Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Биологические особенности и генетическая изменчивость рода Helianthus L 9
1.2. ДНК-маркеры селекционно ценных признаков подсолнечника 16
1.3. Болезни и вредители подсолнечника 31
1.3.1. Ложная мучнистая роса {Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni) 33
1.3.2. Заразиха (Orobanche cumana Wallr.) 37
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1 Объекты исследования 44
2.2. Полевые испытания 46
2.3. Определение устойчивости подсолнечника к ложной мучнистой росе и заразихе в лабораторных условиях 48
2.4. Молекулярно-генетические исследования 56
2.4.1. Выделение ДНК из растительной ткани 56
2.4.2. Проведение ПЦР-анализа 59
2.4.3. Определение последовательности нуклеотидов ДНК 65
2.4.4. Статистическая обработка результатов 67
Глава 3. Результаты исследований 69
3.1. Полиморфизм ДНК культурного и дикорастущего подсолнечника (Helianthus L.) 69
3.1.1. RAPD- и SSR-анализ геномной ДНК однолетних видов подсолнечника рода Helianthus L 69
3.1.2. SSR-анализ геномной ДНК культурного подсолнечника Н. annuus 72
3.1.3. Анализ полиморфизма хлоропластной ДНК подсолнечника 83
3.2. Определение информативных ДНК маркеров гена Rfl -восстановителя фертильности пыльцы ЦМС РЕТ1 91
3.3. Скрининг селекционного материала подсолнечника на устойчивость к ложной мучнистой росе и заразихе 111
3.4. Генотипирование линий подсолнечника с различной устойчивостью к ложной мучнистой росе и заразихе 114
4. Заключение 119
5. Выводы 122
6. Список литературы 124
7. Приложение
- ДНК-маркеры селекционно ценных признаков подсолнечника
- Проведение ПЦР-анализа
- SSR-анализ геномной ДНК культурного подсолнечника Н. annuus
- Генотипирование линий подсолнечника с различной устойчивостью к ложной мучнистой росе и заразихе
Введение к работе
Актуальность исследования. Анализ организации и изменчивости генома высших растений - не только фундаментальная, но и прикладная проблема. Точная идентификация исходного материала, его конкретных признаков на всех этапах селекционного процесса актуальна в работе селекционеров.
Подсолнечник в Российской Федерации - наиболее рентабельная и возделываемая масличная культура. Согласно данным Минсельхоза РФ, в 2012 году масличные культуры были высеяны на площади 9,4 млн. га, из которых подсолнечник составил 6,2 млн. га (). Около 80 % валового сбора семян и до 90 % производимого растительного масла приходится на эту культуру (Келигов, 2009; Повстяной, 2009).
Одним из перспективных подходов в селекции растений является молекулярно-генетическое маркирование конкретных признаков в генофонде как культурных, так и дикорастущих форм растений, изучение генетического разнообразия, определение родства на внутривидовом и внутриродовом уровнях (Гостимский и др., 2005, Dong et al, 2007). К настоящему времени у подсолнечника обнаружен ряд ДНК-маркеров для выявления в генотипе селекционно ценных генов. Так, например, специфические ДНК-маркеры разработаны для идентификации генов Rfy родительских форм подсолнечника, контролирующих ЦМС и восстановление фертильности пыльцы (Gentzbittel et al., 1995; Horn et al., 2003; Feng, Jan, 2008; Schnabel et al, 2008; Анисимова и др., 2009; Yue et al., 2010). Большой интерес для селекции представляют также гены устойчивости к наиболее распространенным заболеваниям подсолнечника, таким как ложная мучнистая роса и заразиха. За последние годы было обнаружено несколько генов, контролирующих эти признаки (Fernandez-Martinez et al., 2009; Qi et al., 201 la, 20116;. Bachlava et al, 2011). Так, например, было показано, что устойчивость к ложной мучнистой росе связана с наличием доминантных Р/-генов (Mulpuri, 2009; Bachlava et al, 2011; Антонова и др., 2011; Liu et al., 2012), а иммунность подсолнечника к растению-паразиту заразихе определяется наличием генов Or (Солоденко и др., 2005, 2009). Поиск современных подходов для точного определения доноров устойчивости, каковым может стать ДНК-маркирование селекционно ценных признаков, актуален, в связи с постоянным возникновением новых, более вирулентных рас этих патогенов (Tang et al, 2003; Fernandez-Martinez et al, 2009, 2010; Антонова и др., 2010, 2011).
Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование и разработка маркеров ядерной и хлоропластной ДНК для изучения генетического разнообразия селекционных линий и образцов, внутри- и межвидового полиморфизма однолетних видов рода Helianthus L., а также селекционно ценных признаков подсолнечника.
