Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Неспецифические системы устойчивости высших растений к вирусным патогенам . 10
1.1.1. Системная приобретенная устойчивость. 10
1.1.2. Использование генов PR-белков в генетической инженерии. 16
1.1.3. Системная устойчивость, индуцируемая непатогенными почвенными бактериями. 18
1.1.4. Устойчивость, индуцируемая насекомыми-фитофагами. 19
1.2. Специфические системы защиты растений от вирусных патогенов. 20
1.2.1. Перекрестная защита. 20
1.2.2. Использование механизмов перекрестной защиты для создания вирусоустоичивых растений путем трансгенеза: трансгенные растения, экспрессирующие гены капсидных белков вирусов. 21
1.2.3. Индуцируемый вирусами генетический сайленсинг. 23
1.2.4. Использование механизмов генетического сайленсинга для
создания вирусоустоичивых растений путем трансгенеза. 26
1.3. Использование неструктурных генов вирусного происхождения для создания вирусоустоичивых растений путем трансгенеза . 27
1.4. Другие подходы создания вирусоустоичивых растений путем трансгенеза. 31
1.4.1. Трансгенные растения, экспрессирующие N-гены табака. 31
1.4.2. Трансгенные растения, экспрессирующие гены а- и р-интерферона человека и 2'-5'-олигоаденилатную противовирусную систему млекопитающих. 32
1.4.3. Трансгенные растения, экспрессирующие антитела. 33
1.4.4. Трансгенные растения, экспрессирующие гены белков, инактивирующих рибосомы. 33
1.4.5. Трансгенные растения, экспрессирующие гены рибозимов. 34
1.5. Роль нуклеаз в физиологических процессах высших растений. 35
1.5.1. Роль нуклеаз в генерации индуцируемой устойчивости растений к патогенам.
1.5.2. Трансгенные растения, экспрессирующие гены нуклеаз. 50
Глава 2. Материалы и методы 52
2.1. Материалы. 52
2.2.Методы. 52
2.2.1. Конструирование и анализ векторов. 52
2.2.2. Приготовление и трансформация компетентных клеток E.coli. 52
2.2.3. Выделение и анализ плазмидной ДНК. 53
2.2.4. Полимеразная цепная реакция. 54
2.2.5. Приготовление и прямая трансформация компетентных клеток Agrobacterium tumefaciens. 55
2.2.6. Получение трансгенных растений табака и картофеля. 55
2.2.7. Определение активности неомицинфосфотрансферазы II в трансгенных растениях. 56
2.2.8. Выделение и анализ геномной ДНК растений методом блот-гибридизации. 57
2.2.9. Определение нуклеазной активности грубых экстрактов растений табака и картофеля. 57
2.2.10. Анализ спектра белков с нуклеазной активностью в экстрактах трансгенных и контрольных растений в SDS-полиакриламидном геле с добавлением РНК в матрикс разделяющего геля. 58
2.2.11. Линии вирусов и инфицирование растений. 59
Глава 3. Результаты. 60
3.1. Создание модельных конструкций, экспрессирующих гены гетерологичных секреторных нуклеаз. 60
3.1.1. Клонирование гена нуклеазы Serratia marcescens. 60
3.1.2. Клонирование гена панкреатической рибонуклеазы быка . 63
3.2. Получение трансгенных растений табака. 66
3.3. Анализ полученных трансформантов на экспрессию маркерного гена, наличие полноразмерной вставки и инсерции в геномной ДНК. 67
3.4. Анализ полученных трансгенных растений табака на наличие повышенного уровня нуклеазной активности. 69
3.5. Локализация панкреатической рибонуклеазы в тканях трансгенных растений табака и количественная оценка содержания трансгенного белка. 72
3.6. Получение трансгенных растений картофеля. 73
3.7. Анализ полученных трансформантов картофеля на экспрессию маркерного гена и наличие инсерции в геномной ДНК. 74
3.8. Анализ полученных трансгенных растений картофеля на наличие повышенного уровня нуклеазной активности. 76
3.9. Анализ спектра белков с нуклеазной активностью с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном activity-геле. 78
3.10. Анализ полученных трансгенных растений табака на устойчивость к вирусу табачной мозаики (TMV). 80
Глава 4. Обсуждение. 82
Выводы. 90
Список цитируемой литературы. 91
- Неспецифические системы устойчивости высших растений к вирусным патогенам
- Использование неструктурных генов вирусного происхождения для создания вирусоустоичивых растений путем трансгенеза
- Приготовление и трансформация компетентных клеток E.coli.
