Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Стабильность экспрессии и наследование чужеродных генов у трансгенных растений 15
1.1.1. Клонирование генов для переноса их в геном растений 15
1.1.2. Создание генетических конструкций 16
1.1.3. Перенос созданных генетических конструкций в геном растений 18
1.1.3.1. Агробактериальная трансформация: генетическая карта Ti-плазмиды и Т-ДНК 19
1.1.3.2. Общая схема переноса Т-ДНК в клетки растений 20
1.1.3.3. Перенос векторных последовательностей в процессе агробактериальной трансформации 24
1.1.4. Оценка трансгенных растений по стабильности экспрессии перенесенных генов и отбор отдельных трансформантов для дальнейшей селекционной доработки 26 -
1.1 .4.1, Наследование трансгенов у трансгенных растений... 261
1.1.4.2. Вариабельность экспрессии перенесенных генов 27
1.2. Изменение экспрессии перенесенных генов в новом окружении генома растений: эффект замолкания 30*
1.2.1. Частота инактивирования трансгенов у независимо полученных трансгенных растений 1.2.2. Возможные причины инактивирования трансгенов 31
1.2.3. Молекулярные механизмы инактивации трансгенов 37
1.2.4. Генетический контроль инактивации/реактивации трансгенов 40
1.3. Изменение проявления» собственных генов у трансгенных растений: Т-ДНК-индуцированные мутации 42
1.3.1. Возможные причины возникновения Т-ДНК индуцированных мутаций 42
1.3.2. Примеры Т-ДНК индуцированных мутаций у трансгенных растений 45
1.3.3. Перспективы использования инсерционного мутагенеза 53
Глава 2. Материалы и методы 55
2.1. Создание исходного материала 55
2.2. Подтверждение трансгенной природы растений-трансформантов 59
2.3. Анализ стабильности экспрессии маркерного гена nptll на селективных средах с антибиотиком канамицином 60
2.4. Анализ фрагментов векторной ДНК у трансгенных растений 62
2.5. Создание коллекции трансгенных растений табака с мутантным фенотипом 64
2.6. Анализ цитологического фенотипа трансгенных растений, характеризующихся измененной структурой цветка и пониженным уровнем мужской фертильності! 65
Глава 3. Результаты и обсуждение 67
3.1. Анализ популяции трансгенных растений табака по стабильности экспрессии маркерного гена nptll. 67
3.1.1. Анализ трансгенных растений табака сорта «Gatersleben» по стабильности экспрессии nptll-гена 67
3.1.2. Анализ трансгенных растений табака линии SR1 по стабильности экспрессии nptll-гена 3.1.3. Анализ инактивированного состояния гена nptll у трансгенных растений То-10, Nu22 и 3.1.4. Анализ стабильности экспрессии и наследование гена nptll у трансгенных растений табака (линия SR1) с одной инсер-цией Т-ДНК на геном 73
3.1.5. Анализ стабильности экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака (линия SR1) со множественными инсер-циями Т-ДНК на геном 78
3.1.6. Анализ стабильности экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака с отклонениями от менделевского расщепления 81
3.2. Анализ стабильности экспрессии гена nptll у трансгенных рас
тений табака при инбридинге 89
3.2.1. Наследование гена nptll у трансгенных растений линий Т0-5 иТ0-6 89
3.2.2. Анализ нестабильности экспрессии гена nptll у растений линий Т0-5 и Т0-6 96>
3.2.3. Анализ взаимодействия аллелей гена nptll у трансгенных растений линии Т0-5 108
3.3. Моделирование нестабильной экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений 119
3.4. Т-ДНК-индуцированные мутации у трансгенных растений табака 127
3.4.1. Создание и анализ коллекции трансгенных растений табака с мутантным фенотипом 127
3.4.2. Анализ цитологических нарушений мейоза у трансгенных растений табака линии Res79 144
3.4.3. Интеграция векторной ДНК в геном трансгенных растений табака 156
3.4.3.1. Анализ трансгенных растений табака с мутантным фенотипом на наличие в геноме векторной ДНК 156
3.4.3.2. Анализ трансгенных растений табака, не проявляющих мутантного фенотипа, на наличие в геноме векторной ДНК 159
3.4.4. Анализ районов встраивания Т-ДНК инсерций у трансген ных растений табака с мутантным фенотипом 161
Заключение 165
Выводы 172
Список литературы 174
Приложение 192
- Перенос созданных генетических конструкций в геном растений
- Изменение экспрессии перенесенных генов в новом окружении генома растений: эффект замолкания
- Анализ стабильности экспрессии и наследование гена nptll у трансгенных растений табака (линия SR1) с одной инсер-цией Т-ДНК на геном
- Анализ цитологических нарушений мейоза у трансгенных растений табака линии Res79
Введение к работе
Актуальность темы. Генетическая инженерия растений представляет собой новое направление в деятельности человека, которое позволяет целенаправленно, по заранее намеченной программе экспериментально модифицировать геном растений. Необходимо подчеркнуть, что разработанные к настоящему времени генно-инженерные методы и подходы дают возможность перестраивать геном растения с использованием генетической информации из разных гетерологических систем: вирусов, бактерий, насекомых, животных и человека. Более того, при использовании генно-инженерных методов существенно расширяются возможности модификации генома и внутри растительного царства, что снимает естественные барьеры между отдаленными видами растений. В этом случае становится возможным переносить отдельные гены в систематически удаленные виды, например, из однодольных в геном двудольных растений. Таким образом, к традиционным селекционно-генетическим методам дополнительно могут быть добавлены методы генетической инженерии, что позволит существенно расширить границы формообразовательного процесса при создании исходного материала. Реализация таких программ невозможна при использовании только традиционных методов селекции.
Успех любой селекционно-генетической программы, направленной на улучшение хозяйственно ценных признаков у растений с применением методов генетической инженерии определяется высоким и стабильным уровнем экспрессии перенесенных генов. Уже через несколько лет после создания первых трансгенных растений стало очевидно, что перенесенные гены функционируют в новом генетическом окружении растительного генома не всегда так, как предполагалось. Наблюдалась широкая вариабельность в экспрессии трансгенов среди индивидуальных трансформантов, а также случаи их полной инактивации.
Как правило, перенесенные гены наследуются согласно законам Менделя, однако к настоящему времени накоплено достаточно много примеров отклонений от менделевского наследования, обусловленных инактивирова-нием трансгенов. Потеря экспрессии (инактивирование) трансгенов, известное как «gene silencing», представляется как нежелательное явление при создании трансгенных растений. Несмотря на интенсивные исследования этого явления во многих ведущих биотехнологических центрах мира, причины и молекулярно-генетические механизмы все еще остаются до конца не выясненными.
