Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 5
Получение растений, устойчивых к колорадскому жуку на основе
трансформации геном вт bacillus thuringienSIS 5
1.1. Биологические особенности bacillus thuringIENSIS. 5
1.2. Доменная организация эндотоксИНОВ 9
1.3. Механизм действия эндотоксинов bacillus thuringieNSIS 11
1.4. Применение культуры в. thuringiensis в качестве инсектицида 13
1.5. Клонирование и экспрессия гена, кодирующего токсин В. THURINGIENSIS. 15
1.6. Изучение функциональной роли а-спирллЕй 17
1.7. Генная инженерия генов токсинов в. thuringiensis 19
1.8. Введение cry генов в геном растений /25
1.9. Придание устойчивости растениям посредством бактериального гена изопентенил-трансфер азы (ірт) 32
1.10. Гены хозяйской специфичности агробактерий 32
ГЛАВА 2. материал и методы 46
2.1. Материал 46
2.2. Методы 53
Агробактериальная трансформация в оптимальных для регенерации условиях 53
2.2.1. Поддержание растительного материала 53
2.2.2. Подбор сред для регенерации и характеристика сортов картофеля по регенерационной способности . 54
2.2.3. Получение трансгенных растений картофеля 58
2.2.4. Выделение растительной ДНК. 60
2.2.5. Выделение ДНК агробактерий 60
2.2.6. Полимеразная цепная реакция 61
2.2.7. Оценка устойчивости картофеля к колорадскому картофельному
оюуку. 61
2.2.8. Статистическая обработка результатов. 62
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 63
3.1. Характеристика сортов картофеля in vitro по регенерлционпои
способности 63
3.1.1. Морфофизиологическая характеристика каллусов in vitro 63
3.1.2. Регенерация побегов на клубневых эксплантах in vitro 72
3.2. Получение трансгенных растений картофеля с генами вт и ірт 80
3.3. Анализ трансгенных линий картофеля с генами вт и ірт на устойчивость к колорадскому картофельному жуку.: 89
Заключение 98
Выводы 104
Приложение 119
- Механизм действия эндотоксинов bacillus thuringieNSIS
- Придание устойчивости растениям посредством бактериального гена изопентенил-трансфер азы (ірт)
- Подбор сред для регенерации и характеристика сортов картофеля по регенерационной способности
- Морфофизиологическая характеристика каллусов in vitro
Введение к работе
Разработка эффективных методов регенерации, изучение процессов
морфогенеза in vitro особенно необходимо для важнейших сельскохозяйственных культур. Это обусловлено тем, что данные процессы лежат в основе фактически всех современных биотехнологических методов -будь то клональное микроразмножение, оздоровление посадочного материала, клеточная селекция или трансформация. Ранее в литературе многократно обсуждался вопрос об зависимости процессов регенерации in vitro от генотипа .
Показано также, что и интенсивность трансформации определяется генотипом растения и зависит от штамма бактерии, с помощью которого осуществлен этот процесс. Однако работы по зависимости трансформация -генотип - штамм бактерии были выполнены в основном с использованием разнообразных штаммов агробактерий дикого типа. В настоящее время, когда в мировой практике стоит проблема получения трансгенных растений, устойчивых к абиотическим и биотическим факторам среды, все еще остаются нерешенными вопросы о роли сорта и коммерческих штаммов, во всем их многообразии, в эффективности трансформации. Хорошо известно, что в результате трансформации даже в пределах одной пары сорт — штамм можно получить широкий круг изменчивости, как результат случайного встраивания Т-ДНК в геном растения. Поэтому, для получения трансгенного растения с заданными свойствами необходимо иметь большое число трансгенных растений, среди которых возможно провести направленный отбор.
Все выше сказанное указывает на необходимость, проведения исследований направленных на выявление причин, определяющих эффективность трансформации, к которым в первую очередь следует отнести подбор генотипа растения, штамма бактерии (вектора), а также условий, таких как питательная среда, тип экспланта.