- Клонирование гена панкреатической рибонуклеазы быка
Введение к работе
Создание генно-инженерными методами растений с повышенной устойчивостью к таким быстро эволюционирующим патогенам, как вирусы, является одной из актуальных проблем как современной молекулярной биологии, так и биотехнологии. Однако, недостаточное понимание молекулярных механизмов формирования системной устойчивости и взаимодействия растительных вирусов с защитными системами высших растений затрудняет создание новых способов контроля вирусных болезней сельскохозяйственно-ценных растений.
В настоящее время защитные системы высших растений принято классифицировать на белок-опосредованные системы неспецифической приобретенной устойчивости и высокоспецифические системы, основанные на РНК-опосредованных механизмах (Prins, 2003). Общим компонентом всех белок-опосредованных систем неспецифической устойчивости является накопление специфических белков, связанных с патогенезом (pathogenesis-related proteins, PR-proteins). Наиболее изученными считаются салицилат-индуцируемые PR-белки, формирующие SAR. В настоящее время различают 14 групп этих белков, в основном выполняющих гидролитические или ингибиторные функции (Van Loon and Van Strien, 1999).
На момент начала наших исследований среди PR-белков не было идентифицировано белков с рибонуклеазной активностью. Совсем недавно было показано, что по крайней мере некоторые из PR-10-белков имеют рибонуклеазную активность и локализованы внутриклеточно (вакуолярно), также было показано участие PR-10-белка горького перца в противовирусной защите растений (Park et al., 2004).
Еще менее изученными являются салицилат-неиндуцируемые PR-белки, накапливающиеся в тканях растений после поранения. Эти белки не классифицированы на группы, и наиболее известными из них являются экстраклеточные нуклеазы (Ye and Droste, 1996; Kariu et al., 1998; LeBrasseur et al., 2002) и ингибиторы протеиназ (Pieterse and Van Loon, 1999). И хотя роль индукции растительных экстраклеточных нуклеаз после поранения окончательно не выяснена, исходя из ферментативной активности этих белков и некоторых экспериментальных данных (Salganic, 1984; Gergerich and Scott, 1988; Атабеков и др., 1990; Wolf, 1991) можно сделать предположение, что экстраклеточные нуклеазы активно участвуют в противовирусной защите растений. Дополнительные исследования взаимодействия этих ферментов с патогенами необходимы для понимания молекулярных механизмов неспецифической устойчивости у высших растений.
Неспецифический характер опосредуемой нуклеазами устойчивости, вне зависимости от локализации этих ферментов в клетках растений, дает возможность создания генно-инженерными методами растений с повышенной устойчивостью к неродственным вирусам, а в свете имеющихся литературных данных, возможно также к грибам и вироидам. '
Основной генно-инженерной стратегией повышения устойчивости растений к вирусным инфекциям является перенос в ядерный геном растений фрагментов геномов патогенов (Wilson, 1993). Попытки создания трансгенных растений, устойчивых к широкому спектру вирусов, в рамках данной стратегии успеха не имели (Van den Boogaart et al., 2001; Rinne et al., 2005).
В настоящее время успешно реализовано два способа повышения устойчивости к широкому спектру вирусов путем трансгенеза. Один из них заключается в переносе генов интерферон-индуцируемой 2'-5'-олигоаденилатной противовирусной системы млекопитающих (Truve et al., 1993; 1994; Honda et al., 2003). Возникающая в результате устойчивость выражается лишь в небольшой задержке формирования симптомов инфекции. Второй способ заключается в клонировании генов растительных противовирусных белков, инактивирующих рибосомы, и является спорным из соображений биобезопасности (Lodge et al., 1993; Wang et al., 1998; Vandenbussche et al., 2004). Создание новых стратегий получения растений с широким спектром устойчивости к вирусам является актуальной задачей современной биотехнологии и индуцируемое повышение нуклеазной активности может стать одной из таких стратегий.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы является изучение влияния экстраклеточных нуклеаз на формирование устойчивости растений к вирусным патогенам с использованием трансгенных растений, экспрессирующих гены гетерологичных секреторных нуклеаз. В рамках работы были поставлены следующие задачи:
Создать генетические конструкции, несущие гены секреторных нуклеаз, позволяющие повышать уровень нуклеазной активности в трансгенных растениях.
Получить трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие гены секреторных нуклеаз.