Исходя из поставленной цели, были определены следующие задачи:
1. Исследовать полиморфизм по ДНК-маркерам геномной ДНК
селекционных линий ДОС ВНИИМК и коллекционных образцов ВИР
однолетних видов подсолнечника рода Helianthus.
2. Определить информативные SSR-маркеры внутри- и межвидового
полиморфизма подсолнечника.
-
Исследовать полиморфизм хлоропластного генома по ДНК-маркерам с целью генотипирования селекционных линий ДОС ВНИИМК и коллекционных образцов ВИР однолетних видов подсолнечника рода Helianthus.
-
Определить наиболее информативные ДНК-маркеры ядерного гена Rfl - восстановителя фертильности пыльцы ЦМС РЕТ1 подсолнечника и на их основе создать мультиплексную маркерную систему.
-
Провести скрининг селекционного материала подсолнечника на устойчивость к ложной мучнистой росе и заразихе.
-
Определить информативные ДНК-маркеры устойчивости отцовских (Rf-линий) и материнских (ЦМС-линий) подсолнечника к ложной мучнистой росе и заразихе, соответственно.
Научная новизна исследования. Впервые на селекционном материале подсолнечника ДОС ВНИИМК экспериментально определены ДНК-маркеры, позволяющие дифференцировать линейный материал. Выявлены полиморфные участки хлДНК у коллекционных образцов подсолнечника ВИР и проведено полногеномное секвенирование пластома инбредных линий культурной и дикорастущей форм Н. annum. Определены информативные ДНК-маркеры устойчивости к ложной мучнистой росе и заразихе.
Практическая значимость работы. С помощью RAPD- и SSR-анализов генотипированы линии подсолнечника селекции ДОС ВНИИМК и коллекционные образцы ВИР однолетних видов рода Helianthus L. Создана и запатентована мультиплексная маркерная система, позволяющая идентифицировать растения подсолнечника с цитоплазматической мужской стерильностью (РЕТ1) и носителей гена Rfl - восстановителя фертильности пыльцы. В полевых и лабораторных условиях выделены генотипы подсолнечника, устойчивые к ложной мучнистой росе и заразихе.
Результаты исследований включены в состав учебных материалов для занятий студентов факультета биологических наук Южного федерального университета по специальным курсам кафедры генетики.
Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия» (Пермь, 2009); III, IV и V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009, 2011, 2013); 14-й Пущинской Международной школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010); 8-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь XXI века - будущее российской науки» (Ростов-на-Дону, 2010); 49- 51-й Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»
(Новосибирск, 2011-2013); 6-й международной конференции молодых ученых и специалистов «Инновационные направления исследований в селекции и технологии возделывания масличных культур» (Краснодар, 2011); VII Съезде физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Н. Новгород, 2011); Международной летней школе молодых ученых при РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева «Биотехнологии в сельском хозяйстве (AgroBioTech) 2012» (Москва, 2012); VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012); Международной научной конференции X съезда Белорусского общества генетиков и селекционеров «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (Минск, Республика Беларусь, 2012); III Вавиловской международной конференции «Идеи Н.И. Вавилова в современном мире» (Санкт-Петербург, 2012); Научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии» (Ростов-на-Дону, 2013); 2nd International Scientific Conference «European Applied Sciences: modern approaches in scientific researches» (Stuttgart, Germany, 2013); Международной научно-практической конференции «Клеточная биология и биотехнология растений» (Минск, Республика Беларусь, 2013); Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013); International young scientists conference «Perspectives for development of molecular and cellular biology IV» (Yerevan, Armenia, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 научных работ, из них 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследований, заключения, выводов, списка литературы, приложения. Работа изложена на 148 страницах, содержит 13 таблиц и 44 рисунка. Список литературы включает 229 источников, из которых 71 на русском языке.
Исследование выполнено в рамках государственной темы Министерства образования и науки РФ (регистрационный № 4.5642.2011); при финансовой поддержке ФЦП Министерства образования и науки РФ (госконтракт № 16.740.11.0485); гранта «УМНИК» (проект № 14268).
Благодарности. Автор считает своим долгом выразить искреннюю благодарность и признательность с.н.с, зав. лабораторией молекулярной генетики НИИ биологии ЮФУ Н.В. Маркину, за помощь в проведении молекулярно-генетических исследований; директору ДОС ВНИИМК Ф.И. Горбаченко и зав. лабораторией селекции и иммунитета подсолнечника Т.В. Усатенко, за предоставленный материал для исследования, полевые данные и помощь в проведении полевых и лабораторных испытаний подсолнечника на устойчивость к ЛМР и заразихе; д.б.н., зав. отделом генетических ресурсов технических и прядильных культур ВИР В.А. Гавриловой за предоставленные коллекционные образцы подсолнечника; к.б.н., в.н.с. лаборатории
эволюционной геномики факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова М.Д. Логачевой и д.б.н., в.н.с. НИИ биологии ЮФУ И.В. Корниенко за помощь в проведении анализа нуклеотидных последовательностей ДНК.