'и
Целью работы явилось - изучение взаимодействия: генотипа растения и штамма бактерии, при получения растений, устойчивых к вредителям-посредством трансформации генами Bt токсина (Bacillus thuringiensis) и ipt (Agrobacterium tumefaciens). В задачи работы входило:
Изучение виутривидововой изменчивости по способности к регенерации in vitro среди сортов рекомендованных к возделыванию в Ленинградской области и выявление условий при которых этот процесс максимально выражен.
Изучение изменчивости по интенсивности трансформации сортов картофеля в зависимости от штамма бактерии.
Получение коллекции трансгенных растений картофеля, на основе сортов, рекомендованных к возделыванию в условиях Ленинградской области, несущих бактериальные гены npt II, ipt, Bt.
Анализ форм из коллекции трансгенных растений картофеля по устойчивости к колорадскому картофельному жуку.
Механизм действия эндотоксинов bacillus thuringieNSIS
При попадании в кишечник насекомого белковый кристалл растворяется в щелочной среде кишечного сока (рН 9.5-10.5); растворенные протоксины активируются протеолитическими трипсино- и химотрипсиноподобными ферментами кишечника до "истинных токсинов" (рис.4).
Следующей стадией токсического воздействия является связывание "истинного токсина" с аффинным к нему белком (рецептором), экспонированным на поверхности апикальных мембран эпителиальных клеток кишечника. Связывание токсина с рецептором является обратимым (Hofmann, Luthy, 1986; Hofmann et al., 1988). На следующей стадии происходит перестройка конформации молекулы токсина с последующим внедрением некоторых из формирующих её структур в мембранный бислой. После этого связывание токсина с мембраной становится необратимым (Ihara et al., 1993). Внедрение сс-спиралей первого домена в мембрану чувствительной клетки необходимо для того, чтобы связывание стало необратимым, и доказывается это тем, что неполноценная молекула токсина, состоящая только из П-го и Ш-его доменов, связывается с мембраной только обратимо.
По всей видимости, одновременно с внедрением в мембрану происходит ассоциация нескольких молекул токсина (Masson et al., 1999). Ансамбль трансмембранных участков, принадлежащих нескольким ассоциированным молекулам токсина, образует (в зависимости от конкретной пары токсин/мембрана) пору, или ионный канал. В первом случае (образование поры), происходит гибель клеток по механизму коллоидно-осмотического лизиса и в результате утечки значительной части клеточного АТР. Во втором, (образование ионного канала) - в ходе резкого изменения ионного состава и рН внутриклеточной среды. Примерно через 15 мин после формирования такого комплекса клеточный метаболизм блокируется, насекомое перестает питаться, происходит обезвоживание организма и в конечном счете наступает смерть.
Штамм В, thuringiensis subsp. kurstaki был выделен в 1901 г., но интерес к нему как к ценному коммерческому продукту возник лишь в 1951 г., а за последние десять лет эта бактерия стала основным инструментом контроля численности гусениц листовертки-почкоеда елового в Канаде. В 1979 г. лишь над 1% лесов Канады, обрабатываемых инсектицидами с целью уничтожения этого насекомого (что соответствует примерно 2 млн. га), распыляли В, thuringiensis subsp. kurstaki; остальные площади обрабатывали химическими инсектицидами. К 1986 г. масштабы использования В. thuringiensis subsp. kurstaki возросли до 74%. В других странах В. thuringiensis subsp. kurstaki используют для борьбы с коконопрядом, непарным шелкопрядом, мертимидами, совкой капустной и бражником. Основное препятствие на пути еще более широкого применения В. thuringiensis subsp. kurstaki состоит в его дороговизне: стоимость такого препарата в 1,5—3 раза выше, чем химических инсектицидов.
