Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Подходы к изучению и созданию устойчивости. Искусственно детерминированная устойчивость растений к вирусам
1.1.1. Устойчивость, обусловленная встраиванием генов вирусного происхождения (pathogene-derived resistance)... 10
1.1.1.1 Устойчивость, детерминированная встраиванием гена белка оболочки вируса 11
1.1.1.2. Устойчивость, обеспечиваемая встраиванием гена репликазы 12
1.1.1.3. Устойчивость, определяемая встраиванием гена транспортного белка 13
1.1.1.4. Введение в геном растений вирусных нуклеотидных последовательностей. 13
1.1.1.5. Проблемы, связанные с использованием PDR-трансгенов, и перспективные направления PDR-защиты растений 15
1.1.2. Устойчивость, основанная на использовании механизмов замолкания 20
1.1.3. Создание устойчивости с использованием генов растений 23
1.1.4. Устойчивость, обеспечиваемая встраиванием гетерологичных, «экзотических» генов 25
1.1.4.1. Введение генов белков, инактивирующих рибосомы... 26
1.1.4.2. Введение генов нуклеаз 28
1.1.4.3. Использование генов иммунной системы животных. 29
1.1.4.3.а. Введение генов интерферонов 30
1.1.4.3.b Введение компонентов 2-5А системы 30
1.1.4.З.С. Введение генов, кодирущие антитела 32
1. 2. Двунитевая РНК в организме животных и растений 34
1.2.1. Важнейшие свойства PTGS 37
1.2.2. Общий механизм PTGS 37
1.2.3. РНК-зависимое метилирование ДНК и транскрипционное умолкание генов 43
1.2.4. Микро РНК (miRNA) растений 47
1.2,4,1. Происхождение и структура miRNA 47
1.2.4.2. Механизм действия и функции микроРНК 49
1.2.5. Генетический контроль процессов PTGS /РНК-интерференции и связанного с ними метилирования у растений „ 51
1.2.6. Проблемы неспецифичности действия дцРНК 55
Глава 2. Материалы и методы 58
2.1. Штаммы бактерий 58
2.2. Плазмиды 58
2.3. Растения , 58
2.4. Штаммы вируса табачной мозаики 58
2.5. Ростовые среды 58
2.6. Получение бинарного агробактериального вектора 59
2.7. Получение трансгенных растений 59
2.7.1. Трансформация табака 59
2.7.2. Процедура трансформации пшеницы 60
2.7.3. Отбор трансгенных растений табак, устойчивых к канамицину
2.7.4. Тестирование на устойчивость к канамицину потомства трансформантов пшеницы " *
2.8. Молекулярно-биохимические исследования 61
2.8.1. Выделение ДНК и РНК из растительных тканей 61
2.8.2. ПЦР 61
2.8.3. Саузерн и Нозерн гибридизация 63
2.9. Исследование растений на вирусоустойчивость 63
2.9.1. Процедура заражения 63
2.9.2. Оценка устойчивости 64
2.9.3. Экстракция белков листьев 64
2.9.4. Электрофорез растворимых белков листьев 64
2.10. Анализ белков 65
2.10.1. Гидролиз белка 65
2.10.2. ВЭЖХ триптических пептидов 65
2.10.3. Секвестрование пептидов 66
2.11. Статистическая обработка и компьютерный анализ 66
Глава 3. Результаты и обсуждение.