ДНК-маркеры селекционно ценных признаков подсолнечника
Главные достижения в повышении урожайности подсолнечника связаны с созданием линий с повышенной комбинационной способностью для получения гибридов или достижениями селекции в области устойчивости к неблагоприятным факторам среды, например, получение более низких растений для регионов, где существует большой риск полегания (Schneiter, 1992), или с большим наклоном корзинки - для регионов с высокой температурой воздуха и интенсивной солнечной радиацией или с высоким риском повреждения посевов птицами (Hanzel, 1992). Во многих регионах, где производят подсолнечник, повышение урожайности было связано с увеличением устойчивости к болезням (Толмачев, 1991; Alonso et al., 1996; Sadras et al., 2000; Игнатова и др., 2006). В связи с этим, изучение генетического контроля устойчивости к патогенам подсолнечника является одним из основных направлений генетики и селекции подсолнечника (Sunflower technology and production, 1997; Jan, Gulya, 2006; Velasco et al., 2006; Radi, Gulya, 2007; Fernandez-Martinez et al., 2009; Qi et al., 201 la, 20116;. Bachlava et al., 2011 и др.).
Помимо повышения урожайности в настоящее время большое внимание уделяют селекции подсолнечника на изменение качественного состава масла семян, в частности повышение содержания олеиновой кислоты и природных антиоксидантов - токоферолов (альфа (витамин Е), бета, гамма и дельта) (Demurin et al., 1996; Hass et al., 2006; Fernandez-Martinez et al., 2007, 2009; Skoric et al., 2008 и др.).
Для характеристики растений широко используют морфологические, биохимические (белковые) и молекулярные (на уровне ДНК) маркеры. Однако морфологические признаки имеют определенные ограничения, связанные с субъективностью анализа, некоторые диагностические признаки проявляются только на конкретной стадии развития, они недостаточно полиморфны и в большинстве случаев не кодоминантны, а также зависят от воздействий окружающей среды (Чесноков, 2005; Картель и др., 2009). Основным ограничением для применения биохимических маркеров является малое число локусов в геноме, которое может быть ими маркировано или определено. Полиморфизм разного рода белков зависит от органа или тканей растений, "из которых их выделяли (Чесноков, 2005).
Методы, основанные на использовании ДНК-маркеров, имеют ряд преимуществ, к числу которых можно отнести высоко воспроизводимые результаты, их детекция не зависит от условий окружающей среды, стадии роста растения и типа изучаемой ткани, они распределены по всему геному и обладают высоким полиморфизмом. Количество ДНК маркеров очень велико - практически любой ген и даже его аллели могут быть маркированы. ДНК-маркеры не взаимодействуют с другими признаками, т.е. не проявляют свойств эпистаза, они обычно доминантны или кодоминантны (Картель и др., 2009).
Одну из научных и народно-хозяйственных областей, где молекулярные маркеры находят свое практическое применение, представляет селекция растений. Во-первых, маркеры могут дать новую расширенную и дополненную картину внутри- и межвидового генетического разнообразия. Во-вторых, маркеры дают возможность построения генетических карт, которые позволяют локализовать и идентифицировать локусы количественных и качественных признаков, и устанавливать их эффекты действия или взаимодействия. Данная информация может принести прямую пользу и практические выгоды для селекции, важнейшая из которых - использование маркеров генов для введения интересующих исследователя аллелей в реципиентные геномы (Чесноков, 2005).
Использование молекулярных маркеров открыло большие перспективы для детального картирования хромосом, идентификации генов, их клонирования, создания новых сортов и гибридов сельскохозяйственных растений, в том числе и подсолнечника (Гостимский и др., 2005).
В настоящее время маркирование сортов и гибридов подсолнечника с помощью ДНК- маркеров проводится в биотехнологических и селекционных центрах как у нас в стране, так и за рубежом. Эти центры выполняют определение ДНК-маркеров для идентификации и паспортизации сортов сельскохозяйственных культур, морфологических и селекционно ценных признаков растений, что обеспечит права селекционеров на научно-технические разработки (Солоденко, 2005).
Среди многочисленных систем маркеров, основанных на использовании ПЦР (полимеразной цепной реакции) наиболее эффективными и доступными считаются: RFLP-, AFLP-, RAPD-, SSR-, SCAR-, CAPS- и STS-маркеры. Их используют исходя из целей и задач исследований.