Для биоконтроля численности насекомых-вредителей распыляют 1,5x109—2,5x109 спор В. thuringiensis subsp. kurstaki на каждый квадратный метр обрабатываемого участка. Обработку проводят в тот период, когда число личинок в популяции насекомого-мишени максимально, Однако в том случае, когда В. thuringiensis subsp. kurstaki использовали в качестве инсектицида в условиях малой освещенности (например, в зернохранилищах), через несколько генераций появлялись устойчивые к токсину насекомые. Одна из причин такой передаваемой по наследству устойчивости заключается в изменении мембранного белка клеток кишечника, в норме выполняющего функцию рецептора токсина В. thuringiensis subsp. kurstaki. Возможно, она возникает вследствие того, что в этих условиях протоксин не разрушается и служит фактором отбора. Из всего этого следует, что появления насекомых, устойчивых к В. thuringiensis subsp. kurstaki, проще всего избежать, если ограничить применение данного микроорганизма полевыми условиями. Впрочем, имея в виду масштабы использования В. thuringiensis, нельзя исключить, что может произойти его накопление в среде в количестве, достаточном для того, чтобы вступил в действие механизм отбора. А поскольку В. thuringiensis используется все более широко в разных регионах, вероятность появления популяций устойчивых насекомых будет увеличиваться (Van Rie et al., 1990).
Способ действия токсинов В. thuringiensis налагает некоторые ограничения на область их применения. Чтобы убить насекомое, токсин В. thuringiensis обязательно должен попасть в его кишечник, в противном случае никакого эффекта не будет. В. thuringiensis чаще всего распыляют, причем бактерии обычно смешивают с атрактантами насекомых, чтобы повысить вероятность того, что насекомое-вредитель проглотит токсин. Однако для насекомых, обитающих в тканях растений или на корнях, токсин В. thuringiensis при такой обработке вряд ли будет представлять какую-либо опасность.
Второе ограничение, налагаемое на применение токсина В. thuringiensis, связано с тем, что этот токсин действует на насекомое, находящееся только на определенной стадии развития. Именно в этот момент и должна проводиться обработка. С учетом всего этого были предприняты попытки разработать другие стратегии защиты растений от таких вредителей. Один из подходов состоит в создании трансгенных растений, несущих и экспрессирующих ген токсина В, thuringiensis и, следовательно, защищенных от насекомых-вредителей в течение всего периода вегетации. Важнейшей вехой на пути широкого использования токсина В. thuringiensis для целей генетической инженерии, послужила работа Шнепфа и Уайтли (Schnepf, Whiteley, 1981) Когда Шнепф и Уайтли решили идентифицировать токсиновые гены В. thuringiensis, детальных протоколов генетической трансформации еще не существовало им пришлось проводить скрининг трансформантов Е. coli, несущих ДНК В. thuringiensis, с помощью иммунологических методов с использованием антител к целому кристаллу или путем определения инсектицидной активности экстрактов трансформантов. К тому времени были получены некоторые указания на то, что гены токсинов расположены в плазм ид е, чтобы проверить гипотезу плазмидной локализации, штамм В. thuringiensis, продуцирующий токсин, конъюгировали со штаммом, не обладающим инсектицидной активностью. Передача хромосомной ДНК во время конъюгации происходит крайне редко, поэтому приобретение штаммом способности синтезировать инсектицид, интерпритировали как подтверждение локализации гена, кодирующего токсин в плазмиде.
Придание устойчивости растениям посредством бактериального гена изопентенил-трансфер азы (ірт)
Поскольку метод агробактериальной трансформации является одним из основных для привнесения в растение генов устойчивости, представляется важным подбор условий для наиболее эффективной агробактериальной трансформации различных объектов. В значительной степени этому будет способствовать привлечение агробактериальных штаммов, котрые характеризуются максимальной трансформирующей активностью для каждого конкретного объекта. Изучение генов хозяйской специфичности (ХС) агробактерий является одним из основных шагов на этом пути.