Оценить уровень нуклеазной активности в полученных трансгенных растениях и ее локализацию.
Определить степень вирусоустойчивости трансгенных растений табака с повышенной экстраклеточиой нуклеазной активностью.
Научная новизна и практическая ценность
В результате проведенных исследований была создана модельная система для изучения механизмов неспецифической устойчивости растений к вирусам. Клонированы гены гетерологичных секреторных нуклеаз и с их использованием созданы векторы для экспрессии в растительных клетках. Впервые получены трансгенные растения, экспрессирующие гены панкреатической секреторной рибонуклеазы быка и секреторной нуклеазы Serratia marcescens. Показано, что уровень нуклеазной активности в листьях и стеблях полученных трансгенных растений значительно повышен по сравнению с контролем.
Исследовано влияние повышенной нуклеазной активности на устойчивость растений к вирусам. Впервые показано, что экстраклеточные нуклеазы непосредственно участвуют в формировании устойчивости растений к вирусным инфекциям, что вносит вклад в понимание молекулярных механизмов неспецифической устойчивости растений.
Получены трансгенные растения картофеля хозяйственно ценных сортов с повышенным уровнем экстраклеточной нуклеазной активности. Предложена новая стратегия создания растений, устойчивых к широкому спектру вирусных, а возможно также грибковых и вироидных инфекций, с использованием методов генетической - инженерии, основанная на противовирусном действии экстраклеточных нуклеаз.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2004 г.) и Международной научно-практической конференции Института картофелеводства НАН Беларуси (Минск, 2003 г.); и на российских конференциях: на 7-ой пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003 г), на конференции МОГИС (Москва, 2003), на Первом Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002 г.), на Ш-ем съезде ВОГИС «Генетика в XXI веке» (Москва, 2004 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей.
Кочетов А.В., Шакирова Н.В., Лукашева В.В, Комарова М.Л., Пилюгин М.В., Трифонова Е.А., Дейнеко Е.В., Ривкин М.И., Шумный В.К. Экспрессия модельных бицистронов в трансгенных растениях // Докл. Акад. Наук. 1996. Т.349. N.4. С.549-552.
Трифонова Е.А., Кочетов А.В., Шумный В.К. Роль нуклеаз в физиологических процессах высших растений // Успехи совр. биол. 2000. Т. 120. С.395-405.
Трифонова Е.А., Комарова М.Л., Сырник О.А., Кочетов А.В., Шумный В.К. Трансгенные растения табака Nicotiana tabacum SRI, экспрессирующие нуклеазу Serratia marcescens II Генетика. 2002. Т.38. С.274-277
Кочетов А.В., Титов С.Е., Колодяжная Я.С, Комарова М.Л., Коваль B.C., Макарова Н.Н., Илинский Ю.Ю., Трифонова Е.А., Шумный В.К. Повышение содержания пролина и осмотического давления клеточного сока у трансформантов табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы // Генетика. 2004. Т.40.С. 282-285.
Трифонова Е.А., Комарова М.Л., Леонова Н.С., Щербань А.Б., Кочетов А.В., Малиновский В.И., Шумный В.К. Трансгенные растения картофеля Solarium tuberosum L., экспрессирующие ген секреторной нуклеазы Serratia marcescens II Доклады РАН. 2004. Т.394.С. 411-413.
По материалам работы подана заявка на патент:
Трифонова Е.А., Кочетов А.В., Комарова М.Л., Шумный В.К., Малиновский В.И., Сапоцкий М.В. Способ получения трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции. Заявка №2005130280 от 28.09.2005.
Благодарности. В разные периоды работа финансировалась за счет следующих грантов: поддержки ведущих научных школ № 2275.2003.4, Министерства образования РФ ЗВ02-1.4-464, комплексного интергационного проекта Со РАН № 59, интеграционной программе РАН № 12.5.
Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному руководителю к.б.н. А.В. Кочетову и сотрудникам лаборатории генной инженерии растений к.б.н. М.Л. Комаровой, А.В. Романовой, СЕ. Титову и Я.С. Колодяжной; сотрудникам БПИ ДВО РАН д.б.н. В.И. Малиновскому и к.б.н. М.В. Сапоцкому; сотруднику лаборатории молекулярной генетики злаков А.Б. Щербаню; сотруднице селекционно-генетической лаборатории Н.С. Леоновой, сотруднице сектора мутагенеза и репарации З.И. Панфиловой, участвовавших в ряде экспериментов или в обсуждении полученных результатов, отраженных в совместных публикациях.
