Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Использование генетических маркеров для изучения генетического разнообразия пород лошадей 9
1.1.1. Биохимические маркеры 9
1.1.2. Метод амплификации ДНК при помощи полимеразной цепной реакции 11
1.1.3. Микросателлиты 12
1.1.4. Полиморфные маркеры, основанные на тестировании однонуклеотидных замен (SNPs) 14
1.1.5. Мул ьтил окусные ДНК-маркеры 17
1.1.5.1. RAPD маркеры 17
1.1.5.2. Полиморфизм длин продуктов амплификации (AFLP-маркеры) 19
1.1.5.3. ISSR-фингерпринтинг 20
1.1.6. Анализ нуклеотидных последовательностей мтДНК 22
1.2. Лошади и их генетическое разнообразие 25
1.2.1. Происхождение и одомашнивание лошади 25
1.2.3. Современное коневодство Российской Федерации 41
1.2.4. Генетическое разнообразие лошадей 43
1.2.5. Аборигенные породы лошадей Саяно-Алтайского региона 51
1.2.5.1. Монгольские лошади 52
1.2.5.2. Бурятские лошади 55
1.2.5.3. Тувинские лошади 56
1.2.5.4. Забайкальские лошади 57
1.2.5.5. Алтайские лошади 58
2. Материалы и методы 60
2.1. Объекты исследования 60
2.2. Реагенты 61
2.3. Оборудование 62
2.4. Выделение ДНК 62
2.5. Определение концентрации выделенной ДНК 64
2.6. Проведение ПЦР 64
2.7. Приготовление 2%-ного агарозного геля 65
2.8. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР 65
2.9. Определение размера и количества фрагментов в ISSR-ампликонах 66
2.10. Секвенирование гипервариабельного района мтДНК 67
2.11. Определение нуклеотидной замены (g.66493737C T) в гене миостатина 68 методом TaqMan Realime PCR
2.12. Статистическая обработка 70
3. Результаты исследования и их обсуждение 72
3.1. Сравнение информативности различных ISSR маркеров 72
для оценки генетического разнообразия лошадей 3.1.1. Характеристика спектров ISSR фрагментов, полученных с праймерами к динуклеотидным повторам 72
3.1.2. Характеристика спектров IS SR фрагментов, полученных с праймерами к тринуклеотидным повторам 79
3.2. Оценка генетического разнообразия лошадей с использованием ISSR-маркеров 83
3.3. Анализ нуклеотидных последовательностей D-петли мтДНК лошадей 105
3.4. Изучение частоты встречаемости однонуклеотидной замены (g.66493737C T) в первом интроне гена миостатина (MSTN) 113 Заключение 118
4. Выводы 121
Список использованной литературы 123
- Метод амплификации ДНК при помощи полимеразной цепной реакции
- Современное коневодство Российской Федерации
- Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР
- Оценка генетического разнообразия лошадей с использованием ISSR-маркеров
Введение к работе
Актуальность исследования
Изучение генетического полиморфизма пород лошадей имеет большое значение для поддержания разнообразия в популяциях, улучшения селекционной работы и определения их происхождения. Особенно важным является исследование аборигенных пород лошадей, имеющих в своем геноме редкие аллели и являющихся выносливыми и хорошо приспособленными к условиям среды обитания. Монгольская лошадь была приручена около 6000 лет назад и благодаря походам Чингиз-хана и его потомков приняла участие в формировании многих пород на территории Европы и Азии. Она является аборигенной породой и разводится только в монгольских степях, в связи с чем, плохо изучена. Бурятская, алтайская, забайкальская и тувинская породы лошадей также являются аборигенными и даже в наши дни они остаются незаменимыми благодаря приспособленности к суровым условиям обитания. Недостаточная изученность лошадей Центральной и Восточной Азии не позволяет точно локализовать основные области, где начался процесс доместикации (Warmuth et al, 2011).
В начале XX века в России насчитывалось более 20 млн. голов лошадей, к настоящему времени численность конного поголовья сократилась до 1,3 млн. (Федеральная служба государственной статистики, 2008). Резкое снижение численности поголовья лошадей в XX веке не могло не отразиться на уровне генетического разнообразия, в связи с чем, необходимо использовать современные подходы для оценки и поддержания высокого уровня генетического разнообразия для сохранения пород во избежание неблагоприятных последствий инбридинга и эффекта «бутылочного горлышка».