Метод RFLP основан на выделении геномной ДНК с последующим ее расщеплением на фрагменты с помощью специальных эндонуклеаз. Большинство RFLP-маркеров кодоминантно. Они могут быть использованы как исходные точки для клонирования генов методом «прогулки по хромосоме». Таким образом, потенциально любой ген может быть изолирован и клонирован. Еще одно достоинством RFLP-маркеров - их высокий консерватизм, он позволяет использовать их при сравнительном картировании родственных видов. Появление детальных генетических карт многих растений позволило сравнить между собой ряд геномов благодаря использованию общего набора RFLP-зондов (Малышев, Картель, 1997).
Первые данные по изучению полиморфизма фрагментов рестрикции ДНК у различных видов рода Helianthus получили У. Шуман и П. Хецман (Choumane, Heizmann, 1988). В дальнейшем детальный анализ молекулярной филогении этого рода на основе RFLP провели Л. Генцбиттел с соавторами (Gentzbittel et al., 1992). Ими показано, что филогения, построенная на основании результатов RFLP-анализа, соответствует общепринятой ботанической классификации, а полиморфизм геномов различных видов рода Helianthus L. обусловлен в основном нуклеотидными заменами, а не их инсерциями или делециями. Этот метод также оказался эффективным для идентификации инбредных линий подсолнечника с ЦМС и восстановителей фертильности пыльцы гибридов (Berry et al., 1994; Gentzbittel et al., 1994). Первая генетическая карта у подсолнечника построена также на основе этих маркеров (Berry et al., 1995; Gentzbittel et al., 1995). С ее помощью удалось выявить тесное сцепление с одним из RFLP локусов гена Rfl. Расстояние между ними составило всего 1 сМ (Gentzbittel et al., 1995).
Одним из важных аспектов практического применения метода RFLP является поиск молекулярных маркеров, сцепленных с QTL (quantitative trait loci -локусы количественных признаков). Такой подход особенно актуален, когда неизвестны число, локализация, действие и эффекты кодирующих генов. Е. Местрис с соавторами (Mestries et al., 1998) идентифицировали QTL устойчивости подсолнечника к белой гнили, используя RFLP в сочетании с изозимными маркерами. Исследования в этом направлении были продолжены уже с использованием TRAP-маркеров (TRAP - target region amplification polymorphism), разработанных на основе маркеров к экспрессирующимся последовательностям генома (EST - expressed sequence tag) (Yue et al., 2008). А. Леон с соавторами (Leon et al., 1995) идентифицировали RFLP-маркеры, сцепленные с локусами количественных признаков, которые контролируют содержание масла в семенах и ядре, соотношение ядра и лузги.
Тем не менее, RFLP-маркеры имеют ряд недостатков. Идентификация и картирование одного маркера представляют собой множество этапов, которые включают выращивание клонов, изоляцию, очистку и радиомечение фрагментов из клонотеки, проведение Саузерн-блотинга ДНК, расщепленной различными рестриктазами и т.д. Среди других недостатков RFLP - необходимость больших количеств ДНК и достаточно высокие требования к ее качеству (Малышев, Картель, 1997).
AFLP (amplified fragment length polymorphism) - мощные маркеры для геномного картирования и исследований генетической изменчивости. Они выявляют наличие участков расщепления в комбинации с полиморфизмом последовательности вблизи этих участков. Праймеры состоят из фиксированной части, содержащей последовательность, комплементарную адаптеру и сайту рестрикции использованной эндонуклеазы, и короткого фрагмента (на З -конце) с произвольной последовательностью нуклеотидов (2-4 нуклеотида) (Vos et al., 1995; Mueller, Wolfcnbarger, 1999). Фиксированная часть придает праймеру стабильность и, в результате, хорошую воспроизводимость метода, а короткая последовательность со случайным набором нуклеотидов позволяет определять и контролировать пропорцию лигированных фрагментов, которые могут быть амплифицированы. С каждой парой праймеров амплифицируется 75 - 100 , фрагментов (AFLP-финргерпринтинг), которые разделяют в агарозном или полиакриламидном геле. Поскольку каждый фрагмент представляет собой уникальный сайт, количество локусов, анализируемых одновременно с каждой комбинацией праймеров, гораздо больше, чем при любой другой технике анализа полиморфизма ДНК (Малышев, Картель, 1997; Сулимова, 2004). AFLP-маркеры часто наследуются как тесно сцепленные кластеры в районе центромеры или теломеры хромосом, но наблюдается и случайное распределение маркеров вне этих кластеров, что позволяет быстро генерировать сотни высоко воспроизводимых маркеров (Perry et al., 1998).
Проведение ПЦР-анализа
Для RAPD-анализа использовали 7 произвольных праймеров, отобранных из литературы (Сиволап и др., 1998, Попов и др., 2002), синтезированных ЗАО «Синтол» (г. Москва). Описание олигонуклеотидов приведено в таблице 5.