Неспецифические системы устойчивости высших растений к вирусным патогенам
Способность растений к формированию локальной и системной защитных реакций была впервые описана много десятилетий назад Carbone и Arnaudi (1930), а также Chester (1933). Эти авторы обнаружили, что растения становятся более устойчивыми после первоначальной инфекции. Термин «systemic acquired resistance - SAR» впервые был предложен Ross, который описал повышенную устойчивость верхних листьев растений табака, инфицированных вирусом табачной мозаики в случае формирования некрозов на нижних листьях этих растений (Ross, 1966). Изучение SAR-реакции на растениях огурца позволило выявить широкий спектр формируемой устойчивости, независящий от природы первоначального инфицирующего агента (Madamanchi & Кис, 1991). Именно эти характеристики SAR привели к увеличению количества исследований данного феномена и SAR была описана более, чем для 30 видов как однодольных, так и двудольных растений (Sticher et al., 1997).
Феномен SAR заключается в том, что заметно повышенная устойчивость к самому широкому спектру грибных, бактериальных и вирусных патогенов наблюдается в незатронутых первичной инфекцией частях растения, что и придает данному механизму системный характер. В то время как синтез фитоалексинов, модификация структуры клеточной стенки и активация запрограммированной гибели клеток являются локальным ответом на взаимодействие растения и патогена (Metraux et al., 2002), накопление специфических белков, связанных с патогенезом (pathogenesis-related proteins, PR-proteins), представляет собой наиболее известный системный ответ растения на инфекцию. Впервые PR-белки были идентифицированы как индуцируемая белковая фракция в листовых экстрактах табака, инфицированного вирусом табачной мозаики с формированием HR (некрозов) (Van Loon and Van Kammen, 1970). Позднее было показано, что растительный фенольный метаболит салициловая кислота (salicylic acid -SA) индуцирует синтез PR-белков и предобработка SA может также повысить устойчивость растений табака к вирусу табачной мозаики.
Салициловая кислота как индуктор SAR.
Салициловая кислота играет важнейшую роль в сигнальных путях, приводящих к индукции SAR. После инфекции эндогенный уровень SA возрастает локально и системно, причем SA обнаруживается во флоэме до формирования SAR (Metraux et al., 1990). Это означает, что SA начинает синтезироваться в ответ на инфицирование как локально, так и системно, и таким образом продукция SA de novo в неинфицированных частях растения может вносить вклад в формирование системного иммунного ответа. Уровень системной устойчивости растений позитивно коррелирует с концентрацией SA, это было показано для картофеля (Coquoz et al., 1995) и трансгенных растений арабидопсиса, экспрессирующих бактериальный ген салицилатсинтазы и поэтому имеющих повышенный уровень SA (Mauch et al., 2001). Ключевые эксперименты, доказывающие роль SA в формировании SAR-реакции у растений, были проделаны с трансгенными растениями, экспрессирующими бактериальный ген nahG, кодирующий бактериальную салицилатгидроксилазу G. Такие растения не способны накапливать SA и, как следствие этого, не способны к индуцированной экспрессии PR-белков (Gaffhey et al., 1993). Более того, растения, содержащие nahG-ген, значительно более чувствительны к бактериальным, грибковым и вирусным патогенам (Delaney et а!., 1994).
Центральная роль салициловой кислоты в индуцируемом патогенами сигнальном пути, приводящем к возникновению SAR, поднимает вопросы о регуляции биосинтеза и молекулярном механизме действия SA. Ранее считалось, что SA в растениях синтезируется из фенилаланина через кумаровую и бензойную кислоты (Sticher et al., 1997). Однако недавно было показано, что более активно используется бактериальный путь биосинтеза SA, из хоризмата через изохоризмат, а ключевым ферментом, регулирующим этот процесс, является изохоризматсинтаза 1. По-видимому, именно этот путь используется растениями в ходе формирования SAR (Wildermuth et al., 2001).