Одним из наиболее эффективных подходов оценки генетического разнообразия популяций является использование молекулярных маркеров ДНК. Наиболее информативными для популяционно-генетических исследований являются мультилокусные ДНК маркеры, позволяющие одновременно изучать большое число локусов. Анализ последовательностей мтДНК позволяет определять происхождение и генетическое сходство пород по материнской линии. Различные варианты аллелей гена миостатина (MSTN) определяют скоростные качества и выносливость лошадей. Представляет интерес выяснить, какие аллели и генотипы преобладают у аборигенных пород лошадей.
При сохранении пород in situ основная задача состоит в том, чтобы сохранить специфические генные комплексы и сбалансированную систему генов и аллелей, которые обуславливают фенотипические породные
характеристики, связанные с экстерьерными особенностями, продуктивностью, жизнеспособностью, резистентностью животных. Именно вышеперечисленные особенности, отличающие местные породы от широко распространенных импортных пород, необходимо сохранять в генофондных хозяйствах (Столповский, 2010).
Цель исследования
Цель данной работы состояла в изучении генетического разнообразия лошадей (Equus caballus) монгольской, алтайской, забайкальской, астраханской, бурятской и тувинской пород на основе мультилокусного межмикросателлитного анализа ДНК и анализа нуклеотидной последовательности мтДНК, а также типировании исследуемых образцов по однонуклеотидной замене (SNP: g.66493737C/T) в первом интроне гена миостатина.
Задачи исследвания:
Сравнить информативность ISSR-маркеров, полученных с использованием различных праймеров, для изучения полиморфизма лошадей.
Оценить генетическое разнообразие монгольской, алтайской, забайкальской, астраханской, бурятской и тувинской пород лошадей на основании результатов ISSR-анализа.
Определить нуклеотидную последовательность фрагментов гипервариабельного района мтДНК монгольской, алтайской, забайкальской, бурятской и тувинской пород лошадей.
Оценить генетическое разнообразие и филогенетическое сходство исследуемых пород лошадей.
Провести типирование изучаемых образцов по гену миостатина (MSTN), оценить частоты нуклеотидных замен и генотипов и сравнить их с частотами у других изученных пород.
Научная новизна
Впервые проведена оценка информативности ISSR-маркеров, разработанных с использованием праймеров к динуклеотидным и тринуклеотидным повторам, для изучения генетического разнообразия пород лошадей. Показано, что для исследования генофондов лошадей наиболее информативны ISSR-маркеры, полученные на основе тринуклеотидных, а не динуклеотидных микросателлитных повторов, которые более информативны для всех других домашних копытных.
Впервые проведена оценка генетического разнообразия аборигенных пород лошадей Саяно-Алтайского региона (монгольской, алтайской,
забайкальской, астраханской, бурятской и тувинской пород) с использованием ISSR-анализа. Показан высокий уровень генетического разнообразия (по Нею) алтайской популяции «Амальдива» и тувинских лошадей из хозяйств «Ямаалыг» и «Кошкорлыг».
Впервые определены нуклеотидные последовательности D-петли мтДНК местных пород лошадей РФ и были выявлены гаплотипы, идентичные древним гаплотипам лошадей Китая и Монголии, среди монгольской, забайкальской и тувинской пород лошадей. В целом показан высокий уровень полиморфизма мтДНК в изученных выборках при сравнению с ранее исследованными популяциями.
Впервые у аборигенных пород лошадей продемонстрировано наличие С-варианта однонуклеотидной замены (SNP: g.66493737C/T) в первом интроне гена миостатина, ассоциированного с высокими скоростными качествами лошадей, с частотами от 0,03 до 0,26 (средняя частота 0,11).
Практическая значимость
Предложенный в данной работе подход для оценки консолидированности популяций (табунов) и чистопородности племенных животных с использованием разработанных ISSR-маркеров является высокоэффективным инструментом в селекции сельскохозяйственных животных и может быть использован для паспортизации пород и популяций (табунов), сертификации генофондных и племенных хозяйств, при восстановлении редких и исчезающих пород. Уже в настоящее время данный подход нашел свое применение в коневодстве и был использован при проведении молекулярно-генетической экспертизы табунов лошадей из 18 хозяйств, претендующих на получение статуса генофондного хозяйства (Результаты молекулярно-генетической экспертизы переданы в Минсельхоз РФ).
Типирование однонуклеотидной замены (SNP: g.66493737C/T) в первом интроне гена миостатина позволяет оценивать скоростные качества лошадей, что может быть использовано для выведения лошадей с высокими скоростными характеристиками или для оценки потенциала скаковых лошадей. На основе данной нуклеотидной замены разработана и запатентована тест-система (Equinome Ltd, Ireland, ).