Полимеразную цепную реакцию проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 67 мМ трис-НС1рН 8.4, 16мМ (NH4)2S04, 2.5 мМ MgS04, 0.1 мМ меркаптоэтанола, 0.25 мМ каждого ДНТФ (ДАТФ, дЦТФ, дТТФ, ДГТФ), 15 пмоль праймера, 2.5 ед. Taq-полимеразы, 30 нг выделенной ДНК. Поверх реакционной смеси наслаивали 20 мкл минерального масла. ПЦР проводили в термоциклере PalmCycler Corbett Research (Австралия) по следующей программе: 1 цикл - 94 С 3 мин, 36 С 30 сек, 72 С 30 сек; 42 цикла - 94 С 18 сек, 36 С 30 сек, 72 С 30 сек; 1 цикл - 94 С 18 сек, 36 С 30 сек, 72 С 10 мин. Продукты реакции амплификации разделяли электрофоретически в 2 % агарозном геле с бромистым этидием (1 мкг/мл), используя трис-боратный буфер. После электрофореза гели переносили на трансиллюминатор и фотодокументировали с помощью видеосистемы GelDoc 2000 (BioRad, США). В качестве маркеров для определения размеров амплифицированных фрагментов использовали маркер массы GeneRuler 100 bp DNALadder (Fermentas, Европа) и pUCMix Marker, 8 (Fermentas).
Для SSR-анализа использовали одиннадцать пар праймеров, отобранных нами по данным литературы (Gedil et al., 2001; Paniego et al., 2002; Tang et al., 2002,) и в результате предварительных исследований (Приложение 6).
Полимеразную цепную реакцию с SSR-праймерами проводили в 25 мкл реакционной смеси состава, представленного выше, используя по 10 пМ каждого праймера. Амплификацию проводили в термоциклере PalmCycler (Corbett Research, Австралия).
Термальный режим реакций подбирали для каждой пары праймеров с учетом их нуклеотидного состава. Для большинства проведенных реакций оптимальным оказался терморежим с начальной денатурацией при 96 С в течение 2 мин., затем 30 циклов при соблюдении температурно-временного режима: отжиг при 55 - 60 С в течение 40 сек., элонгация - 1 мин. при 70 С, денатурация при 94 С - 30 сек., финальная элонгация - 2 мин.
Полимеразную цепную реакцию для SSR-анализа хлДНК дикорастущего и культурного подсолнечника проводили в реакционной смеси (см. смесь для RAPD-анализа) объемом 20 мкл, содержащей по 15 пмоль каждого праймера (Таблица 6).
ПЦР проводили в термоциклере PalmCycler (Corbett Research, Австралия) по следующей программе: первоначальная денатурация 3 мин при 95 С, после чего десять циклов: 30 сек при 94 С, 30 сек при 58 С (температура отжига была уменьшена на 1 С на каждый цикл), 45 сек при температуре 72 С, а затем до 30 циклов: 30 сек при 94 С, 30 сек при 48 С, 45 сек при температуре 72 С, а окончательная элонгация 20 мин при 72 С.
Амплификацию специфического участка ДНК, связанного с геном Rfl подсолнечника проводили, используя SSR-маркеры ORS 799, ORS 511, ORS 1030, ORS 224, ORS 317, ORS 630 (Tang et al., 2002), STS-маркер STS 115, AFLP-маркер E41M48_113, а также SCAR-маркеры OPK13 и OPY10 (Horn et al., 2003, Schnabel et al., 2008) (Таблица 7).
Для ПЦР-реакции использовали 25 мкл аналогичной реакционной смеси с концентрацией праймеров 10 пМ. При амплификации с последующим прямым секвенированием для ПЦРтреакции использовали 25 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл ДНК, 2,5 мкл 1,2 MMdNTP, 2,5 мкл 10х реакционного буфера Б (Silex, Москва), 2,5 мкл 2,5 мМ MgCb, по 0,5 мкл прямого и обратного праймера в концентрации 10 пМ, 0,2 мкл Taq полимеразы (Синтол, Москва) и 11,3 мкл ddH20. Реакцию амплификации проводили в термоциклере Palm Cycler (Corbett Research, Австралия) по четырем различным программам: 1) 10 мин. 94 С; 35 циклов: 45 сек. 94 С , 45 сек. 65 С, 1 мин. 72 С, один цикл: 6 мин. 72 С (для OPY10), 2) 5 мин. 95 С; 35 циклов: 15 сек. 95 С , 30 сек. 58 С, 25 сек. 72 С, один цикл: 1 мин. 72 С (для ОРК13), 3) 2 мин.96 С; 30 циклов: 30 сек. 94 С , 40 сек. 55 С, 1 мин. 72 С, один цикл: 2 мин. 72 С, 4) 2 мин. 96 С; 30 циклов: 30 сек. 94 С , 40 сек. 58 С, 1 мин. 72 С, один цикл: 2 мин. 72 С. Продукты реакции амплификации разделяли электрофоретически в 1,7 % агарозном геле с бромистым этидием (1мкг/мл) и визуализировали с помощью гельдокументирующей системы GelDoc 2000 (BioRad, USA).