Механизм действия SA как сигнальной молекулы изучался в связи с попытками идентификации белка, связывающего с высокой эффективностью салициловую кислоту. Изначально было выдвинуто предположение о том, что SA должна связываться каталазой и аскорбатпероксидазой с формированием фенольных радикалов, вовлеченных в перекисное окисление липидов (Durner & Klessig, 1995). Когда эти предполагаемые рецепторные белки были идентифицированы в растениях табака, оказалось, что они обладают скорее низкой или средней аффинностью к SA. И кроме того не понятно, достаточно ли липидных пероксидов способны сформировать фенольные радикалы за короткое время формирования системного иммунного ответа (Durner and Klessig, 1995; Chen et al., 1993). Позже был идентифицирован белок SABP2, который специфично связывает SA с гораздо большей аффинностью, чем белки, описанные выше. Он является липазой, относящейся суперсемейству сс/р-гидролаз. Липазная активность данного фермента стимулируется SA и может генерировать сигналы липидной природы, необходимые для возникновения системного иммунного ответа. Сайленсинг экспрессии SABP2 подавляет локальную устойчивость к вирусу табачной мозаики, индукцию салициловой кислотой гена PR-1 и развитие SAR. Эти результаты позволили авторам сделать предположение, что именно SABP2 является рецептором SA при формировании системного приобретенного иммунитета у растений (Kumar and Klessig, 2003).
Использование неструктурных генов вирусного происхождения для создания вирусоустоичивых растений путем трансгенеза
Трансгенные растения, экспрессирующие вирусные репликазы. Вирусные репликазы, как функционально-активные белки, необходимые в ходе жизненного цикла вирусов, были использованы многими исследователями для придания устойчивости патогенного происхождения трансгенным растениям.
При экспрессии в трансгенных растениях табака гена, кодирующего 54 kDa фрагмент репликазы TMV, была получена устойчивость, превосходящая по уровню устойчивость, обусловленную СР (Golembovski et al., 1990). Данные растения были устойчивы к TMV в концентрации до 500 мкг/мл, и в отличие от СР-трансгенных растений, были также устойчивы к инфекции РНК TMV. Так же, как и СР-трансгенные растения, такие растения демонстрировали устойчивость только в случае накопления 54 kDa белкового продукта, а не трансгенного транскрипта и имели устойчивость только к близкородственным вирусам. Сходные результаты были получены при экспрессии 54 kDa фрагмента репликазы вируса раннего покоричневения гороха PEBV (MacFarlane and Davies, 1992). Дальнейшее изучение PEBV-устойчивых трансгенных растений показало, что устойчивые линии содержат множественные копии трансгенов в двух локусах, но для индукции устойчивости необходим только один из локусов. Исследования наследования признака в поколениях выявило, что уже R4 и R5 гораздо менее устойчивы. Оказалось, что уровень устойчивости обратно пропорционален уровню трансгенного транскрипта и в действительности полученная устойчивость основана на механизме посттранскрипционного генетического сайленсинга (Van den Boogaart et al., 2001).
Были получены трансгенные растения табака, экспрессирующие модифицированный ген репликазы CMV, которые оказались устойчивыми к высоким дозам CMV и вирусной РНК. Устойчивость проявлялась только к CMV одной подгруппы и не снижалась под действием высокой температуры (Anderson et al., 1992). Аналогичные результаты были получены с нефункционирующим репликазным геном PVX, полученные трансгенные растения также были устойчивы к высоким дозам PVX (Braun and Hemenway, 1992).
Трансгенные растения картофеля, экспрессирующие последовательность репликазного гена вируса скручивания листьев картофеля (PLRV), оказались устойчивыми к вирусу-источнику трансгена вне зависимости от наработки трасгенного белка. Авторы использовали в качестве трансгена нуклеотидные последовательности гена как в смысловой, так и в антисмысловой ориентацях, а так же нетранслируемый смысловой вариант. Во всех трех вариантах зафиксировали устойчивый фенотип, что приводит к заключению об РНК-опосредованном механизме данной устойчивости (Vazquez Rovere et al., 2001).
Трансгенные растения огурца, экспрессирующие 54 kDa фрагмент репликазы вируса пятнистой мозаики плодов огурца (CFMMV), оказались устойчивыми к инфекции CFMMV, в том числе и при выращивании растений на вирус-инфицированной почве. Авторы не обсуждают механизм устойчивости и утверждают, что это первое сообщение о трансгенной устойчивости к почвенному вирусному патогену (Gal-On et al., 2005).
Нестабильность и противоречивость в определении возможных механизмов вирусоустойчивости, полученной при использовании в качестве трансгенов фрагментов вирусных репликазных генов, вызывает сомнения в возможности использования этого подхода в сельском хозяйстве.
Трансгенные растения, экспрессирующие дефектные гены транспортных белков вирусов.
