятся,
Несмотря на то, что многие в жизни часто сталкивались с паутиной, мало кто знает о белковой природе нитей паутины, а также уникальных свойствах этого удивительного природного материала.
Паутинные нити - это упорядоченные белковые конгломераты, которые образуются в результате сложных физико-химических процессов и белок-белковых взаимодействий внутри соответствующих желез паука [Vollrath, 1999]. При этом, происходит необратимая трансформация белков паутины, из растворенного
Уникальность свойств 3TOFO природного материала заключается в том, что белки шелка: паутины сочетают в себе удивительную прочность и эластичность. По этим показателям они не имеют аналогов; как в природе, так и среди материалов, созданных человеком (табл; 1.2). Так, например, каркасная нить иаука-кругопряда Nephila davipes по значениям предела прочности на разрыв превышает сталь и сопоставима с кевларом, а по величине энергии разрыва превосходит его; в то же время она может растягиваться до 35% своей: длины [Wong Ро Еоо et aL, 2002]. Кроме этого, нить паутины производится в природе при нормальных условиях из водного раствора- в то время как для производства: стали требуется сложный-технологический процесс при очень высоких температурах.
Сформированные нити паутины нерастворимы в, большинстве растворителей,
в том: числе в воде, в разбавленных кислотах и щелочах [Tillinghast et al:, 1977; Tiffinghast, 1984], тидролизуются концентрированной серной: кислотой и: растворяются в; 9М бромиде лития без гидролиза [Melio et al., 1994]: Они1 также устойчивы к действию большинства протеолитичєеких ферментов и к. высоким температурам [BaraiUe et al:, 1988]:. Такая стабильность в природе напрямую связана:с тем, что:эти белки.являются типичными представителями фибриллярных белков. Этот тип белков, несомненно; обладает эволюционным, достоинством,; но в тоже время представляет большую: проблему для исследователей, занимающихся вопросом: получения7 белков- паутины ш vitro как- для: фундаментальных., так и прикладных исследований:
Еще:: одним; достоинством белков- нитей;: паутины является, их низкая: иммуногенносте, что/ дает возможность, использовать их. в медицине, например, при создании шовных материалов, искусственных связок и сухожилий;в хирургии; для микрохирургии и. т.д. При этом: они,: являясь белками, состоят только,- из природных аминокислот, что означает их безопасность: для: человека, по сравнению с синтетическими материалами.
Гены спидроина и их экспрессия в гетерологичпых организмах
Шелк дает новые возможности для создания биоматериалов и. инженерии ранозаживляющих пленок с широким, спектром механических свойств. Ранее работы: по формированию костей проводились с использованием: в качестве субстратов традиционных биоматериалов,, таких как. гидрокеиапатит, коллаген и PLGA (полилактатгликольная кислота): Однако; гидрокеиапатит не деградирует полностью; PLG-A может индуцировать воспаление из-за: продуктов кислотного: гидролиза, а проблемы с полиэстерами возникают из-за различил- скоростей гидролиза-, и: профилей ответа тканей; Последние данные демонстрируют удачное прикрепление и роет фибропластов- иа пленках из шелка, полученных от шелкопряда [Sofia, et al:, 2001]: Ответы остеобластов; на пленках из шелка подтверждают концепцию с том, что: эти белки- являются: пригодными матрицами для индукции-роста костей; Кроме TOFO на пленках" из шелка,успешно происходит прикрепление и рост клеток [Gotoh et al;f 1997];,.
Несмотря:: на то, что нити шелка: паутины обладают лучшими свойствами по сравнению с шелком,: получаемым от гусеницы шелкопряда; возможность их: получения: в больших количествах остается проблематичной. Хищническая пр ирода пауков (среди пауков распространен.: каннибализм) и относительно низкие уровни производств а-этих: белков по сравнению, например, с количеством шелка производимого, гусеницей шелкопряда Bbmbyx mori, мешают «одомашниванию» пауков: с. целью производства; нитей паутины, как это сделано; с: шелкопрядом. Поэтому получение промышленных количеств таких материалов возможно лишь с помощью генно-инженерных и биотехнологических методов.
К настоящему времени выделены и охарактериз ованы ряд генов, кодирующих белки паутины [Xu et а!., 1990; Hinman et al.,: 1992; Golgia et al.?. 1998; Hayashi et ah, 1999; Hiiemmerich et al., 2004; Ни et ah, 2005]. Эти гены относятся к наиболее протяженным.из известных цистронов (размеры мРНК составляют от 7,5 до-15,5 Т.ПІН.) и. состоят из большого числа тандемно повторяющихся протяженных последовательностей, которые различаются у разных генов [Guerette et ah, 1996].