Круг хозяев Agrobacterium spp, чрезвычайно широк по сравнению с другими патогенными для растений бактериями. Путем искусственного заражения агробактериями можно индуцировать опухолеобразование у большинства двудольных, у ряда голосеменных и у некоторых однодольных растений. Однако, оказалось, что у некоторых растений, например, у однодольных, опухоль не образуется, хотя перенос Т-ДНК и ее интеграция в геном происходят нормально. Такие растения предложено называть «молчащими хозяевами» (Jarchow et al., 1991). Способность агро бактерий заражать широкий круг растений удивительна, если представить сложность и многоэтапность процесса опухолеобразования, связанного с переносом Т-ДНК. Возможность переноса Т-ДНК из агробактернй :в дрожжи в лабораторных.-условиях (Bundock et al., 1995) свидетельствует о том, что в процессе переноса Т-ДНК используются фундаментальные свойства эукариотических клеток. Однако отдельные изоляты Agrobacterium различаются кругом хозяев, и даже штаммы с широкой хозяйской специфичностью не могут индуцировать опухоли на всех растениях.
Ограничения хозяйской специфичности Agrobacterium spp. определяются многими причинами. Во-первых, перенос Т-ДНК может не осуществляться в случаях: 1) плохого роста и/или выживаемости бактерий на ранке растения, 2) отсутствия индукторов vir-генов или сайтов прикрепления бактерий к растительной клетке, 3) мутаций в vir-генах, приводящих к дефектам процессинга или транспорта Т-ДНК. Далее, при нормально проходящем переносе опухоль может не образоваться из-за неспособности Т-ДНК к интеграции в геном растения, потери части генов Т-ДНК, слабой или чересчур интенсивной экспрессии генов Т-ДНК. Реакция разных растений на трансформацию может быть следствием различий в балансе фитогормонов, поскольку чувствительность к изменениям их уровня варьирует. Специфичность Agrobacterium spp. к растениям может проявляться на видовом и на генотипическом (сортовом) уровнях, она может быть связана с физиологическими или анатомическими особенностями растений. Некоторые растения могут быть нечувствительны к гормональным стрессам, которые возникают при экспрессии Т-ДНК, и поэтому не формируют опухолей, а другие могут обладать повышенной чувствительностью, и у них в ответ на заражение развиваются некрозы. Реакция на трансформацию Agrobacterium spp. может зависеть и от стадии развития растения, на которой произошло заражение. Таким образом, тип плазмиды, хромосомный фон бактерии и взаимодействие между хромосомой и плазмидой, а также свойства растений вносят свой вклад в ограничения специфичности взаимодействия. Как будет показано ниже, вклад многих бактериальных факторов достаточно подробно изучен, тогда как растительные детерминанты еще мало известны.
Хотя род Agrobacterium в целом и некоторые штаммы в отдельности характеризуются очень широким кругом растений-хозяев, у индивидуальных штаммов и изолятов хозяйская специфичность, как правило, ограничена. Очень узким кругом растений-хозяев характеризуются некоторые штаммы A, vitis, выделенные из опухолей винограда (Panagopoulos, Psallidas, 1973). Дальнейшие исследования показали, что в определении хозяйской специфичности Agrobacterium играют роль ряд локусов Ti-плазмиды, влияющих либо на эффективность индукции vir-генов, процессиига или переноса Т-ДНК, либо на структуру Т-ДНК. Одним из самых ранних этапов опухолеобразования, индуцируемого агробактериями, является обнаружение поранения на растении. Оно служит сигналом для активации двухкомпонентиой системы VirA/G. Белок VirA, расположенный на внутренней мембране, чувствителен к специфическим фенольным компонентам и к изменениям внешних условий. Следует отметить, что белки VirA разных агробактериальных штаммов, по-видимому, предпочтительно воспринимают разные фенольные компоненты (Lee et al., 1995). Поскольку многообразие, количество и соотношение фенольных соединений, экскретируемых растениями при поранении, варьирует в зависимости от вида, вполне допустимо, что ген virA каждого штамма отвечает за специфичность растения хозяина.