Большинство вирусов кодирует транспортные белки (movement proteins - MPs), которые способствуют межклеточному перемещению вирусов в инфицированных тканях. Было показано, что некоторые вирусы могут способствовать транспорту гетерологичных вирусов, самостоятельно неспособных выполнять эту функцию (Atabekov and Taliansky, 1990). Следовательно, можно ингибировать распространение многих гетерологичных вирусов, использующих общие MP, и трансгенные растения с нарушенной функцией вирусного транспорта могут оказаться устойчивыми к широкому спектру вирусов.
В отличие от трансгенных растений, экспрессирующих СР-гены, трансгенная экспрессия функциональных MP-генов не приводит к повышению устойчивости растений к вирусам. Более того, было показано, что дикий тип MP TMV при трансгенной экспрессии приводит к росту вирулентности инфицирующего вируса, вместо повышения устойчивости к нему (Cooper et al., 1995). Альтернативой функционально-активным MP оказались дефектные MP, которые, действуя как доминантные негативные мутанты, интерферируют с MP дикого типа. Малышенко с соавторами получили трансгенные растения табака, экспрессирующие ген температурно-чувствительного MP TMV (Malyshenko et al., 1993). При выдерживании растений при повышенной температуре трансгенный белок терял функциональную активность, что приводило в защите от TMV-инфекции (3 мкг/мл). Авторы показали, что репликация вируса в протопластах не ингибируется высокой температурой, следовательно, температурно-чувствительный дисфункциональный MP ингибирует распространение вируса. В этой же работе были описаны трансгенные растения табака, экспрессирующие MP вируса BMV, который в принципе не инфицирует растения табака, но способен реплицироваться в его протопластах, что означает нефункциональность MP BMV в табаке. Трансгенные растения, накапливающие MP BMV показали снижение накопления TMV как в инокулированных, так и в выше расположенных листьях при нормальной репликации вируса в протопластах этих растений (Malyshenko et al., 1993).
Приготовление и трансформация компетентных клеток E.coli.
Для конструирования были использованы следующие плазмиды: pBlueScript KS (фирма «Stratagene»), рС27 (Alliotte et al., 1988), pGSH160 (Deblaere et al., 1987). Bee процедуры, использованные при клонировании, были проведены согласно методикам, приведенным у Маниатиса с соавторами (Маниатис и др., 1984).
Клетки E.coli XL-1 Blue выращивали в среде LB (10 г/л триптон, 5 г/л дрожжевой экстракт, 10 г/л NaCl) при 37С до оптической плотности As5o=0.3-0.4 о.е. Клетки осаждали центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин, 4С) и суспендировали на льду в растворе, содержащем 10 mM MgCh, 10 тМ MgS04, 10% полиэтиленгликоль 6000, затем в суспензию добавляли диметилсульфоксид до конечной концентрации 5%. Клетки инкубировали 10 мин на льду, расфасовывали по 200 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70 С.
200 мкл компетентных клеток размораживали 30 мин на льду, добавляли 0.1-1 мкг плазмидной ДНК, растворенной в буфере ТЕ (10 тМ Трис-HCI и 1 тМ ЭДТА) и инкубировали 30 мин на льду. Затем клеточную культуру подвергали тепловому шоку при 37С, 5 мин, после чего добавляли 1 мл среды LB и инкубировали 1 час при 37С. 100 мкл клеточной суспензии высевали на чашку Петри с 1.5% агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина для производных pBlueScript KS или 100 мкг/мл ампициллина плюс 50 мкг/мл спектиномицина для производных рС27 и pGSH160. Засеянные чашки инкубировали в течение ночи при 37С.
Трансформированную плазмидной ДНК колонию E.coli суспендировали в 3 мл среды LB, добавляли соответствующие антибиотики и инкубировали на термостатированной качалке при 37С в течение ночи. Ночную культуру переносили в микроцентрифужные пробирки и осаждали клетки 5 мин при 12000 об/мин. Полученный осадок ресуспендировали в 100 мкл раствора, содержащего 10 тМ ЭДТА, 50 тМ глюкозы, 25тМ Трис-HCI рН 8.0, 2 мкг/мл лизоцима. Далее к смеси добавляли 200 мкл раствора 0.2 М NaOH и 1% SDS, перемешивали качанием и добаляли 150 мкл ЗМ NaAc рН 5.5, интенсивно перемешивали и центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Осадок ДНК растворяли в 200 мкл буфера ТЕ. Дальнейшую очистку плазмидной ДНК проводили, добавляя равный объем 5 М LiCl и инкубируя смесь на льду в течение 15 мин. Затем осадок удаляли центрифугированием (10 мин, 12000 об/мин), а ДНК высаживали из супернатанта добавлением двух объемов этанола и центрифугированием (5 мин, 12000 об/мин). Полученный осадок плазмидной ДНК промывали 70% этанолом и растворяли в ТЕ.