Для мультиплексной ПЦР-реакции с синтезированными праймерами и при амплификации с последующим прямым секвенированием использовали аналогичную реакционную смесь, описанную выше. Реакцию амплификации проводили в термоциклере Palm Cycler (Corbett Research, Австралия) по программе для праймеров ОРК13. Продукты реакции амплификации разделяли электрофоретически в 2% агарозном или полиакриламидном геле с бромистым этидием (Імкг/мл) и визуализировали с помощью гельдокументирующей системы GelDoc 2000 (BioRad, USA).
По данным литературы (Bouzidi et al., 2002, Radwan et al., 2004) были синтезированы 9 пар STS-праймеров (Таблица 8).
Полимеразную цепную реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси с концентрацией праймеров по 20 пМ. Амплификацию проводили в термоциклере Palm Cycler(Corbett Research, Австралия). Термальный режим реакций подбирали для каждой пары праймеров с учетом их нуклеотидного состава. Для большинства проведенных реакций оптимальным оказался терморежим с начальной денатурацией при 95 С в течение 3 мин., затем 35 циклов при соблюдении температурно-временного режима: отжиг при 60 С в течение 30 сек., элонгация -2 мин. при 72 С, денатурация при 95 С - 30 сек., финальная элонгация - 1 мин. Для остальных режим амплификации был следующим: начальная денатурация 94 С - 3 мин., затем 33 цикла: 94 С - 10 сек., 60 С - 30 сек. и 72 С - 1 мин. 30 сек.; финальная элонгация - 5 минут при 72 С.
Праймеры для идентификации 9 SCAR-маркеров (Lu et al., 2000) Or-локуса — Ог5, ассоциированного с устойчивостью подсолнечника к заразихе, были отобраны по данным литературы (Таблица 9).
Полимеразную цепную реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси с концентрацией праймеров по 20 пМ. Амплификацию проводили в термоциклере Palm Cycler (Corbett Research, Австралия). Температурный режим реакций подбирали для каждой пары праймеров с учетом их нуклеотидного состава. Для большинства проведенных реакций оптимальным оказался терморежим с начальной денатурацией при 95 С в течение 5 мин., затем 40 циклов при соблюдении температурно-временного режима: отжиг при 58 С в течение 30 сек., элонгация — 20 сек. при 72 С, денатурация при 95 С — 20 сек., финальная элонгация — 10 мин. Продукты реакции амплификации разделяли электрофоретически в 2 и 1,2 % агарозном геле с бромистым этидием (1мкг/мл), соответственно для ЛМР и заразихи, используя трис-боратный буфер. После электрофореза гели переносили на трансиллюминатор и фотодокументировали с помощью видеосистемы GelDoc , 2000 (BioRad; США). В качестве маркеров для определения размеров » ,j" амплифицированных фрагментов использовали маркер массы GeneRuler 100 bp DNALadder (Fermentas, Европа) и pUCMix Marker, 8 (Fermentas). В качестве маркера массы для STS-праймеров использовали GeneRuler 1 Kb DNALadder, readyo-use (Fermentas).
SSR-анализ геномной ДНК культурного подсолнечника Н. annuus
Основная задача гетерозисной селекции - создание гибридов с высокой продуктивностью и комплексной устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам среды. Ее успех во многом зависит от того, насколько богат генетический потенциал родительских линий, используемых для получения гибридов. При создании самоопыленных линий подсолнечника первостепенное внимание уделяют отбору автофертильных форм, которые завязывают большое количество семян даже без дополнительного искусственного опыления. На ДОС ВНИИМК путем самоопыления и отбора были получены высокоурожайные линии, отличающиеся выравненностью по основным морфологическим признакам (Горбаченко, Горбаченко, 2005). Лучшие по комбинационной способности были переведены на стерильную основу Н. petiolaris, которая легко передает мужскую стерильность создаваемым аналогам и обеспечивает высокую завязываемость семян не только под изоляторами, но и при свободном цветении. В настоящее время на станции получены и включены в селекционную программу экспериментальных гибридов несколько десятков ЦМС-линий. Оценку ДНК-полиморфизма с помощью SSR-анализа проводили у селекционного материала ДОС ВНИИМК, представленного материнскими (ЦМС) и отцовскими (Rf) линиями подсолнечника. Предварительные полевые испытания показали, что данные линии являются выровненным и перспективным для создания высокопродуктивных и устойчивых гетерозисных гибридных комбинаций (Приложения 1, 3). Также для оценки уровня информативности данной системы маркеров был определен спектр изменчивости геномной ДНК трех сортов, районированных в Ростовской области (Приложение 2).