Действительно, у некоторых агробактериальных штаммов ген virA, по-видимому, является основным детерминантом хозяйской специфичности.: Об этом говорят данные, полученные при изучении штаммов A , vitis с узкоц,, хозяйской специфичностью (УХС-штаммы) (Panagopoulos et al., 1978; Knauf et al., 1983). У одного из таких штаммов, Agl62, количество потенциальных хозяев может быть расширено за счет введения гена virA из ШХС-штамма (Yanofsky et al, 1985). Помимо фенольных соединений, белок VirA с помощью периплазматического белка ChvE, кодируемого хромосомным геном, (Cangelosi et al., 1990) воспринимает моносахариды. Сначала с сахарами соединяется ChvE, затем он взаимодействует с VirA, и в присутствии фенольных соединений они совместно индуцируют экспрессию vir-генов. У мутантов по гену virA, потерявших способность к взаимодействию с ChvE, круг хозяев сужается (Doty et al., 1996). Фенотип у таких мутантов такой же, как и у штаммов с мутацией в гене chvE (Doty et al., 1996; Huang et al., 1990). Такие факторы внешней среды, как температура и рН, могут влиять на индукцию vir-генов агробактерий также через белок VirA (Turk et al., 1991; Jin etal., 1993a). Важную роль белка VirA в определении хозяйской специфичности подтвердили эксперименты по агроинфекции однодольных, в особенности, кукурузы. Показано, что способность к агроинфекции у кукурузы, риса и пшеницы зависит от используемой Ti/Ri-плазмиды (Jarchow et al., 1991; Dasgupta et al,, 1991). Главное различие в способности к агроинфекции между штаммами заключалось в рецепторе растительных сигналов. Предполагается, что белок VirA октопинового типа не индуцируется или его активность подавляется в присутствии экстрактов кукурузы. Это предположение подтверждается тем, что у мутантных по гену virA октопиновых штаммов, не зависящих от ацетосирингона и экспрессируюших Vir-гены даже в отсутствие растительных сигналов (Ankenbauer et al., 1991), способность к агроинфекции очень высока.
Подбор сред для регенерации и характеристика сортов картофеля по регенерационной способности
Сопоставляя полученные данные можно сделать следующие заключения. Как правило, регенерация проходила через стадию каллуса. Однако, в редких случаях образования каллуса отмечено не было. Регенерация была прямой. В целом следует отметить, что в условиях эксперимента на эксплантах всех сортов при трансформации использованными штаммами, наблюдали высокий процент каллусообразования, который колебался в среднем от 40 до 90%. Наиболее важным в данных опытах, является способность к регенерации побегов. В зависимости от штамма, которым была осуществлена трансформация, сорта значительно различались по регенерационной способности. Как и в предыдущих экспериментах максимальной регенерационной способностью характеризовался сорт Невский (рис. 13). Процент побегообразования, например, при трансформации штаммом с геном, определяющим устойчивость к канамицину, достигает 100. Относительно высокий процент побегообразования также наблюдался у сортов Елизавета и Рождественский. Экспланты сортов Санта, Луговской, формировали лишь единичные побеги при трансформации, как и в случае экспериментов по регенерации in vitro.
Таким образом, ранее проведенный нами отбор генотипов по регенерационной способности является важным этапом при подборе сортов для трансформации, особенно если целью экспериментов является получение максимального числа трансформированных растений. В литературе неоднократно отмечалось, что растительные клетки компетентные к регенерации оказываются компетентными и для трансформации (Шарова 1992) Однако, выявленную изменчивость по способности к трансформации кроме роли генотипа в этом процессе, можно дополнить и объяснить другими причинами. Например, причиной изменчивости может быть разная чувствительность клеток сортов картофеля к веществам, возникающим при закономерной гибели части нетрансформированных тканей на среде с канамицином или разная их устойчивость к клафорану. Таким образом, показано, что уровень регенерационной способности, выявленный в экспериментах in vitro, в целом соответствует уровню регенерации побегов при трансформации. Кроме того, для картофеля нами подтверждена, продемонстрированная ранее в нашей лаборатории в работах на горохе зависимость эффективности трансформации от штамма агробактерии. Полученные в экспериментах по трансформации побеги, были укоренены на среде МСО. В ходе укоренения и перенесения растений в условия теплицы и поля нам не удалось сохранить все трансгенные растения. Однако, мы получили небольшую коллекцию трансгенных растений, содержащих различные бактериальные гены (табл.7). От 15 трансгенных растений получено клубневое потомство.