Гидролиз плазмидной ДНК рестриктазами, лигирование и обработку ДНК фрагментом Кленова проводили согласно инструкциям фирм-производителей ферментов («СибЭнзим» и «Медиген»).
Гидролизованную рестриктазами плазмидную ДНК и продукты полимеразной цепной реакции анализировали электрофорезом в агарозных гелях. В зависимости от размера разделяемых фрагментов использовали 0.8-2% агарозный гель, приготовленный на ІхТАЕ буфере (50хТАЕ: 2М Трис-HCI рН 8.0, 1.56 М СН3СООН, 0.05 М ЭДТА рН 8.0, общий рН буфера 7.6). Электрофорез проводили также в ІхТАЕ буфере, к образцам при нанесении на гель добавляли 0.1 объема краски (30% глицерин, 0.3% бромфеноловый синий, 0.3% ксиленцианол). Гель окрашивали в растворе бромистого этидия (0.1 мкг/мл, 10 мин), визуализировали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе (Т2201, Sigma) и фотографировали на установке Gellmage.
Вырезанные из агарозного геля фрагменты ДНК элюировали в приборе для электроэлюции фирмы «Hoffer Scientific Instruments» согласно инструкции производителя.
Секвенирование последовательностей ДНК клонированных генов проводилось на базе Межинститутского центра секвенирования ДНК на однокапиллярном анализаторе продуктов секвенирования ДНК по Сэнгеру и других фрагментов ДНК (модель ABI PRISM 310 Genetic Analyzer) или четырехканальном анализаторе (модель АВІЗ 100 производства фирмы Applied Biosystems) с использованием специфических праймеров П1, П2 и ПЗ, П4 соответственно.
Полимеразная цепная реакция использовалась в ходе работы многократно, сначала для выделения целевых генов гетерологичных нуклеаз из геномной ДНК быка и бактерии Serratia marcescem, затем для проверки наличия полноразмерной встройки целевых генов в геномную ДНК табака и картофеля, а так же для получения зондов для блот гибридизации по Саузерну. Последовательности праймеров, использованных для выделения гена и анализа растений, экспрессирующих ген секретируемой нуклеазы Serratia marcescens: ni:5 ATCGATGCGCTTTAACCAACAACAA и n2:5 TGGATCCGTCAGTTTTTGCAGCCC. Для выделения гена и анализа растений, экспрессирующих ген панкреатической рибонуклеазы быка, были использованы праймеры: n3:5 ATCATGGCTCTGAAGTTCCC и n4:5 CCTACACAGTAGCATCAAAG. Для дополнительного анализа использовали праймеры на последовательность гена npt II: n5:5 CGACGTTGTCACTGAAGCG и n6:5 AAGCACGAGGAAGCGGTCAG, отдельно или в комбинации с праймерами на последовательности целевых генов. Условия проведения ПЦР меняли в зависимости от ожидаемой длины фрагмента, природы матричной ДНК и необходимого количества продукта. ПЦР проводили в 20 мкл буфера, содержащего 67 тМ Трис-HCl рН 8.9, 16 mM (NH4)2S04, 1.5 тМ MgCl2, 0.01% Tween 20, Р-меркаптоэтанол, 0.1 mM dNTP, 0.002тМ праймеры, 1 ед. акт. Tag-полимеразы, 30-50 нг матричной ДНК.
Клонирование гена панкреатической рибонуклеазы быка
Согласно полученным нами данным, представленным в таблице 1, нуклеазная активность растений, экспрессирующих ген нуклеазы Serratia marcescens, более чем в 6 раз превышает таковую у контрольных растений, в то время как активность листовых экстрактов растений, экспрессирующих ген панкреатической рибонуклеазы быка достоверно не отличается от контроля. Мы предположили, что возможно отсутствие значительного прироста нуклеазной активности у линий трансгенного табака pGSH160BN-25 и pGSH160BN-27 связано с дефектами использованного вектора pGSH160. Тогда с целью получить растения, эффективно экспрессирующие панкреатическую рибонуклеазу мы переклонировали ген рибонуклеазы быка в бинарный вектор рС27, с использованием которого были получены трансгенные растения, экспрессирующие нуклеазу Serratia marcescens. Результаты измерений нуклеазной активности приведены в таблице 2.