Результаты по клонированию и анализу нуклеотидных последовательностей известных генов для различных белков шелка паутины позволили сделать. следующие1 выводы.: Во-первых, все известные гены шелка паутины имеют высокое содержание: GG-nap. Известно- что высокое:содержание GG-nap в составе ДНК является причиной возникновения специфической.вторичной структуры ДНК, что приводит к рекомбинации клонированных генов; поэтому возникают трудности с. генно-инженерными; манипуляциями., е такими последовательностями. Во-вторых, частым событием при синтезе таких белков в гетерол огичных организмах: является трансляционная пауза; возникающая вследствие, того, что большое содержание аланина и глицина:в:белках,.и соответственно преобладание этих кодонов в мРНК, требует поддержания большого- пула тРНК. для: этих аминокислот. Были предприняты попытки экспрессии кДНК природных генов, кодирующих белки каркасной нити паутины, в клетках:.Е. со It [Kaplan, 1992а]. Эти попытки оказались неудачными- вследствие различий кодонового состава кДНК генов спидроина: и Е.соїї. Впоследствии рядом, исследователей были- предприняты: попытки оптимизировать кодоновый состав кДНК [Arcidiacono: et al.s 1998]/ . Однако достигнутый уровень экспрессии также был достаточно.низким, что;1 по-видимому, объясняется, в первую очередь, несоответствием частоты встречаемости определенных аминокислотных кодонов в генах паука: и использованного микроорганизма-реципиента.
Более успешным оказался путь химико-ферментативного синтеза генов белков паутины с последующим клонированием в организм реципиента. Для этого, в основном; использовали консенсусную последовательность (или ее небольшие фрагменты) белка, каркасной нити [Prince et ah, 1995; Winkler etal:, 1999]. При этом применялась одна из- двух стратегий, известных как «конденсационная стратегия» и стратегия «последовательной полимеризации мономера». Суть «конденсационной: стратегии» заключается в том, что мономер; нарабатывается в больших количествах биоеинтетическим- путем, лигируется с образованием мультимеров, и затем лигат клонируется в экспрессиоиный вектор.:
Нуклеотидная последовательность синтетического гена спидроина и ее анализ с целью экспрессии в растениях
В:-- качестве: объектов исследования в нашей" работе использовались синтетические гены, кодирующие белки - аналоги природного белка каркасной нити паутины - спидроина 1, сконструированные ранее в лаборатории белковой, инженерии ФРУЇЇ FocHHH «Генетика». Структура мономера синтетического гена, представляющего собой аналог фрагмента природного гена, спидроина і паука Nephila davipes; была разработана, на основе кДНК этого гена, который, кодирует известную С-концевую последовательность белкового продукта [Xir et al:, 1990]. Для конструирования мономера синтетического t гена из длинной последовательности, кодирующей нативный спидроин, были: выбраны пять наиболее характерных блоков; повторяющихся последовательностей, отличающихся: друг от друга по составу и расположению делеций определенных аминокислотных, остатков (рис. 3:1:). С целью повышения уровня синтеза рекомбинантного белка в клетках: дрожжей нуклеотидный .состав и структура гена были модифицированы путем замены "редких" триплетов на кодоны, характерные для эффективно экспрессирующихся генов дрожжей, а количество внутренних повторов 1-гуклеотидных последовательностей сведено к минимуму [Богуш и др., 2000];
Размер сконструированного мономера составляет 405 пар нуклеотидов, что соответствует 135 аминокислотным остаткам, (рис. 3:2:). Дальнейшую: сборку мультимерного гена из: мономеров проводили путем: последовательного, удвоения.: мономеров: в-, составе плазмидных векторов,. В: результате процедур1 молекулярного клонирования.: были: сконструированы, синтетические гены, имеющие в.своем составе пять, девять и семнадцать повторив мономера гена спидроина 1, которые были, обозначены как 1/5\ 1/9 и 1/17, соответственно. Первоначально нашими коллегами было показано, что в составе, двурешшконой плазмиды синтетические гены 1/5 и 7/Р,. содержащие- 5 и: 9 мономеров, экспреесируются в: клетках модельных эукариот - дрожжах Saccharomyces cerevisiae. В результате экспрессии, этих генов происходит образование белковых продуктов с молекулярной массой около 50 кДа и 90 кДа,. которые соответствуют теоретически рассчитанным.
Как видно из представленных в таблице 3.1. данных, GG - содержание в: синтетическом гене .1/5 значительно выше, чем у генов всех рассмотренных видов.: растений, включая-однодольные.. G одной стороны; высокое содержание GG в нуклеотиднои последовательности синтетического гена; может оказать негативное влияние- на эффективную экспрессию этого гена в растениях. Известно, что Ср& динуклеотиды в норме являются, мишенью- для. метилирования ДЕОЕС в геномах позвоночных, и около; 70-80% Єр сайтов метилировано. Метилирование: ДНК у эукариот выполняет защитную функцию предохраняя- организм от чужеродной. ДНК и избытка, эндогенных повторяющихся последовательностей. Поскольку у эукариот не описано ферментов рестрикции, специфичных в отношении GpG-последовательноетей, предполагается, что такие защитные механизмы осуществляют-инактивацию чужеродной" ДНК, а не ее деградацию, как это имеет место- у бактерий: Экспериментально: установлено, что ДНК из внешних источников например: вирусная ДНК или ДНК введенная в клетки с помощью трансфекции, а также эндогенная- ДНК ретротранспозонов и повторяющихся последовательностей (в частности, LINE и SINE) могут быть объектами метилирования de novo, приводящего к их генетической;:инактивации. [Патрушев, 2000].