3.1. Трансформация растений табака и исследование трансгенных растений табака
3.1.1. Характеристика Т-ДНК экспрессионноговектора 67
3.1.2. Получение трансгенных растений табака 69
3.1.3. Наследование трансгенной вставки 72
3.2. Исследование вирусоустойчивости трансгенных растений табака 76
3.2.1. Изучение фитопатологических характеристик трансгенных растений 76
3.2.2. Изучение спектра растворимых белков 79
3.3. Исследование морфо физиологических характеристик трансформантов табака , 85
3.4. Трансформация пшеницы 90
3.4.1. Выделение трансформантов пшеницы 90
3.4.2. Наследование трансгенной вставки 93
3.4.3. Анализ на отсутствие агробактерий 95
3.4.4. Тестирование на устойчивость к канамицину 97
3.4.5. Эффективность трансформации пшеницы 98
3.4.6. Изменения признаков у трансформантов пшеницы Т2... 100
3.4.7. Наследуемость изменения признаков 100
Заключение 109
Выводы 113
Список литературы 115
- Подходы к изучению и созданию устойчивости. Искусственно детерминированная устойчивость растений к вирусам
- Штаммы бактерий
- Трансформация растений табака и исследование трансгенных растений табака
Введение к работе
Устойчивость к вирусным заболеваниям растений является одной из наиболее актуальных проблем современной генетики, биотехнологии и физиологии растений. Раскрытие сложных механизмов взаимодействия хозяина и патогена, процессов, приводящих к формированию иммунитета у растений, выделение генов, контролирующих разные этапы этих процессов - все это представляет не только теоретический, но и прикладной интерес. С применением методов генной инженерии удалось не только детально исследовать особенности физиологии вирусов растений, но и создать устойчивые к вирусным инфекциям формы: трансгенные растения, экспедирующие ген белка оболочки вирусов (Powell-Abel et al., 1986), геном транспортного белка (Malyshenko et al., 1993) и генсЦ репликазы (Golemboski et al,, 1990), Несмотря на успехи и практические достижения в этой области, молекулярно-генетические процессы, отвечающие за формирование различных типов устойчивости, изучены далеко не полностью. С 80-х годов прошлого века в поле научного интереса исследователей иммунитета растений попала двунитевая РНК. Было показано, что двунитевая РНК, в том числе и синтетическая (поли-I) участвует в формировании устойчивости растений к вирусам (Gat-Edelbaum et al., 1983; Бистрицкайте, 1986). Создание трансгенных растений, экспрессирующих антисмысловые последовательности вируса и обладающих устойчивостью к нему (как предполагалось, за счет образования дуплекса РНК с геномной РНК вируса) положило начало отдельной «антисмысловой» стратегии создания устойчивости (Izant, Weintraub, 1984; Powell et al., 1989; Bejarno et al., 1992). В 1998-1999 г. В серии работ Гамильтон и Болкомб раскрыли механизм РНК-интерференции (Hamilton A.J, Baulcombe D.C., 1999), показав ключевую роль рестрикции двунитевой РНК в ингибировании экспрессии генов, обладающих гомологией с последовательностью такой же РНК. Хотя нокаутная"' с использованием антисмысловых РНК при создании вирусоустойчивых растений нашла практическое применение еще до открытия молекулярной сути процессов, лежащих в ее основе, многие аспекты проявления РНК-
7 интерференции у растений и ее влияние на экспрессию генов хозяина по настоящее время остаются неисследоваными.
Поэтому представлялось интересным исследовать влияние эндогенно синтезируемой в растении протяя^енной двунитевой РНК, не имеющей гомологии с геномом растения и геномом вируса, на устойчивость растений к вирусам. В качестве трансгенной кодирующей последовательности, экспрессируюгцей днРНК, для предотвращения эффекта умолкания генов растения был использован фрагмент бактериального гена.
Цели работы:
Целью работы явилось изучение влияния гетерологичной конструкции, обеспечивающей в растении синтез двунитевой РНК, не несущей гомологии с геномами вирусов и растений, на устойчивость трансгенных растений к вирусным заболеваниям, а также исследование влияния этой гетерологичной вставки на морфофизиологические признаки однодольных и двудольных растений (Nicotiana tabacum и Triticum aestivum).
Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи: получить путем агро бактериальной трансформации трансгенные растения табака и пшеницы, несущие конструкцию, детерминирующую в растении синтез протяженной (0,35 тпн) двуцепочечной РНК; провести изучение генетической стабильности данной вставки в трансгенных растениях; провести изучение вирусоустойчивости трансгенных растений табака к разным штаммам ВТМ; исследовать изменения в спектрах растворимых белков листьев трансгенных растений табака при инфицировании их вирусом; провести сравнительное исследование морфо физиологических признаков трансгенных растений с оценкой их наследуемости.
Подходы к изучению и созданию устойчивости. Искусственно детерминированная устойчивость растений к вирусам
Вирусы растений очень разнообразны по своей структуре, способам репликации и передачи, а также по патогенным эффектам на организм. Поэтому неудивительно, что в процессе эволюции в растениях возникли множество разнообразных сигнальных систем, узнающих различные патогены, и механизмов устойчивости, многообразие которых рассматривается в ряде обзоров и монографий (Ладыгина, Бабоша. 1996; Тарчевский, 2001; Тарчевский, 2002). Выделяются следующие уровни изучения устойчивости:
- популяционный, изучающий различия, варианты устойчивости в сложной популяции растений;
- исследования стадий репликации и распространения вируса на модельных восприимчивых растениях;
- молекулярный, при изучении на клеточном уровне биохимических процессов, приводящих к формированию того или иного варианта устойчивости,
Сведения, полученные при изучении устойчивости на разных уровнях, выявление с их помощью ключевых моментов в развитии инфекционного процесса и формировании устойчивости, помогает исследователям определять пути для создания растений, устойчивых к вирусному поражению.