Необходимо отметить, что замолкание генов встречается не только у трансгенных растений. Так, парамутации у кукурузы были известны еще задолго до обнаружения эффекта инактивации перенесенных генов (Brink, 1973). Однако только сравнительно недавно стали обозначаться общие черты между этими явлениями. Трансгенные растения, у которых перенесенные ге ны относительно легко идентифицируются и находятся в инактивированном состоянии, могут служить уникальными моделями для изучения молекуляр-но-генетических механизмов замолкания трансгенов, а также поиска путей преодоления этого феномена. Поэтому накопление любых экспериментальных фактов, касающихся феномена инактивирования трансгенов, может послужить важным шагом в его понимании, что явится дополнением к фундаментальным представлениям о функционировании генов в растениях.
Подобно мобильным генетическим элементам инсерции трансгенов в зависимости от места встраивания могут менять экспрессию отдельных генов у трансгенных растений, что фенотипически может выражаться в изменении каких-либо признаков у растений, в том числе и морфологических. Изменения различных признаков, вызванные внедрением фрагментов ДНК, классифицируются как инсерционные мутации. В настоящее время мутации, индуцированные у трансгенных растений внедрением фрагментов экзогенной ДНК, достаточно широко используются в ведущих зарубежных биотехнологических центрах для идентификации и клонирования генов, что является важным направлением по анализу структурно-функциональной организации генома растений.
Цель и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы явилось исследование эффектов проявления перенесенных (гетерологич-ных) генов в новом окружении растительного генома, а также эффектов проявления собственных генов (Т-ДНК мутации) у трансгенных растений.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Дать оценку стабильности экспрессии перенесенных генов у трансгенных растений. Выявить соотношение долей трансформантов с менделев- ским типом наследования трансгенов, а также трансформантов с отклонениями от ожидаемого типа расщепления на примере выборки из независимо полученных трансформантов.
2. Проанализировать стабильность сохранения перенесенного гена nptll у потомков двух независимо полученных трансгенных растений с одной инсерцией Т-ДНК на геном в течение нескольких поколений (при самоопылении).
3. Создать модельные трансгенные растения табака на основе гибридов, полученных от скрещивания трансформантов со множественными ин-серциями nptll-гена. Оценить влияние на стабильность проявления экспрессии маркерного гена nptll числа инсерции Т-ДНК.
4. Создать трансгенные растения табака, моделирующие нестабильный уровень экспрессии маркерного гена nptll введением дуплицированных фрагментов в состав генетических конструкций. Исследовать стабильность экспрессии nptll-гена у полученных модельных трансгенных растений табака и их гибридов.
5. Определить частоты появления растений с мутантным фенотипом среди трансгенных растений табака и создать коллекцию Т-ДНК индуцированных мутаций с измененным строением цветка и пониженной мужской фертильностью.
6. Изучить характер проявления и наследование мутантного фенотипа с измененным строением цветка и пониженной мужской фертильностью у созданных трансгенных растений табака.
7. Описать цитологический фенотип проявления мутации на примере трансгенного растения Res79 (нарушения мейоза, микроспоро- и микрога-метогенеза).
8. Оценить частоты встраивания в геном трансгенных растений фрагментов векторных ДНК.
9. Провести анализ нуклеотидных последовательностей районов интеграции Т-ДНК инсерций у отдельных трансгенных растений.
Основные положения, вынесенные на защиту.
1. В популяции независимо полученных трансгенных растений табака экспрессия маркерного гена nptll в новом окружении растительного генома может быть изменена уже среди потомков первого поколения от самоопыления (полная инактивация трансгена: мозаицизм по инактивации трансгена).
2. При инбридинге у потомков от самоопыления трансгенных растений табака в течение нескольких поколений экспрессия nptll-геш может быть изменена (инактивация и реактивация трансгена).
3. Введение в состав генетических конструкций дуплицированных фраг-хментов экзогенной ДНК в прямой и обратной ориентации приводит к нестабильности экспрессии nptll-гена как у потомков от самоопыления независимо полученных трансформантов, так и у гибридов от их скрещивания.
4. Перенесенные гены вызывают изменения проявления собственных генов у трансгенных растений (инсерционный мутагенез). Описан синдром морфологических изменений строения цветка и снижения уровня мужской фертильносте. Выявлены причины, приводящие к снижению мужской фертильносте, связанные с различными нарушениями мейоза, а также с цитомиксисом.
5. Фрагменты векторной ДНК могут быть перенесены в геном трансгенного растения и являться потенциальным источником мутационных изменений инсерционной природы.
6. Анализ состава нуклеотидных последовательностей районов интеграции Т-ДНК инсерций может свидетельствовать о предпочтительности районов встраивания фрагментов экзогенной ДНК при агробактериальной трансформации.
Научная новизна. Установлено, что у большей части независимо полученных методом агробактериального переноса трансгенных растений табака маркерный ген nptll наследуется потомками первого поколения от самоопыления в соответствии с законами Менделя, что свидетельствует о сохранении его стабильного уровня экспрессии. Отклонения от менделевского расщепления, свидетельствующие о нестабильности экспрессии перенесенных генов, в долевом отношении выявляются в 6 % случаев и полная потеря экспрессии — в 2 % случаев.
Стабильность экспрессии nptll-гена изменяется в потомстве гибридных растений. Показано, что среди 50 реципрокных комбинаций F2 у 15 независимо полученных моноинсерцнонных трансгенных растений табака в 18 % случаев наблюдались отклонения от менделевского расщепления по дигибридной схеме.
Установлено, что увеличение числа инсерций, интегрированных в разные группы хромосом, не влияло на стабильность экспрессии анализируемого маркерного гена. У гибридов, полученных от скрещивания трансформантов со множественными инсерциями Т-ДНК, не выявлено случаев полного инактивирования прШ-теш.
На примере линии Т0-5 трансгенных растений табака впервые выявлено три аллельных состояния nptll-геш (активное, инактивированное и реактивированное). Проведен генетический анализ взаимодействия аллелей nptll-гена. Установлен доминантный характер наследования аллеля, определяющего активное состояние nptll-геяа по отношению к рецессивному характеру наследования аллеля, определяющего его инактивированное состояние.
Создана серия трансгенных растений табака, моделирующих нестабильный уровень экспрессии гена nptll введением дуплицированных повторенных фрагментов (в прямой и обратной ориентации) в состав Т-ДНК инсерций. Впервые показано, что инактивация гомологичных трансгенов существенно возрастает в геноме гибридных растений.
Впервые создана коллекция трансгенных растений табака, проявляющих мутантный фенотип (измененное строение цветка и пониженный уровень мужской фертильносте) для дальнейшего анализа флорального морфогенеза, микроспоро- и микрогаметогенеза.