Таким образом, в ходе экспериментов выявлена изменчивость среди сортов картофеля по способности к трансформации. Показано, что сорта, интенсивно регенерирующие in vitro, также характеризуются высокой способностью к трансформации. Кроме того, показана зависимость трансформации от штамма бактерии. В экспериментах, проведенных в нашей лаборатории ранее уже было показано, характер и интенсивность трансформации зависит от штамма агробактерии. Работы были выполнены на горохе посевном (Лутова и др.,1998). К такому же выводу пришли и другие исследователи (Yanofsky et al.,1985). Однако, в ранних экспериментах были использованы агробактериальные штаммы с плазмидами дикого типа. В наших экспериментах использованы штамы, несущие плазмиды с различными бактериальными генами. Тем не менее, результаты повторились — интенсивность трансформации определяется не только генотипом растения, но и штаммом бактерии. Итак при подборе оптимальных условий для трансформации необходимо учитывать такие параметры как генотип растения, штамм агробактерии и условия в которых трансформация проводится.
Линии картофеля, трансгенность которых была доказана с использованием селективной среды и методом ПЦР, были переведены в условия in vivo. Материал был вегетативно размножен (получены клубни). Из клубней на опытном поле Всероссийского НИИ биологической защиты растений (Краснодар), были выращены растения картофеля, которые анализировали на устойчивость к колорадскому картофельному жуку. В эксперименте участвовало по 10-20 растений от каждой линии. Родоначальником каждой линии являлось одно независимо полученное трансгненное растение. В качестве контроля использовали формы, трансформированные обеззаруженным вектором, содержащим только селективный маркер для отбора трансгенных растений in vitro (Pnos:nptII), а также исходные сорта.
Пораженные колорадским жуком растения оценивали в динамике. Для каждого срока учета расчитывали процент пораженных растений. Результаты представлены на графиках (Рис 19 -23) На контрольных растениях личинки и взрослые особи жука появлялись к первому сроку учета и начинали повреждать ткани растения. Степень повреждения увеличивалась в течение вегетации растений и к третьему сроку учета растения повреждались полностью. Поврежденные жуком растения к середине лета (16 июля), стояли практически полностью без листьев. У таких растений клубни не развивались, часто неустойчивые растения погибали. По степени устойчивости к колорадскому жуку различались как трансгенные растения так и исходные сорта. Например, контрольные растения сорта Невский характеризовались большей по сравнению с растениями других сортов устойчивостью, однако, к последним срокам учета растения сорта Невский также оказались пораженными. Следует отметить, что согласно биологии развития жука (см. приложение), на территории Ленинградской области, которая относится к четвертой (наиболее северной) зоне обитания колорадского жука, массовый выход жука из почвы смещен в среднем на полтора месяца относительно территорий на которых расположен исследовательский полигон (первая климатическая зона расселения). Поэтому на территории Ленинградской области пик агрессивности колорадского жука приходится на более поздние сроки. Исходя из того, что на территории Краснодарского края первые атаки колорадского жука растения сорта Невский выдерживают, в условиях Ленинградской области можно ожидать достаточно высокой устойчивости этого сорта вплоть до окончания вегетации (формирования урожая). Таким образом, сорт Невский можно признать относительно устойчивым к колорадскому жуку в агроклиматических условиях Ленинградской области, что подтверждается и данными (Саулич, 1999).
Морфофизиологическая характеристика каллусов in vitro
Менее чем за 300 лет своей Российской истории картофель прошел путь от насильственного внедрения в начале XVIII века и до нашего времени, когда картофель стал важнейшей стратегической агрокультурой. Широкое распространение картофеля в мире и в России обусловлено его удивительными питательными свойствами клубней, содержащими углеводы, витамины и незаменимые аминокислоты. Картофель относится к культурам легко возделываемым и характеризуется высокой адаптационной способностью к широкому спектру природных условий. Однако, картофель -культура, в значительной степени подверженная поражению различными патогенами: грибами, бактериями, вирусами. Среди вредителей картофеля на первом месте по вредоносности стоит колорадский картофельный жук: впервые появившись на полях нашей страны около 50-ти лет назад, он распространился на площади около 3 млн.га. Жуки и личинки повреждают листья картофеля, а при массовом заражении уничтожают всю надземную часть растения. Потеря урожая может достигать 90% в зависимости от сорта. Сегодня к арсеналу традиционных методов борьбы добавлены и новые биотехнологические методы, основанные на достижениях клеточной и генной инженерии.