Увеличивающийся объем знаний в области молекулярной генетики растительных вирусов, полученные за последние двадцать лет данные о естественных системах защиты растений привели к разработке и развитию большого числа новых стратегий генетического контроля над вирусными заболеваниями растений. Традиционные способы селекции сельскохозяйственных культур дополнились генно-инженерными подходами к созданию устойчивых форм растений. Эти подходы различаются степенью эффективности и универсальности, и число их постоянно растет. Их сравнительный анализ можно найти в ряде обзоров (Baulcombe D., 1996; Goldbach R., et al, 2003; Prim M., 2003). Наиболее удачная классификация подходов, предложенных для повышения устойчивости растений, приведена в обзоре Гольдбаха (Goldbach R., et al, 2003):
1. PDR (pathogene-derived resistance) - устойчивость, возникающая при трансформации растений-хозяев вирусными генами или некоторыми геномными последовательностями вируса, и связанная с блокированием отдельных стадий размножения и распространения вируса продуктами трансгена;
2. PTGS (postranscriptional gene silensing) - устойчивость, возникающая за счет встраивания в геном растения фрагментов вирусного генома в определенной ориентации. В результате этого при заражении трансгенного растения определенным вирусом происходит рестрикция молекул вирусной РНК, Этот вид устойчивости можно рассматривать как разновидность PDR, но в данном случае устойчивость создается за счет включения системы активной защиты самого растения - PTGS, реагирующей на появление продуктов репликации вируса (двунитевой РНК);
3. встраивание доминантных генов устойчивости растительного происхождения (использование природных генов устойчивости, генов-компонентов защитных сигнальных систем);
4. введение гетерологичных, «экзотических» генов из неродственных организмов, использующих специфические, нетипичные для растений-хозяев способы подавления вирусной инфекции.
Штаммы бактерий
В качестве объекта трансформации были использованы следующие виды растений:
- табак Nicotiana tabacum cv. Samsun с генотипом да (ген обуславливает чувствительность к ВТМ по типу системного заболевания);
- мягкая пшеница Triticum aestivum L., линии Хакасская (2п=42), полученная в лаборатории генетики и цитологии НИИСХ ЦРНЗ (Немчиновка, Московская область).
Для фитопатологических исследований в качестве контрольных использовались также растения Nicotiana tabacum cv. Samsun (генотип NN) со сверхчувствительной реакцией на ВТМ и растения табака гибрида Терновского (NN).
Использовались штаммы вируса табачной мозаики из коллекции нашей лаборатории, различающиеся по симптомам вызываемого ими заболевания и степени патогенности для растений табака:
Л Г-І 6-аттенуированный слабопатогенный штамм;
Аукуба - патогенный штамм;
N22 - сильнопатогенный штамм;
Питательная среда для бактерий: триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 10 г/л, в агаризованную среду добавлялось 15 г/л агара. Среда А: 10,5 г/л К2НР04, 4,5 г/л КН2Р04, 1 г/л (NH4)2 S04, 0,5 г/л цитрата натрия 2Н20. Среда для органогенеза табака: lxMS, 1мг/л витамина Вь 0,8 1мг/л витамина В6, 1,5 мг/л БАЛ, 3% сахароза, 50 мг/л канамицина, 250 мг/л клафорана, 8 г/л агара. Состав среды RMNO описан в следующем руководстве (Сидоров, 1985).
Вектор, несущий последовательность рекомбинантной Т-ДНК (рис. 3.1.1) я получали с помощью трехродительского скрещивания, проведенного по стандартной методике (Дрейпер, 1991). Штамм - реципиент A, tumefaciens CI58 (pGV 2260) выращивался на бактериальной среде, содержащей ампициллин (50 мг/л) и рифампицин (25 мг/л), донорный штамм Е. coll (pSIR42) - на среде с ампициллином (100 мг/л) и стрептомицином (100 мг/л), хелперный штамм Е. coli (pRK 2013) - на среде с канамицином (50 мг/л). Клетки агробактерий, содержащих бинарный вектор, селектировали на среде, содержащей следующие антибиотики: ампициллин (50 мг/л), рифампицин (25 мг/л), канамицин (50 мг/л), стрептомицин (100 мг/л) и спектиномицин (100 мг/л).