В результате SSR-анализа по 11 праймерам (Приложение 6) 16-ти ЦМС линий подсолнечника были получены специфические и хорошо воспроизводимые спектры фрагментов ДНК. Для каждой линии определены индивидуальные SSR-спектры, различающиеся числом ампликонов, их размерами и степенью выраженности на электрофореграммах. На рисунке 10 представлены результаты ПЦР анализа 16-ти материнских линий подсолнечника по микросателлитному локусу На 1442.
Характерной особенностью спектров амплификации ДНК сортов подсолнечника с праймерами На 1442 является отсутствие ампликона 240 п.н. у сорта Казачий (Рисунок 11) присутствующего в спектрах всех исследуемых ЦМС линий (Рисунок 10). Локус На 1442 является высоко полиморфным. Число детектируемых аллелей на данный локус имеет одно из наивысших значений среди рассмотренных SSR-маркеров. Из 5 аллелей локуса На1442, наиболее часто встречаются аллели 200 и 240 п.н.
На рисунке 12 приведены спектры материнских линий подсолнечника, полученные при разделении в геле продуктов амплификации с праймерами На 432. У семи линий локус На 432 обнаруживает аллельный вариант 190 п.н. Аллель 180 п.н. в спектрах амлификации данного праймера встречается у всех исследованных ЦМС-линий, а также у сорта Азовский. На электрофореграмах сортов Казачий и Донской 60 с праймером На 432 ампликон 180 п.н. отсутствует (Рисунок 14 в).
Из 4 аллелей локуса На 514 в спектрах амплификации геномной ДНК ЦМС линий подсолнечника, наиболее часто встречается аллель 180 п.н. Частота присутствия данного амликона составляет 43,7 %, в то время как ампликоны 190 п.н. и 200 п.н. показаны у 25 % исследуемых материнских линий (Рисунки 13 а и б). У исследованных сортов для локуса На 514 характерно наличие единственного ампликона 180 п.н. (Рисунок 14 г). Мономорфными в исследованных генотипах трех сортов оказались также праймеры ORS 509 (150 п.н.) и OSU 1 (200 п.н.). В отличие от ЦМС-линий, где число детектируемых аллелей для локуса OSU 1 составляет 3, а для ORS 509 - 4 (Рисунки 14 а и б). Всего в ходе анализа сортов по 11 микросателлитным локусам было выявлено 22 аллеля.
Узкая генетическая основа современных сортов подсолнечника требует привнесения новых аллелей. С целью создания сортов, адаптированных к условиям Ростовской области и не уступающих зарубежным аналогам, необходимо изучать генетическое разнообразие, как линий, так и сортов подсолнечника для выбора исходного селекционного материала.
В результате исследования ЦМС-линий было выявлено 35 аллелей. Их число на локус варьировало от 2 до 5, а размеры амплифицированных фрагментов находились в пределах от 130 до 690 п.н. В среднем наблюдалось по 3,2 аллеля на маркер. Количество фрагментов амплификации в спектрах линий варьировало в зависимости от праймера от 1 до 4. Аллельные различия наблюдались как по количеству амплифицированных фрагментов, так и по их подвижности. Хотя в ходе анализа уникальные полосы-ампликоны, характерные для отдельных генотипов не были обнаружены, выявленные паттерны позволяют идентифицировать существенные различия между анализируемыми линиями.
Основным показателем информативности микросателлитных локусов является индекс полиморфного информационного содержания (РІС). Этот показатель характеризует дискриминационную силу локуса не только по количеству выявленных аллелей, но и по относительным частотам их встречаемости. Значение РІС приближается к единице, если локус имеет множество аллелей с приблизительно равной частотой встречаемости, и равен 0, если локус мономорфный.
При оценке ДНК-полиморфизма ЦМС-линий значения РІС для отобранных локусов варьировали от 0,21 для праймеров ORS 6 до 0,73 для На 432 (Таблица 11). Праймеры HNCA 1 по результатам предварительных исследований оказались мономорфны (РІС равен 0) и были исключены из данной маркерной системы. Значения РІС для локусов ORS 6, ORS 509, IUB 6 и HNCA 2 находятся в пределах 0,21 - 0,43, что достаточно для идентификации и паспортизации изучаемых форм. Остальные 7 локусов с показателями РІС более 0,5 наиболее эффективны для дифференциации изученной группы генотипов. На основании полученных данных была построена UPGMA-дендрограмма, отражающая генетическое сходство между изученными генотипами подсолнечника (Рисунок 15). Расположение кластеров и масштаб «генетической близости - генетической отдаленности» (0,4) указывает на значительное генетическое разнообразие между исследованными генотипами ЦМС-линий подсолнечника.