Апробация результатов
Основные результаты работы были представлены на 7-ой международной научной конференции-школе «БиоТехЖ-2008» (Дубровицы, 2008), на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (Москва, 2009), на международной
молодежной конференции «Популяционная генетика: современное состояние и перспективы», посвященной памятной дате - 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова (Москва, 2011), на 62nd Annual Meeting of the European Federation of Animal Science (Ставангер, Норвегия, 2011).
Декларация личного участия автора
Автор участвовала в экспедиции по сбору образцов на Горном Алтае, самостоятельно получила ДНК исследуемых пород лошадей, провела ISSR анализ исследуемых образцов, получила нуклеотидные последовательности D-петли мтДНК, провела типирование однонуклеотидной замены (SNP: g.66493737C/T) в первом интроне гена миостатина для исследуемых популяций лошадей. Автор лично проводила статистическую обработку полученных результатов и оформляла результаты в виде статей. Построение сетей NeighborNet проведено совместно с к.б.н. Коноваловым Ф.А., ISSR анализ в программе STRUCTURE совместно со Столповским К.Ю.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 137 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования и их обсуждение, выводы, список использованной литературы, включающий 162 источника, и приложения. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 14 таблицами.
Метод амплификации ДНК при помощи полимеразной цепной реакции
С 1969 г. в ВНИИ Коневодства проводились работы по определению полиморфизма белков и иммуногенетических маркеров для контроля достоверности происхождения лошадей. В 1974 г. Дубровской P.M. разработан метод иммуногенетического контроля достоверности происхождения лошадей, одобренный НТС МСХ СССР 29.03.74 г. и утвержденный МСХ СССР. По этому вопросу издано "Временное положение по контролю происхождения лошадей по полиморфизму белков крови". Этой же группой ученых было проведено исследование генетической дифференциации пород лошадей по полиморфным локусам белков крови (Дубровская и др., 1992).
Однако анализ белков позволяет исследовать полиморфизм только белок-кодирующих последовательностей и только у экспрессирующихся генов. Учитывая, что у высших эукариот только 1% генома составляют кодирующие белок последовательности, очевидно, что большая часть генома ускользает от внимания исследователя. При этом не рассматриваются такие функционально значимые участки, как промоторные области, энхансеры, различные сайты регуляции, расположенные в интронах, нетранслируемых областях генов, а также вне генов. Возможности метода лимитируются также низким уровнем белкового полиморфизма в популяциях домашних животных и культурных растений, ограничениями в выборе биологического материала (Сулимова, 1993, 2004). Низкий уровень белкового полиморфизма обусловлен также консервативностью последовательностей, кодирующих ферменты, т.к. мутации могут привести к неправильной работе или даже потере функции необходимых ферментов. Возникновение в популяции адаптивной формы фермента может привести к полному замещению других аллелей и, следовательно, уменьшению уровня полиморфизма (см. обзоры Сулимова, 2004,2006). Более перспективным представляется использование в качестве маркерных систем полиморфизма нуклеотидных последовательностей ДНК, позволяющих тестировать генетический полиморфизм непосредственно на уровне генов, а не на уровне продуктов генов, как в случае использования метода белкового полиморфизма. ДНК-маркеры позволяют решить проблему насыщения генома маркерами и маркировать практически любые участки ДНК, в том числе некодирующие. Помимо этого данная маркерная система дает возможность использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма. Остановимся на описании ДНК маркеров наиболее часто используемых в наше время для анализа полиморфизма.
Мощным импульсом для создания новых типов ДНК-маркеров стало изобретение Кэри Мюллисом в 1983 г. метода амплификации in vitro определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов полимеразной реакции (ПНР - полимеразная цепная реакция, англ. PCR - Polymerase Chain Reaction). В 1985 г. этот метод был впервые применен на практике для амплификации участка гена бета-глобина с помощью Большого фрагмента ДНК-полимеразы (фрагмента Кленова) (Saiki et al., 1985). Широкое распространение ПНР началось с момента публикации в 1988 г. основополагающей работы (Saiki et al., 1988), в которой авторы использовали термофильные ДНК-полимеразы и рассмотрели теоретические основы метода. Эта статья в 1988-89 гг. стала наиболее цитируемой, а в 1993 году Кэри Мюллису была присвоена Нобелевская премия за изобретение метода ПНР.
Метод ПНР позволяет быстро и с небольшими затратами материальных ресурсов и времени получить более 10 миллионов копий определенной последовательности ДНК, первоначально представленной одной или несколькими молекулами. Различные модификации метода ПЦР легли в основу создания разнообразных типов ДНК-маркеров, широко используемых в настоящее время в различных областях биологии и медицины.