Для яолучения трансгенных растений использовалась трансформация с помощью бинарного агробактериального вектора (Bevan, 1984). Применяли стандартную методику (Horsch et al., 1985) с использованием листовых дисков. Агробактерий для инфекции листьев выращивали в среде А в течение ночи при 28С, осаждали центрифугированием и суспендировали затем в среде RMNO. Полученной суспензией культуры A. tumefaciens CI58 (pSIR42::pGV2260) плотностью 107 кл/мл среды RMNO обрабатывали листовые экспланты стерильных растений. После инкубации в течении 2 суток в темноте при 25С на агаризованной среде RMNO, экспланты отмывали от агробактерий р-ром клафорана (500мг/л) и перемещали на среду для органогенеза в условия климакамеры "Fisons Fitotron 600Н" (Англия) - 16 ч день, 24С / 8 ч ночь, 20"С. Образовавшиеся после 3-х недель выращивания регенерированные зеленые побеги переносили на среду для укоренения, отличающуюся от среды для регенерации заменой БАП на ИУК (1 мг/л). Регенеранты, укоренявшиеся в течение 3-4 недель на данной среде, подвергались дополнительной проверке на присутствие агробактерий: кусочки листовой ткани проростков растирались с добавлением стерильной воды, полученная суспензия высевалась на питательную среду для культивирования бактерий и инкубировалась при 28"С в течение 3-5 суток. Отсутствие бактериального роста при такой инкубации свидетельствовало об отсутствии одиночных клеток агробактерий в тканях регенеранта. Отобранные регенеранты после подращивания и размножения черенкованием в культуральных условиях высаживались в почву, после двухнедельной адаптации в условиях климакамеры растения переносились в теплицу. В течение летне-осеннего периода у растений были получены семена путем самоопыления, с использованием изолирующих пергаментных колпаков.
Трансформация растений табака и исследование трансгенных растений табака
В качестве источника Т-ДНК нами была использована плазмида pSIR42, содержащая между 25-нуклеотидными Т-повторами последовательности двух генов, экспрессирующихся в растительной клетке: маркерный ген неомицинфосфотрансферазы II (nptll) под контролем промотора гена нопалинсинтазы и рекомбинантный ген, обеспечивающий под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты синтез двуцепочечной РНК. Схема Т-области плазмиды pSIR42 представлена на рис. 3.1.1. Данная плазмида была создана в лаборатории (Смирнов, 1993) на основе экспрессионного вектора pST6 (Смирнов, 1990) путем клонирования в него по сайту ВатШ фрагмента рекомбинантной ДНК, содержащего протяженный инвертированный повтор. Встроенная последовательность состоит из дуплицированного НіпсйП-ВатШ-фрагмента. гена устойчивости к тетрациклину плазмиды pBR322 (350 п.о.), сконструированного в ориентации голова к голове и разделенных спейсером из модифицированного полилинкера.
Как подробно обсуждалось в разделе «Обзор литературы», двунитевая РНК, экспрессируемая чужеродной последовательностью, вызывает в организме растений инициацию процессов РНК-интерференции, приводящих к выключению активности (на уровне РНК) как введенного гена, так и гомологичных ему генов хозяина. Хотя в качестве матрицы для синтеза дцРНК в растении при создании вектора использовалась последоватеьность бактериального происхождения, нами не исключалась возможность специфического взаимодействия днРНК с отдельными транскриптами генов растений. Для проверки возможности таких взаимодействий с нашей конструкцией нами был предпринят поиск гомологии последовательности инвертированного повтора с геномом растений с использованием программы BLAST (алгоритмы blastn, discontiguous megablast), по базам данных nr, est, refseq mrna. Известно, что для инициации интерфереции достаточна гомология между транскриптами в 30 нуклеотидов. Варьируя параметры поиска, мы выявили гомологию с 5 геномными последовательностями и приблизительно с 50 экспрессируемыми последовательностями РНК транскриптов, выделенных из различных растений, в основном с неустановленными функциями. Судя по размерам этих мРНК, их организации и практически полной гомологии (99 - 100%) с геном устойчивости к тетрациклину, большинство из них, вероятно, являются результатом горизонтального переноса бактериального гена в геном растений, либо артефактом. Среди видов, у которых были выявлены участки гомологии, не было представителей пасленовых, но было обнаружено несколько видов злаков - Hordeum vulgare, К bulbosum, Sorghum bicolor, Oryza sativa. Хотя параметры поиска по длине гомологичной области были минимизированы, последовательностей, принадлежащих геномам пшеницы и табака обнаружено не было. Следовательно, экспрессия в трансгенных растениях двунитевой РНК, гомологичная фрагменту последовательности гена устойчивости к тетрациклину длиной 0,35 тпн плазмиды pBR322 не должна вызывать умолкание собстенных генов табака и пшеницы. Однако, принимая во - внимание отсутствие на настоящий момент полных данных по первичной структуре геномов табака и пшеницы, полностью исключить возможности специфического интерферирующего воздействия гетерологичной днРНК на неизвестные на данный момент гены-гомологи мы не можем.