С другой: стороны, известно, что в- геномах млекопитающих имеются: протяженные последовательности, обогащенные: GG-парами, которые обозначают как CpG-островки. CpG-островки представляют собой GG-богатые. последовательности. (60-70% содержания; GC), длиной не менее 200 п.о. с большим . числом-динуклеотидов CpG, поддерживающиеся:в неметилированном; состоянии в клетках зародышей и нормальных соматических тканях;. В настоящее время-. непонятен механизм поддержания GpG-островков в неметилированном: состоянии, поскольку ДНК:метилаза обладает способностью; метилировать их. in- vitro. Єнитаетсяі что в: поддержании; неметилированного состояния юстровков участвуют специфические; белки; хроматина; Хроматин CpG.-островков не содержит гистона-НІ, а гистоньг. Н2 А и- Н2В : в этих участках хроматина недоацетилированы. Кр оме этого, CpG-островки часто-содержат сайты связывания фаісгора транскрипции Splj. который взаимодействует как с метилированными; так; и с: неметилированными сайтами, предотвращая их исходное или дальнейшее- метилирование. Полагают, что именно; этот фактор,может играть ключевую роль в постоянном; поддержании; ген ов «домашнего хозяйства» в неметилированном активном состоянии.
Получение и анализ растений картофеля, экспрессирующих синтетические гены спидроина
После того, как нами было показано, что геном модельного растения табака способен поддерживать в.своем составе синтетические гены паутины и-осуществлять их эффективную экспрессию, дальнейшие наши исследования были направлены на выяснение следующих вопросов: - Изменится ли уровень экспрессии синтетических, генов, имеющих повторяющиеся мотивы и: высокое содержание GC-nap, и. стабильность их белковых продуктов при; переходе от модельных пробирочных растений к реальным сельскохозяйственным культурам? - Изменится-ли уровень накопления спидроинов в, растениях в период вегетации и стабильность этих белков:: при хранении сельскохозяйственных культур?
Выяснение этих фундаментальных вопросов является важным и. необходимым условием для проведения дальнейших: биотехнологических разработок.
Выбор того или иного вида растений в качестве продуцентов гетерологичных белков обусловлен, прежде всего, экономичностью, а именно, в качестве продуцентов выбирают виды растений, которые могут выращиваться в условиях данного региона на больших площадях, для которых имеются технологии переработки растительного сырья: и для которых разработаны высокоэффективные методы трансформации.
В качестве растений - продуцентов белка паутины нами были выбраны растения картофеля - как одной из распространенных сельскохозяйственных культур нашего: региона. На данный момент в промышленности используется небелковая компонента клубней картофеля с целью получения крахмала. Использование белковой части клубней и листового материала, содержащего белок каркасной нити: паутины, предположительно должно удешевить процесс получения спидроина. Помимо этого, трансген в геноме, трансгенных. растений картофеля остается в гемизиготном состоянии, в силу вегетативного размножения этих растений; Это является преимуществом для получения стабильно высокого уровня экспрессии трансгена в поколениях этих растений [De Wilde et al., 2000].
В работе по трансформации растений картофеля использовали 3 сорта растений отечественной селекции: «Юбилей Жукова», «Жуковский ранний», «Десница». Основные характеристики использованных в работе сортов картофеля приведеныв работе Яшиной с соавторами [Яшина и др., 2000].
Отработка методов трансформации растений картофеля этих сортов включала этапы агробактериальиой трансформаций растительных эксплантов и отбор первичных трансформантов на селективных: средах. Разработка методов трансформации и селекция первичных трансформантов растений картофеля оказались наиболее продолжительными этапами работы. При агробактериальиой трансформации картофеля использовались стеблевые и клубневые экспланты растений картофеля, выращенных в условиях in vitro. В качестве основы метода трансформации растений картофеля применялись методические рекомендации сотрудника ИФР РАН ісб.н. Н.О. Юрьевой (см. раздел Материалы и методы).
Для трансформации растений картофеля использовали агробактериальные штаммы 35S-LicB, nptll, S5, S9, S17, T5 и Т9, несущие, соответственно, плазмиды p35S-fcBM2, pBISNl, , p35S-i/5-/z cBM2, p35S-//9-//cBM2: p35S-i/77-//cBM2;pTr2 -i/5-/zcBM2p и pTr2 -i/P-//cBM2? полученные ранее для трансформации растений табака (рис. З.Н.).