Впервые проведен детальный цитологический анализ мейоза у растения Res79, выявивший серию нарушений, проявляющихся в различной степени среди других трансгенных растений с мутантным фенотипом. Нарушения включали образование деформированных ядер в телофазе I и ориентацию веретен деления в метафазе II мейоза, перфорацию клеточной стенки с образованием цитомиктических каналов и перемещением по ним хроматина из одного мейоцита в другой, приводящих к образованию полиад и формированию пыльцевых зерен с пониженной фертильностью.
Показано, что при агробактериальной трансформации в геном трансгенного растения могут быть перенесены фрагменты векторных ДНК. Установлено, что среди независимо полученных трансформантов доля растений с фрагментами векторных ДНК составила 33 %.
Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов растительных ДНК, фланкирующих Т-ДНК встройки, в отдельных случаях выявил наличие гомологии с известными нуклеотидными последовательностями мирового банка данных «Gene bank».
Научная и практическая ценность работы. Настоящая работа направлена на изучение особенностей проявления гетерологичных генов у трансгенных растений, а также на изучение их влияния на проявление собственных генов растения (Т-ДНК-мутации). Охарактеризована популяция независимо полученных трансгенных растений табака по стабильности экспрессии маркерного гена nptll, установлено долевое соотношение групп растений со стабильным уровнем экспрессии, соответствующим расщеплению потомков в соответствии с законами Менделя. Выделены группы растений, проявляющие отклонения от менделевского расщепления, что свидетельствует о нестабильности экспрессии, а также группа растений с полной потерей экспрессии исследуемого трансгена. Проведен анализ наследования трансгенов у гибридов от скрещивания трансгенных растений с одной и множественными Т-ДНК-инсерциями. Полученные результаты могут служить основой при создании хозяйственно ценных сортов, созданных при объединении нескольких трансгенов в геноме гибридов. Впервые проанализировано сохранение стабильного уровня экспрессии гена nptll у потомков двух независимо полученных линий трансгенных растений табака в течение нескольких поколений. Показано, что у части потомков линии Т0-5 экспрессия анализируемого гена может быть инактивирована и в последующих поколениях восстановлена у отдельных потомков. Проанализировано взаимодействие аллелей гена nptll. Создана серия трансгенных растений табака, моделирующих нестабильный уровень экспрессии nptll-гена введением ду-плицированных фрагментов (в прямой и обратной ориентации) в состав Т-ДНК инсерций. Установлено, что инактивация гомологичных трансгенов существенно возрастает в геноме гибридных растений. Полученные результаты представляют большое значение для дальнейших фундаментальных и прикладных исследований по изучению функционирования генов растений. Создана серия трансгенных растений табака с мутантным фенотипом. Установлено, что растения с мутантным фенотипом выявляются среди независимо полученных трансформантов с частотой около 5 %. Большая часть растений с мутантным фенотипом проявляла сцепленное наследование измененного признака с устойчивостью к антибиотику, что подтверждало их инсер-ционную природу. Проведен детальный цитологический анализ нарушений мейоза, приводящих к снижению мужской фертильности. Установлено, что при агробактериальной трансформации одновременно с Т-ДНК в геном растения могут быть перенесены фрагменты бактериальной ДНК, что представляется нежелательным с точки зрения коммерческого использования трансгенных растений. Полученные результаты представляют большое значение при разработке и уточнении правил по биобезопасности использования генетически модифицированных организмов.
Данные, полученные в ходе исследования, используются при чтении лекций в курсе «Генетическая инженерия растений» в Томском государственном университете.
Аппробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях, симпозиумах и конгрессах:
1. International conference «Plant biotechnology and molecular biology», Moscow, 1991.
2. International Conference «Plant Biotechnology and Genetic Engineering», Oct. 3-6, Kiev, Ukraine, 1994.
3. Plant Genome III Conf., SanDiego (January 15-19), 1995.
4. Международная конференция, посвященная памяти акад. А.А. Баева. Москва, 20-22 мая, 1996.
5. German-Russian Cooperation in Biotechnology. Workshop IV. Russia, St-Petersburg. October 10-13, 1996.
6. Международная конференция «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». Москва, 1997.
7. Международная конференция «Новые направления биотехнологии». Москва, 27-29 апреля, 1998.
8. International Congres «Plant Biotechnology and in vitro biology in the 21st century». Jerusalem, Israel, June 14-19, 1998.
9. Всероссийский симпозиум «Изучение генома и генетическая трансформация растений». 23-27 августа 1999, Иркутск.
10. IV съезд Общества физиологов растений (ОФР), 4-9 октября 1999, Москва.
11.11 съезд Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), 1-5 февраля 2000.
12. International conference «Plant Biotechnology - Facing the New Millenium», 16-18 Oct. 2000. Kostinbrod. Bulgaria.
13. Международный симпозиум «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология», Москва (18-21 ноября) - Минск (22-24 ноября) 2001.
14. 1-й Международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва, 14-18 октября 2002.
15. 2-я конференция Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова. Москва, 20-21 февраля 2003.
16. 8-я Международная конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Саратов. 9-13 сентября 2003.
17. 2-й Международный конгресс «Биотехнология — состояние и перспективы развития». Москва, 10-14 ноября 2003.
Список работ по теме диссертации, опубликованных в журналах и периодических изданиях:
1. Дейнеко Е.В., Ривкин М.И., Комарова М.Л., Вершинин Л.В., Шумный В.К. Генетическая трансформация люцерны с использованием Ті-плазмидной системы Agrobacterium tumefaciens II Докл. АН. 1991. Т. 19, №6. С. 1473-1476.
2. Дейнеко Е.В., Ситникова В.В., Ривкин М.И. К вопросу о стабильности встраивания и наследования чужеродных генов в геноме трансгенных растений // Особенности реконструкции генома и популяций высших растений. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 1993. С. 16-23.
3. Ривкин М.И., Дейнеко Е.В., Комарова М.Л., Кочетов А.В., Шумный В.К. Оценка вирусоустойчивости трансгенных растений табака, несущих ген бета-интерферона человека//Докл. АН. 1993. Т. 331. С. 652-654.
4. Дейнеко Е.В., Ривкин М.И., Шумный В.К. Использование методов генетической инженерии в селекционно-генетических программах по улучшению хозяйственно-ценных признаков растений // Особенности реконструкции генома и популяций высших растений. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 1993. С. 5-15.
5. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Филипенко М.Л., Кочетов А.В., Шумный В.К. Изменение уровня экспрессии и наследование маркерного гена nptll в потомстве трансгенных растений табака Nicotiana tabacwn L. II Докл. АН. 1995. Т. 344, № 3. С. 407-411.
6. Rivkin M.I., Deineko E.V., Komarova M.L., Shumnyi V.K. Analysis of virus resistance of tobacco and alfalfa transgenic plants bearing human P-interferone gene II Biotechnol. and Biotechnolog. Equipment. 1995. N 1. P. 40-44.