Генотипирование линий подсолнечника с различной устойчивостью к ложной мучнистой росе и заразихе
Методом STS-анализа исследованы 25 Rf-линий подсолнечника селекции ДОС ВНИИМК, продемонстрировавшие в лабораторных испытаниях различную степень устойчивости к наиболее распространенным на Юге РФ расам ложной мучнистой росы - 330, 710 и 730 (Таблица 13), а также некоторые линии-дифференциаторы, проявляющие сходную устойчивость, в качестве контроля (Таблица 3).
Из данных литературы были отобраны девять пар праймеров к трем Р1-локусам - Р/5, Р16 и РІ8 (Таблица 8) ассоциированных с устойчивостью подсолнечника к ложной мучнистой росе.
В результате только два праймера - НаР2 и НаРЗ проявили наличие фрагментов, отличающих чувствительные линии от устойчивых (Рисунки 40, 42). Но даже в этом случае у 11 пробы не наблюдалось соответствующего ампликона, хотя данная линия была определена как устойчивая. Возможно, это результат скрытого течения болезни, которое не проявилось даже в специально созданных лабораторных условиях, а так как растения не достигают возраста цветения, то и установить это наверняка не возможно. Скрытое течение болезни наблюдается в случае, если семена растений подсолнечника являются распространителями болезни и источником инфекции для всходов, впервые это было доказано Н.С. Новотельновой (1966). Таким образом, здоровые по внешним признакам растения подсолнечника, выросшие в окружении больных, могут давать семена, которые могут быть носителями инфекционного начала возбудителя ЛМР. В испытаниях семян, полученных с ранее испытанной линии 11, наблюдалось слабое поражение ложной мучнистой росой.
На рисунке 40 видно, что все устойчивые к трем расам ЛМР линии имеют один и тот же фрагмент длиной примерно 1200 п.н. Он соответствует размеру фрагмента, описанному в статье Боузиди с соавторами (Bouzidi et al., 2002), характерному для резистентной линии и равному 1260 п.н.
У линий-дифференциаторов, обладающих устойчивостью по трем изученным расам ЛМР (Таблица 3), присутствует аналогичный фрагмент (Рисунок 41).
Аналогично НаР2, НаРЗ инициировал синтез фрагмента размером около 1800 п.н., представленный только у устойчивых линий (Рисунок 42), что также согласуется с данными литературы (Bouzidi et al., 2002) - фрагмент размером 1811 п.н. характерен для резистентных линий. Устойчивые линии-дифференциаторы несут тот же фрагмент (Рисунок 43).
В результате было показано, что только два STS-маркера - НаР2 и НаРЗ являются высокоинформативными для скрининга и идентификации растений, устойчивых к ЛМР и могут представлять особый интерес в маркер-вспомогательной селекции подсолнечника. Остальные испытанные праймеры инициировали неспецифическую амплификацию и не позволили идентифицировать устойчивые к ЛМР генотипы подсолнечника.
Для анализа отобранных устойчивых/чуствительных образцов заразихи использовали 9 пар SCAR-праймеров, отобранных из литературы (Таблица 15) (Lu et al., 2000). Данные праймеры позволяют маркировать локус Ог5, связанный с устойчивостью подсолнечника к заразихе до расы Е.
По результатам проведенных ранее лабораторных испытаний для исследования были отбраны образцы подсолнечника с контрастными признаками устойчивости. Пять образцов чуствительных (№ 1-5), и 5 устойчивых (№6-10).
После амплификации было выявлено два информативных маркера, позволяющих отличить устойчивые растения от чуствительных. Ими оказались праймеры RTS 40 и RTS 40_1.
На рисунке 44 представлены результаты двух независимых ПЦР реакций исследуемых образцов подсолнечника с праймерами RTS 40 и RTS 40_1. При этом в генотипе устойчивых образцов (№ 6 — № 10) не выявлено специфических ПЦР-фрагментов размером около 360 п. н. (RTS 40) и 300 п. н. (RTS 40_1), наличие которых характерно в генотипах чувствительных образцов (№ 1 — № 5), что согласуется с данными, полученными И. X. Лу с соавторами (Lu et al., 2000). На электрофореграммах (Рисунок 44) стрелкой показаны уникальные ПЦР-фрагменты размером около 360 п. н. и 300 п. н.
Остальные праймеры показали неспецифичную амплификацию и не выявили фрагментов, характерных для устойчивых, либо для восприимчивых к заразихе образцов подсолнечника.
Таким образом, праймеры — НаР2, НаРЗ и RTS 40, RTS 40_1 могут быть использованы в маркер вспомогательной селекции подсолнечника на устойчивость к ЛМР и заразихе, соответственно.