Заметим, что в данном эксперименте в качестве контроля при измерении оптической плотности мы использовали реакционную смесь без добавления листового экстракта и время гидролиза опыта было уменьшено до 60 минут (Galiana et al., 1997). Как можно видеть из представленных в таблице данных, уровень нуклеазной активности грубых листовых экстрактов трансгенных растений табака, полученных с использованием конструкции pC27BN выше уровня активности контрольных растений. Так, нуклеазная активность экстрактов линий pC27BN-5 и pC27BN-8 более чем в 10 раз превышает активность экстрактов контрольных растений. Таким образом, мы получили трансгенные растения, экспрессирующие ген панкреатической рибонуклеазы быка и эффективно повышающие уровень нуклеазной активности в грубых экстрактах трансгенных растений.
Судя по литературным данным, секреторные белки млекопитающих корректно процессируются в трансгенных растениях (Sijmons et al., 1990). Следующий вопрос, который исследовался в настоящей работе, заключался в том, секретируется ли трансгенный продукт из клеток растений в межклеточное пространство (апопласт). Экстракты межклеточной жидкости (апопласта) были получены по модифицированной методике (Griffith et al., 1992; Huang et al., 2002). Листья и стебли растений нарезались кусочками около 1 см и помещались в обрезанный пластиковый одноразовый шприц на 2 мл, который в свою очередь помещался в пластиковую пробирку для центрифугирования на 2 мл. После центрифугирования в течение 20 минут при 4 С и 830 g экстракт апопласта собирался со дна пробирки, из остатков измельченных листьев после центрифугирования получался грубый экстракт фракции дебриса. Как следует из таблицы 3, основной прирост нуклеазной активности наблюдается именно во фракции межклеточной жидкости. В случае линии pC27BN-8, нуклеазная активность экстракта апопласта в 24 раза выше активности экстракта контроля, в то время как активность фракции дебриса относительно мало отличается от контроля. Таким образом, мы можем сделать вывод, что трансгенные растения, полученные с использованием вектора pC27BN, не только экспрессируют ген панкреатической рибонуклеазы быка и имеют повышенный уровень нуклеазной активности, но и активно секретируют трансгенный белок.
Мы оценили количественно содержание трансгенного продукта в экстрактах растений табака линий pC27BN в процентах к растворимому белку. Мы добавляли препарат коммерческой панкреатической РНКазы быка к экстрактам нетрансгенного табака и оценивали прирост нуклеазной активности по методике, описанной выше. Для высокоэкспрессирующих ген РНКазы быка линий pC27BN-5, pC27BN-8, pC27BN-10 и pC27BN-ll содержание трансгенного продукта составляло 0.02-0.04% по отношению к суммарному растворимому белку.
В целом высокий уровень нуклеазной активности в экстрактах полученных нами трансгенных растений табака не сопровождался видимыми изменениями фенотипа, сроков развития и плодовитости, что позволило нам сделать вывод о возможности использования полученных модельных конструкций для модификации других видов растений с целью повышения уровня экстраклеточной нуклеазной активности.
Получение трансгенных растений картофеля Solatium tuberosum L. После того, как была показана экспрессия гена эндонуклеазы Serratia marcescens в трансгенных растениях табака, вектор pC27SMN был использован нами для трансформации растений картофеля сортов Белоярский ранний и Каприз. Вектором pC27SMN был трансформирован Agrobacterium tumefaciens (pGV2260) путем трехродительского скрещивания с использованием плазмиды-помощника pRK2013 или прямой трансформацией. Трансформация клубневых дисков проводилась по модифицированному методу (Snyder and Belknap, 1993).
Культуры выращивали при температуре воздуха 23С с 16-ти часовым фотопериодом при освещенности 4-6 килолюкс. Через 2 недели часть дисков зазеленела, затем появились первичные каллусы, и через 7 недель было отобрано 11 побегов у сорта Белоярский ранний и 3 побега у сорта Каприз, которые пересадили на среду без гормонов с канамицином (100 мг/л) для укоренения. В итоге получено 11 укорененных растений трансформантов сорта Белоярский ранний и 2 растения сорта Каприз. После замера нуклеазной активности оставлено 5 растений: Б4, Б5, Б7, Б8, Б11 сорта Белоярский ранний и 2 растения К1 и К2 сорта Каприз.