7. Deineko E.V., Zagorskaya A.A., Filipenko M.L., Filipenko E.A., Novo-selya T.V., Komarova M.L., Kochetov A.V., Shumny V.K. Instability of nptll gene expression in the progeny of transgenic tobacco plants II Biotechnol. and Biotechnolog. Equipment. 1996. N 3. P. 89-92.
8. Кочетов А.В., Шакирова H.B., Лукашева В.В., Пилюгин М.В., Комарова М.Л., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Экспрессия бицистронов у трансгенных растений // Докл. АН. 1996. Т. 349, № 4. С. 549-582.
9. Кочетов А.В., Лукашева В.В., Пилюгин М.В., Комарова М.Л., Ривкин М.И., Дейнеко Е.В., МакКлин Ф., Шумный В.К. Оперонная организация транскрипционных единиц в клетках растений: экспрессия модельных бицистронов // Цитология и генетика. 1997. № 6. С. 17-28.
10. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Филипенко М.Л., Кочетов А.В., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений при инбридинге // Генетика. 1998. Т. 34, № 9. С. 1212-1219.
11. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Стабильность экспрессии и наследование гена nptll в популяции трансгенных растений табака // Докл. АН. 1999. Т. 369, № 3. С. 420-423.
12. Дейнеко Е.В., Сидорчук Ю.В., Загорская А.А., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Аномалии строения цветков и мужская стерильность у трансгенных растений табака // Докл. АН. 1999. Т. 368, № 1. С. 135-138.
13. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака со множественными инсерция-ми // Генетика. 2000. Т. 36, № 3. С. 427-430.
14. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 3. С. 446-452.
15. Филипенко Е.А., Филипенко М.Л., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Анализ сайтов встраивания Т-ДНК у трансгенных растений табака с мутантным фенотипом //Докл. АН. 2000. Т. 370, № 2. С. 273-276.
16. Сидорчук Ю.В., Загорская А.А., Дейнеко Е.В., Шамина Н.В., Шумный В.К. Т-ДНК индуцированные аномалии цветков и мужская стерильность у трансгенных растений табака: морфометрический и цитологический анализ // Цитология и генетика. 2000. Т. 34, № 6. С. 3-8.
17. Шамина Н.В., Дорогова Н.В., Сидорчук Ю.В., Загорская А.А., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Нарушения мужского мейоза в трансгенной линии res9\ табака // Цитология. 2000. Т. 42, № 12. С. 1173-1178.
18. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Сидорчук Ю.В., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Комарова М.Л., Шумный В.К. Особенности морфологических признаков и фертильносте пыльцы у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 1. С. 73-78.
19. Shamina N.V., Dorogova N.V., Zagorskaya A.A., Deineko E.V., Shumny V.K. Abnormalities of meiotic division caused by T-DNA tagged mutation in tobacco {Nicotiana tabacum) IICBI. 2001. V. 25, N 4. P. 367-369.
20. Novoselya T.V., Deineko E.V., Filipenko E.A., Shumny V.K. Expression stability of marker gene nptll in transgenic plants Nicotiana tabacum L. with single T-DNA insertion // Biotechnol. and Biotechnolog. Equipment. 2001. V. 15, N2. P. 3-7.
21. Загорская A.A., Дейнеко E.B., Сидорчук Ю.В., Шумный В.К. Наследование признака измененного строения цветка и устойчивости к антибиотику канамицину у трансгенных растений табака // Генетика. 2001. Т. 37, № 6. С. 784-790.
22. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская А.А., Филипенко Е.А., Пухначе-ва Н.В., Шумный В.Л. Инактивирование чужеродных генов у трансген ных растений табака (обзор) // Изучение генома и генетическая трансформация растений. Новосибирск: Наука, 2001. С. 132-142.
23. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В. Моделирование нестабильности экспрессии nptll-гена у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2002. Т. 49, № 3. С. 437-443.
24. Сидорчук Ю.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Цитомнксис в материнских клетках пыльцы у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) II Докл. АН. 2004. Т. 394, № 2. С. 282-285.
25. Deineko Е., Kieft Н., Anne Mie Emons, van Lammeren A.A.M. T-DNA insertions leads to male sterility in tobacco through cytomixis and chromatin translocation. Protoplasma, 2004.
Объем и структура работы. Работа изложена на 198 страницах и состоит из введения, трех глав с описанием современного состояния проблемы на основании источников литературы, описанием исходного материала и методов, используемых при решении поставленных задач, экспериментальных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 249 наименований и приложения. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 54 рисунками. Фактический материал получен автором лично, а также в ходе работ с сотрудниками Института цитологии и генетики СО РАН.
Работа выполнена в лаборатории гетерозиса растений Института цитологии и генетики СО РАН, а также в лаборатории биологии растительных клеток университета г. Вагенингена в Нидерландах и в разные периоды была поддержана отечественными и зарубежными грантами, в которых соискатель была исполнителем и руководителем:
- РФФИ (№ 02-04-49295) - Молекулярно-генетический анализ Т-ДНК индуцированной изменчивости у трансгенных растений табака.
- РФФИ-Белорусия (№ 00-04-81077Бел2000а) - Мутационная изменчивость у растений рода Solanaceae как результат интеграции чужеродной ДНК.
- РФФИ (№ 00-04-49557) - Молекулярно-генетические механизмы функционирования чужеродных генов в геноме трансгенных растений.
- РФФИ (№ 99-04-49324) - Т-ДНК индуцированная изменчивость у трансгенных растений табака: молекулярно-генетический и цитологический анализ.
- РФФИ (№ 97-04-48763) - Инактивирование чужеродных генов в геноме трансгенных растений: молекулярно-генетические механизмы.
- РФФИ (№ 97-04-49334) - Нестабильность экспрессии чужеродных генов в поколениях трансгенных растений: исследование роли дупликаций в структуре Т-ДНК.
- РФФИ (№ 96-04-51075) - Наследование и стабильность экспрессии чужеродных генов в геноме трансгенных растений: молекулярно-генетический анализ гена nptll у трансгенных растений табака.
- РФФИ (00-15-97968) - Особенности преобразования геномов и функционирование генов в процессе хромосомной и генной инженерии растений.
- Грант Минпромнауки № 43.106.11.11.0004 - Создание трансгенных растений - биопродуцентов белков медицинского назначения.
- Госконтракт 43.050. 11.1537 от 05.02.2002 - Молекулярно-биологический анализ генетических факторов, влияющих на «замолкание» целевого гена в ряду поколений трансгенных растений табака.
- Грант IAC (2002, Wageningen, The Netherlands) для проведения исследований по анализу цитологического фенотипа у трансгенных растений линии Res79.