Картофель наряду с табаком был одним из первых растений, подвергшихся генетической трансформации с применением почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens. С большей или меньшей эффективностью картофель удалось регенерировать, подвергая трансформации клубневые диски (Shermann, Bevan, 1988) или молодые листья. Однако спектр генотипов (сортов), на которых велись работы, был ограничен несколькими легко трансформируемыми сортами (Davis, 1996).
За время, прошедшее с момента получения первых трансгенных растений картофеля (1986), уже опубликовано более ста работ, основной целью которых была оптимизация процесса генетической трансформации. Чем можно объяснить такой неослабевающий интерес к модификации казалось бы уже налаженного метода? Это связано с тем, что спектр успешно трансформируемых сортов картофеля ограничен. В основном это сорта американской селекции Russet Burbanc, Atlantic, Superior и голландской селекции — Desirec.
Создание генетически модифицированного растения подразумевает связь между процессом собственно трансформации и последующей регенерации целого растения. Как и для большинства видов этот процесс генотип-зависим (Лутова 2003, Wordragen et al., 1993). Кроме того, эффективность получения трансгенного растения от конкретного генотипа зависит от сочетания множества факторов. Ранее, в работах нашей лаборатории (Лутова и др. 1998) уже была выявлена зависимость эффективности трансформации для ряда объектов от сочетания генотип - штамм, а также от условий культивирования. От исследователя, намеревающегося получить новую генетически модифицированную форму, требуется учитывать и оптимизировать сумму параметров, В решении данной проблемы возможны два подхода: если необходимо трансформировать один или максимум два сорта, то возможен подбор оптимальных условий трансформации — регенерации под каждый сорт. Если же стоит задача трансформировать несколько сортов, то правильнее разработать универсальную для многих сортов систему трансформации — регенерации. Усилия нашей работы были направлены с одной стороны на поиск генотипов (сортов) с максимальной способностью к трансформации -регенерации, а с другой стороны подбор унифицированных подходов для, целого ряда сортов, районированных в условиях Ленинградской области. Анализируя сорта картофеля отечественной селекции по способности к регенерации нам удалось выявить и описать новый признак " тип каллуса", развивающийся на клубневых эксплантах. Сорта значительно различались по способности формировать тот или иной тип каллуса. Наиболее значимым для нас оказалось, что интенсивность регенерации побегов зависит от типа каллуса. Например, на каллусах типа " наплыв" никогда не образуются растения -регенеранты, а на каллусе типа "сфероид" этот процесс происходит достаточно эффективно. Таким образом, регенерационный потенциал сорта можно определить на ранних этапах культивирования эксплантов и по признаку "тип каллуса", как маркерному, отобрать интенсивно —регенерирующие генотипы. Итак, признак " тип каллуса" можно использовать для раннего прогнозирования и отбора генотипов для трансформации и последующей регенерации. Следует обратить внимание на то, что тип каллуса определяется не только генотипом, но и содержанием фитогормонов в питательной среде. Это значит, что изменяя условия культивирования (состав фитогормонов) можно индуцировать каллус определенного типа для последующей успешной регенерации.
В экспериментах на различных сортах картофеля мы подтвердили, полученные ранее данные о связи процессов регенерации и трансформации (Лутова и др. 1998, Глик, Пастернак, 2002). Сорта характеризующиеся высокой регенерационной способностью также хорошо трансформируются, так как клетки компетентные к регенерации компетентны и к трансформации. Нашла подтверждение и высказанная нами ранее гипотеза о зависимости эффективности трансформации от штамма агробактерии. Новым явилось то, что в данном исследовании для трансформации мы использовали не штаммы дикого типа, а векторные конструкции.