Автор выражает благодарность директору Института цитологии и генетики СО РАН академику В.К. Шумному за предоставленную возможность и помощь в выполнении данной работы. Автор выражает крайнюю признательность сотрудникам лаборатории гетерозиса растений и сектора генетической инженерии растений Института цитологии и генетики СО РАН, а также Хенку Кифту, Андре Ван Ламмерену и Анни Мие Эмонс (университет г. Вагенингена, Нидерланды), которые на разных этапах исследований принимали участие либо в выполнении ряда экспериментов, либо обсуждении полученных данных, что нашло отражение в совместных публикациях.
Перенос созданных генетических конструкций в геном растений
В настоящее время существуют два основных способа переноса генетических конструкций в геном высших растений. Один из них основан на природной способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть своей ДНК в растительный геном. Второй подход заключается в прямом экспериментальном переносе экзогенной ДНК в растительную клетку (при помощи генной пушки, методом электропорации протопластов, микроинъекциями и т. д.).
Разработка таких подходов для переноса созданных генетических конструкций в геном растений была вызвана двумя причинами. Первая из них состояла в том, что A. tumefaciens способна заражать только определенный круг хозяев, ограниченный, как правило, двудольными растениями. Другая причина заключалась в том, что клетки растений покрыты снаружи целлюлозными оболочками, создающими естественный барьер для проникновения фрагментов экзогенной ДНК. Именно для однодольных растений развивались методы, основанные на преодолении этого барьера. Часть методов была направлена на временное разрушение целлюлозных оболочек (электро-порация протопластов) с последующим их восстановлением в культуре in vitro после того, как фрагменты экзогенной ДНК проникали в ядерный геном. Тогда как другая часть методов была связана с частичным разрушением целостности целлюлозных оболочек, что обеспечивало перемещение фрагментов экзогенной ДНК в растительные клетки (микроинъекции, генная пушка). Так как в диссертационной работе все трансгенные растения табака, используемые в качестве моделей, были получены методом агробакте- риальной трансформации, остановимся более подробно на особенностях переноса фрагментов экзогенной ДНК посредством почвенных бактерий рода Agrobacterium.
1.1.3.1. Лгробактериальная трансформация: генетическая карта Ti-плазмиды и Т-ДНК
Почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens способна вызывать в местах поранения у двудольных растений неопластический рост зараженных клеток (van Larebeke et al., 1975). Это заболевание известно под названием «корончатые галлы». Инфицирующим фактором данного заболевания является опухолеродная мегаплазмида pTi.
Геном A. tumefaciens представлен одной хромосомой и множеством (200-250) кольцевых фрагментов ДНК (плазмид) разного размера. Плазми-ды большого размера (200-250 т.п.н.) получили название мегаплазмид. Мегаплазмида pTi (tumor inducing plasmid) выполняет роль инфицирующего фактора заболевания «корончатые галлы». На рисунке 2 представлена генетическая карта Ti-плазмиды. Как видно из рисунка, основными составными частями Ti-плазмиды являются область Т-ДНК, гены катаболизма ферментов, Vir-область и сайт инициации репликации в A. tumefaciens. Часть плаз-миды, способная переноситься в растительную клетку и встраиваться в ядерный геном, получила специальное название - Т-ДНК (от английского transferred DNA). Остальная часть плазмиды, не принадлежащая к Т-ДНК,
Фрагмент Т-ДНК (рис. 2) фланкирован прямыми повторами длиной 25 п.н. (правая и левая пограничные последовательности) и содержит гены двух типов: онкогены, кодирующие ферменты биосинтеза ростовых факторов растения (ауксинов и цитокининов), и ген синтеза опинов. Неопластический рост инфицированных клеток, вызванный экспрессией ростовых факторов, создает экологическую нишу, а секретируемые опины служат источником углерода и азота для агробактерий. Помимо Т-ДНК Ті-плазмида содержит гены катаболизма опинов и гены вирулентности, необходимые для ее переноса в растительную клетку и стабильной интеграции в ядерный геном (De la Riva et ah, 1998). В процессе агробактериального заражения фрагмент Ті-плазмидьі (Т-ДНК) переносится в растительную клетку и интегрируется с ядерным геномом. Перенос осуществляется координированным действием генов (как правило, представленных шестью оперонами), расположенных в Vir-области мегаплазмиды.
Делегирование любого участка Т-ДНК, кроме прямых повторов, не влияет на стадию её переноса. Таким образом, любая последовательность ДНК (например, созданные генно-инженерными методами генетические конструкции (рис. 1), находящаяся между правым и левым пограничными районами Ti-плазмиды, может быть перенесена в растительный геном. На основе Ti-плазмиды A. tumefaciens была сконструирована серия так называемых «обезоруженных» (не содержащих онкогены) векторов, что положило начало прикладной генетической инженерии.
О процессе агробактериальной трансформации накоплена обширная информация, которая обобщена в ряде обзоров (Zambryski et al, 1989; Zambryski, 1992; Tinland, 1996), в том числе и в отечественной литературе (Лутова и др., 1998; Ли, Тинланд, 2000; Чумаков, 2001). Остановимся на основных этапах агробактериального переноса, концентрируя внимание на отдельных событиях, которые в дальнейшем у трансгенных растений могут быть причиной изменения экспрессии (инактивирования) перенесенных генов, а также различных мутационных перестроек.
Общая схема агробактериального переноса представлена на рисунке 3. Процесс переноса Т-ДНК в геном растения регулируется генами {Л, В, G, С, D, Е), расположенными в Vir-области Ti-плазмиды. Экспрессия этих генов запускается и регулируется фенольными соединениями, которые выделяют растительные клетки в ответ на поранение. Т-область Ti-плазмиды (фрагмент ДНК, расположенный между повторами) реплицируется и вырезается из плазмиды по фланкирующим повторам. В этом процессе принимают участие белки VirDl и VirD2, причем последний остается тесно связанным с 5 -концом Т-нити, обеспечивая полярность образуемого Т-комплекса. Белок VirE обеспечивает защитную функцию Т-нити от действия нуклеаз, связываясь неспецифически с одноцепочечной ДНК. Белок VirB принимает участие в образовании канала, через который Т-комплекс (Т-нить, стабилизированная белками VirD2 и VirE) перемещается от плазм иды по цитоплазме аг-робактериальной клетки к периферии и выходит из нее перемещении Т-комплекса по растительной клетке в настоящее время полной ясности еще нет. Однако процесс интеграции Т-ДНК в ядерный геном растения исследован достаточно подробно (Gheysen et al., 1991; Mayerhofer et al., 1991; Tinland et al, 1995; Tinland, 1996). Схематично процесс встраивания Т-ДНК в геном растения представляется следующим образом: З -конец Т-ДНК находит участок гомологии с растительной ДНК, инициируя таким образом синапсис между растительной ДНК и Т-ДНК. Фрагмент растительной ДНК вырезается и разрушается эндонуклеазами. Вторая нить растительной ДНК также вырезается рестриктазами репарационной системы растения и достраивается до 5 -конца, используя спарившийся в месте микрогомологии участок как матрицу. В результате этого часть ДНК растения в месте интеграции Т-ДНК фрагмента оказывается делетированной (Tinland et al, 1994; Takano et al, 1997; Porsch et al, 1998). Таким образом, процесс интеграции Т-ДНК фрагмента при агробактериальной трансформации не только сопровождается нарушением целостности района расположения гена (генов) растения, но и связан с потерей фрагментов растительной ДНК в месте встройки (делеции). Это дает основание рассматривать процесс трансформации растений как мутационный. Более того, сам процесс интеграции фрагмента Т-ДНК в растительный геном с точки зрения классической генетики также можно отнести к мутационным и рассматривать как инсерции.
Изменение экспрессии перенесенных генов в новом окружении генома растений: эффект замолкания
Феномен инактивирования чужеродных генов в новом окружении растительного генома представляется одним из интереснейших и загадочных явлений, с которым сравнительно недавно столкнулись исследователи при модификации генома растений методами генетической инженерии. Изучение и понимание этого явления могло бы дать более глубокое представление о путях и механизмах регуляции экспрессии генов, а трансгенные растения можно было бы использовать как уникальные модели для изучения функционирования чужеродных генов в растительном геноме.
Первые сообщения о замолкании перенесенных генов в геноме трансгенных растений появились к началу 1990-х годов (Matzke et ah, 1989; Linn et ah, 1990). Авторами было показано, что у большей части проанализированных трансформантов перенесенные гены стабильно экспрессировались и наследовались, однако в отдельных случаях происходила потеря их экспрессии. В настоящее время зарубежные исследователи, как правило, употребляют термин «эпигенетический сайленсинг» (epigenetic silencing) в отличие от первоначального «gene silensing» (Matzke М.А., Matzke A.J.M., 1998). Инактивированное состояние перенесенных генов является обратимым. Описаны случаи восстановления экспрессии трансгенов у отдельных потомков трансгенных растений (Scheid et ah, 1991).
В первых экспериментах по оценке стабильности сохранения и наследования перенесенных генов было показано, что чужеродные гены, интегрированные в ядерную ДНК растительных клеток, наследуются как доминантные мутации (Potrycus et ah, 1985; Heberle-Bors et al., 1988; Christou et al., 1989). Однако вовлечение в анализ большого числа исходных трансгенных растений и их потомков позволило выявить генотипы с полной потерей экспрессии трансгенов, что по результатам генетического анализа приводило к несоответствию с классическими законами менделевского расщепления (Deroles, Gardner, 1988; Sheide/al., 1991).
Известно много примеров замолкания перенесенных генов у различных видов двудольных и однодольных растений: табака, A. thaliana, петунии, сои, риса и т. д. (Matzke et ah, 1989; Kilby et al, 1992; Meyer et al, 1992; Christou et ah, 1989; Itoch et ah, 1997). Известны случаи потери экспрессии трансгенов у отдельных линий клеточных суспензий, индуцированных из эксплантов трансгенного растения люцерны (Walter et ah, 1992). Случаи замолкания выявлены у трансгенных растений, полученных методами агро-бактериальной трансформации (Matzke et ah, 1989; Heberle-Bors et ah, 1988), биобаллистики (Stiff et ah, 1995), микроинъекций и микропорации (Potrykus et al., 1985; Hain et al., 1985), т.е. замолкание трансгенов не зависело от способов введения чужеродных генов в геном растения.
С точки зрения коммерческого использования трансгенных растений, феномен замолкания перенесенных генов представляется нежелательным явлением. По сообщению Финнеган и МакЭлрой (Finnegan, McEIroy, 1994) уже в первой половине 1990-х годов более 30 фирм и исследовательских групп, интенсивно работающих в направлении улучшения хозяйственно ценных признаков растений методами генетической инженерии, столкнулись с проблемой инактивации чужеродных генов. Так, при полевых испытаниях трансгенных растений табака с геном csr-1-l, обеспечивающим устойчивость к некоторым видам гербицидов, более половины гомозиготных по трансгену растений теряли устойчивость и погибали (Brandle et al., 1995). В полевых испытаниях 38 комбинаций от скрещиваний 13 гомозиготных по трансгену линий табака, что составило более 8 тыс. трансгенных растений, были продемонстрированы различные уровни экспрессии перенесенных генов, в том числе и инактивирование (Palauqui, Vaucheret, 1995). Исследование большой выборки трансгенных растений петунии (около 10 тыс.), несущих в геноме ген Al из кукурузы (кирпично-красное окрашивание цветков), выявило широкую вариабельность проявления анализируемого признака в течение всего вегетационного периода (Meyer et al., 1992).
Вышеперечисленные примеры поставили перед исследователями ряд вопросов: с какой частотой чужеродные гены инактивируются в геноме трансгенного растения; что является причинами и каковы молекулярные механизмы инактивирования трансгенов; является ли данный феномен случайным событием или отражает более общие механизмы защиты растений на внедрение чужеродной ДНК, например, механизмов защиты растений от вирусной инфекции.
При анализе данных литературы по частотным характеристикам инактивирования чужеродных генов необходимо отметить относительно широкий диапазон встречаемости данного явления у разных видов трансгенных растений. Так, например, в разных группах трансгенных растений табака частота инактивирования трансгенов изменялась от 8 до 36% (Heberle-Bors et al, 1988), а у A. thaliana - от 10 до 50 % (Schmidt, Willmizer, 1988; Scheid et al, 1991). В экспериментах с трансгенными растениями табака (К ТаЪасит, сорт «Gatersleben» и линии SR1) частота замолкания nptll-гона изменялась в пределах от 6,6 % до 7,9 % (Дейнеко и др., 1995; 1999; Deineko et al., 1996).
Потеря экспрессии перенесенных генов часто связывается у трансгенных растений со множественными инсерциями экзогенной ДНК (Hobbs et ah, 1990), тогда как, по мнению Финнеган и МакЭлрой (Finnegan, McEIroy, 1994), у растений с единичными инсерциями наблюдается стабильная экспрессия чужеродных генов в последующих поколениях. Стабильная экспрессия nptll-гена. отмечена у трансгенных растений петунии и табака, содержащих множественные инсерции Т-ДНК в геноме (Renckens et aL, 1992; Van der Hoeven et aL, 1994).
Так как число инсерции чужеродной ДНК возрастает при скрещивании трансгенных растений между собой, то вполне возможно было бы ожидать появление случаев инактивирования маркерного гена nptll и смоделировать это явление в гибридном поколении. Установлено (Cherdshewasart et aL, 1993), что увеличение числа инсерции nptll-гена приводило к отклонениям от расщепления по Менделю и к увеличению доли гибридов, проявляющих канамицин-неустойчивый фенотип в условиях селективной среды: в 43 % гибридных комбинаций, полученных от скрещивания трансформантов с одной инсерцией на геном, соотношение устойчивых и неустойчивых к антибиотику растений составило 3 : 1 вместо ожидаемого 15:1. Такое соотношение потомков возможно в том случае, если один из перенесенных nptll-rciioB фенотипически не проявляется. При скрещивании растений с тремя инсерциями наблюдалась нестабильная экспрессия перенесенных генов у всех гибридных растений.
Анализ стабильности экспрессии и наследование гена nptll у трансгенных растений табака (линия SR1) с одной инсер-цией Т-ДНК на геном
Как установлено нами ранее, одно растение (То-10) сорта «Gatersleben» (табл. 1) и два трансформанта (Nu22 и 615) популяции независимо полученных трансгенных растений табака линии SR1 (табл. I, Приложение), характеризовались нестабильным уровнем экспрессии гена nptll. Все потомки от самоопыления этих растений проявляли Кт-неустойчивый фенотип в условиях селективной среды. Km-неустойчивый фенотип сохранялся и у потомков второго поколения от самоопыления этих растений. Однако у растения 615 во втором поколении была выявлена реверсия к Km-устойчивому фенотипу. Отсутствие устойчивости к антибиотику у потомков выделенных из популяции трансформантов То-10, Nu22 и 615 могло быть связано с рядом причин, среди которых могли быть такие, как много-копийность Т-ДНК инсерций, химерность растительных тканей у исходных трансформантов, микроделеции и мутации по районам Т-ДНК, встраивание инсерций в пшерметилированные участки генома и т. д.
Феноменологически случаи «замолкания» чужеродных генов среди потомков первого поколения трансгенных растений описаны для разных видов растений: табака, петунии, A. thaliana и др. (Schmidt, Willmizer, 1988; Scheid et al., 1991; Meyer, Heidmann, 1994). Известно, что у растений табака частота инактивирования трансгенов изменялась от 8 % до 36 % (Heberle-Bors et al, 1988), а у A. thaliana от 10 % до 50 % (Schmidt, Willmizer, 1988; Scheid et al., 1991) при анализе четырех независимых популяций. На наш взгляд, эти данные следует интерпретировать с учетом возможной химерності! растительных тканей у исходных трансгенных растений. Шмюллинг и Шелл (Schmulling, Schell, 1993) показали, что у растений табака возможно образование химер (растений с двумя типами клеток - с интеграцией трансгена в ядерную ДНК и без нее). Однако в данном конкретном случае мы не ставили перед собой задачу выяснения причин потери экспрессии маркерного гена у этой группы растений.
Известно, что встраивание в растительный геном одной копии Т-ДНК, как правило, связано со стабильным уровнем экспрессии перенесенных генов (Gendloff et al, 1990; Finnegan, McElroy, 1994; Matzke, Jorgensen, 1996; Matzke M.A., Matzke A.J.M., 1998). По мнению Finnegan и McElroy, такие растения являются предпочтительными с точки зрения их коммерческого использования в качестве исходного материала для дальнейшего селекционного отбора и создания сортов (Finnegan, McElroy, 1994). В связи с этим представляло интерес проанализировать стабильность экспрессии и наследование гена nptll у выделенных нами трансгенных растений с одной Т-ДНК инсерцией на геном.
В таблице 3 представлены данные соотношений Кт+- и Кт -потомков от самоопыления трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК на геном. В исследуемую группу были включены потомки Ті трансформантов, выделенных нами ранее из популяции 102 независимо полученных трансгенных растений табака линии SR11.
1 Анализ стабильности экспрессии гена nptll у растении с одной инсерцией Т-ДНК на геном сорта «Gatersleben» будет представлен в разделе 3.2. при обсуждении инактивирования трансгенов при инбридинге.
Необходимо отметить, что в таблице 3 представлены суммарные данные по соотношению Кт+- и Кт -потомков от самоопыления трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК на геном. Первичные данные вынесены в таблицу II (Приложение). Для каждого номера в условиях селективной среды было проверено потомство от самоопыления 4 растений Ті.
Так как в анализируемую группу растений были включены трансформанты, у которых соотношение Кт+- и Кт -потомков в условиях селективной среды соответствовало 3 : 1 (табл. I, Приложение), то среди растений Ті следовало ожидать появление либо только Km-устойчивых особей, либо расщепление ЗКт+ : 1Кт Если Кт-устойчивое растение первого поколения было гомозиготой по трансгену (гену nptll), то все его потомки в условиях селективной среды должны проявлять Km-устойчивый фенотип. Если исходное растение было гемизиготой по трансгену, то при наличии в геноме одной встройки Т-ДНК расщепление среди потомков по Кт+- и Кт -фенотипам должно соответствовать 3:1.
Из результатов, суммированных в таблице 3 видно, что практически все анализируемые номера трансгенных растений табака, отнесенные к группе трасформантов с одной инсерцией Т-ДНК на геном, в условиях селективной среды во втором поколении от самоопыления проявляли Km-устойчивый фенотип, что соответствовало гомозиготам по анализируемому гену {прҐ/прҐ), либо давали расщепление 3 : 1 (прҐ/npf). Именно такие гомозиготы по прШ-гсиу были выделены у исследуемых растений в результате проведенного анализа: Nu41/1, Nu41/2; Nu44/1, Nu44/4; Nu45/2-Nu45/4; Nu48/3, Nu48/4; Nu49/3; Nu410/1, Nu410/2; Nu411/2 (табл. II, Приложение).
Исключение составили два номера, Nu42 и Nu410, у которых наблюдались отклонения от ожидаемого менделевского расщепления для моногибридных комбинаций скрещиваний (табл. 3). Соотношение 2Кт+ : 1Кт -потомков у растения Nu42 во всех 4 потомствах Т\ может быть связано с такими возможными причинами, как потеря экспрессии nptll-гепа в гомозиготе, а также со встраиванием трансгена в район, связанный с гибелью гамет на ранних стадиях. Рассматриваемые причины отсутствия класса гомозигот по трансгену описаны в литературе ранее другими авторами (Neuhuber et al., 1994). Появление соотношения 15Km+ : lKra среди потомков одного из четырех Ті растений может быть обусловлено восстановлением инактивиро-ванного состояния перенесенного гена, локализованного во второй Т-ДНК инсерции. Такие случаи реверсий трансгенов от инактивированного состояния к активному известны по данным литературы (Prols, Meyer, 1992). Мы также неоднократно сталкивались с таким феноменом в наших экспериментах по анализу стабильности экспрессии перенесенных генов в новом генетическом окружении растительного генома (Дейнеко и др., 2000).
В дальнейшем представляло интерес сопоставить результаты тестирования потомков трансгенных растений в условиях селективной среды с данными о числе инсерции, подтвержденными блот-гибридизацией по Саузерну. На рисунке 15 представлена блот-гибридизация геномных ДНК трансгенных растений (Ті): Nu49, Nu44, Nu45 и Nu410 и гибридов, полученных от их скрещивания, с 32Р-меченым фрагментом гена nptll. На дорожках 1-4 нанесены EcoR-гидролизаты геномных ДНК вышеперечисленных номеров, а на дорожках 5-7 - EcoR-гидролизаты геномных ДНК, выделенных из гибридов (рис. 15). Выявление одной гибридизационной полосы у анализируемой группы трансгенных растений свидетельствует об одной инсерции Т-ДНК в геноме исследуемого трансформанта. Таким образом, данные блот-гибридизации по Саузерну подтвердили число инсерции (одна Т-ДНК инсерция на геном), установленное нами ранее по соотношению Кт+ : Кт -потомков в условиях селективной среды для растений Nu49, Nu44, Nu45 и Nu411. Как видно из рисунка 15, в EcoR-гидролизатах геномных ДНК, выделенных из гибридов анализируемых растений, присутствовали оба фрагмента ДНК, представленные у соответствующих для данной комбинации скрещиваний родительских форм. Сопоставление данных о расщеплении среди потомков от скрещивания вышепе
Анализ цитологических нарушений мейоза у трансгенных растений табака линии Res79
Итак, обобщенная картина цитологических нарушений при формировании материнских клеток пыльцы у трансгенных растений линии Res79 в целом включает следующие отклонения:
1. Цитомиксис в профазе I первого мейотического деления материнских клеток пыльцы. Первые цитомиктическне перемещения хроматина из одного мейоцита в другой начинаются после последнего митотического деления до вступления клеток в мейоз.
2. Перфорация клеточной мембраны с образованием цитомиктических каналов.
3. Образование деформированных ядер в профазе II второго деления мейоза.
4. Нарушение ориентации веретен деления в метафазе II второго деления мейоза.
5. Образование полиад. Формирование пыльцевых зерен с пониженной фертильностью.
Необходимо подчеркнуть, что цитологическая картина нарушений, выявленная у растений линии Res79, наблюдалась у большей части коллекции трансгенных растений табака с мутантным фенотипом. Это дает основание предположить, что инсерции Т-ДНК могли произойти в районы расположения генов, контролирующих протекание такого сложного процесса, как мейотическое деление клеток.
Не совсем ясным остается вопрос об однотипности наблюдаемых изменений среди созданной коллекции трансгенных растений табака, проявляющих мутантный фенотип. С одной стороны, при создании исследуемой коллекции трансгенные растения отбирались только по признаку нарушения строения цветка. В связи с этим могли быть отобраны однотипные мутации, вызванные нарушением сложной цепи генов, принимающих участие в контроле таких процессов, как формирование цветка и генеративных органов. В этом направлении представляется интересным проанализировать возможные нарушения, которые могли затронуть и формирование женского гаме-тофита. Данная работа начата в рамках договора о совместных исследованиях с Н.Х. Еналеевой (Ботанический сад, г. Саратов).
С другой стороны, гены, контролирующие формирование цветка и генеративных органов, могут быть представлены сложной сетью, затрагивающей разные районы генома. Таким образом, появление растений с мутантным фенотипом среди трансгенных растений табака отражает частоту интеграции Т-ДНК-инсерций в районы расположения этих генов. В пользу данного предположения свидетельствуют данные о постоянном появлении растений табака с измененным строением цветка среди исходных трансформантов.
Нет оснований отвергнуть предположение о том, что встраивание Т-ДНК-инсерций могло произойти в районы расположения генов, контролирующих деление меристематических клеток. Данное предположение основано на том, что рядом авторов показано, что встройки трансгенов происходят в функционально активные районы хроматина (Koncz et al, 1989). Так как процесс агробактериального переноса Т-ДНК-инсерций сопряжен с воздействием на клетки растений экзогенных гормонов для индукции клеточных делений, то можно гипотетически представить, что встройки экзогенной ДНК в ряде случаев могут попадать в районы расположения генов, активируемых экзогенными гормонами. Именно те клетки, в которых запускается цепь клеточных делений, контролируемая экзогенно, и приводят к формированию морфогенных структур с последующей регенерацией растений-трансформантов. Так как закладка и формирование генеративных органов у растений определяются ориентацией веретен деления, то индуцируемые инсерциями нарушения в дальнейшем могли найти отражение в формировании мутантного фенотипа у выделенных нами трансгенных растений табака.
При создании трансгенных растений могут быть индуцированы однотипные мутации у некоторого числа исходных трансформантов. Так, в экспериментах (Rerie et al., 1994) выделены несколько трансгенных A. thaliana с однотипными нарушениями в закладке трихом на стебле. Три однотипные мутации, индуцированные Т-ДНК-инсерциями у A. thaliana, выделены Фельдманом (Feldmann, 1991), а также Клучером и коллегами (Klucher et al., 1996). Мутантный фенотип у выделенных растений проявлялся в нарушении формирования женского гаметофита и изменении строения цветка. Как показано авторами, наблюдаемые изменения были связаны с нарушениями гена ANT, контролирующего формирование тканей зародышевого мешка, внедрением инсерций Т-ДНК в растительный геном.
Итак, причины, приводящие к изменению проявления отдельных признаков у трансгенных растений, могут быть разного характера. Это могут быть инсерций Т-ДНК в районы расположения генов, контролирующих проявление тех или иных признаков. Показано, что фрагменты векторной ДНК также могут быть причиной изменений в проявлении отдельных признаков у трансгенных растений. В связи с этим представляет интерес рассмотреть вопрос о том, как часто фрагменты векторной ДНК могут интегрироваться в геном растения при агробактериальной трансофрмации.
На рисунке 52 приведена типичная картина разделения амплификацион-ных продуктов, полученных в ПЦР реакции с 3 парами праймеров в 2,5 % ага-розном геле. Амплификационный продукт длиной 609 пар нуклеотидов соответствует геномной ДНК N. tabaciim; фрагмент длиной 487 пар нуклеотидов соответствует гену неомицинфосфотрансферазы II, фрагмент длиной 284 пары нуклеотидов соответствует векторным последовательностям, расположенным рядом с правым пограничным повтором. На рисунке 52 видно, что фрагменты, соответствующие вектору, найдены у обоих потомков растения Res66(l!) и у двух потомков растения Res79(Ii). На рисунке 53 приведена типичная картина разделения амплификационных продуктов ПЦР реакции в 2,5 % агарозном геле с 3 парами праймеров: праймерами на геномную ДНК N. tabacum (длина фрагмента 609 п.н.); праймерами на ген неомицинфосфотрансферазы II (длина фрагмента 487 п.н.); праймерами на векторные последовательности, расположенные рядом с левым пограничным повтором (длина фрагмента 331 п.н.). Такие векторные последовательности были найдены у потомка растения Res60(Ii) и у потомков растения Res66(Ib I2).