Микросателлиты - первые, полученные с использованием ПНР, высокополиморфные маркеры для индивидуальных локусов. Подобно минисателлитам, микросателлиты относятся к диспергированным тандемно повторяющимся последовательностям, но единицы повторов (ди-, три- и тетра-нуклеотиды) и общий размер повторяющейся области существенно короче (как правило, не более 100 п.н.) (Litt, Luty, 1989; Tautz, 1989; Weber, May, 1989). Эти маркеры известны под несколькими названиями: микросателлиты, STMS (Sequence Tagged Microsattelite Site), STR (short tandem repeat), SSR (simple sequence repeat). Для создания маркеров на основе STR подбираются праймеры к уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим микросателлитный повтор, что требует предварительного знания их нуклеотидной последовательности. Полиморфизм STR определяется различной копийностью мономерных единиц в кластере, что приводит к существованию множественных аллельных вариантов. Гетерозиготность их очень высока (часто более 75%). При создании новых полиморфных маркеров, кроме динуклеотидов, используются микросателлиты три- и тетрамерных мотивов, значительная часть которых также высоко гетерозиготна. Вследствие большей длины звена, применение три- и тетрамеров позволяет упростить методику анализа аллельного полиморфизма.
Микросателлиты широко распространены в эукариотических геномах (как растительных, так и животных). Например, в геноме человека динуклеотидные повторы встречаются в среднем каждые 2 т.п.н.
Согласно общепринятой точке зрения, возникновение аллелей микросателлитов обусловлено рекомбинацией и ошибками (эффект "проскальзывания") в процессе репликации или репарации ДНК (Jin et al., 1996).
Современное коневодство Российской Федерации
Высокий уровень гетерозиготности при исследовании 12 микросателлитных маркеров был обнаружен у польских лошадей (земаитукайский тяжеловоз (0,758), польский тяжеловоз (0,691)), сравнимый с таковым у широко распространенных по всему миру пород: голштинской (0,769) и ганноверской (0,700). Породы лошадей, селекция которых проводилась строго внутри породы без смешения с другими, отличаются меньшим уровнем гетерозиготности: ахалтекинская (0,674), арабская (0,645), фризская (0,452), тенессийская прогулочная лошадь (0,660), чистокровная верховая (0,673), эксмурский пони (0,601) (Iwanczyk et al., 2006).
Канадские ученые изучили аборигенную популяцию лошадей, изолированную на протяжении 11-12 поколений, с острова Сэйбл. Они обнаружили 145 аллелей с использованием 12 микросателлитных маркеров для более чем тысячи образцов разных пород лошадей, включая аборигенную популяцию, 15 канадских пород и 5 испанских. Число аллелей на локус варьировало от 4,67 у лошадей с острова Сэйбл до 8,25 у аппалузской породы. Значения наблюдаемой гетерозиготности колебались от 0,626 у аборигенной лошади с острова Сэйбл до 0,780 у першерона и 0,787 у астуркона. Аборигенная лошадь находится под охраной с 1960-го года и за время изоляции сильно отдалилась от других близких пород. Природные наблюдения за физическим состоянием и размножением животных показали, что аборигенная порода острова Сэйбл отлично приспособлена к скудным условиям среды и сезонным климатическим изменениям (Plante et al., 2007).
Самый высокий уровень наблюдаемой гетерозиготности при изучении 20 микросателлитных локусов азиатских пород был получен в популяциях монгольских лошадей (от 0,750 до 0,770), что говорит о большом генетическом разнообразии этой породы. Японские аборигенные породы отличались низким уровнем генетического разнообразия, по-видимому, связанным с малым числом особей в популяциях. Все аллели, обнаруженные у японских пород, встречаются у монгольской лошади. Это позволило авторам выдвинуть гипотезу о происхождении японских пород от монгольской лошади (Tozaki et al., 2003).
Исследование японской аборигенной породы другой группой ученых также показало низкий уровень ее полиморфизма по сравнению с другими породами. Были изучены 318 местных и иностранных пород с использованием микросателлитных маркеров и анализа мтДНК. Среди аборигенных пород уровень наблюдаемой гетерозиготности колеблется от 0,437 до 0,682. Это значительно ниже значений, полученных для монгольской (0,794), чистокровной верховой (0,711), бретонской (0,735) и першерона (0,688). Низкий уровень разнообразия аборигенных японских пород ученые связывают с сильным уменьшением численности популяции, произошедшем в XIX веке (Kakoi et al., 2007).
В работе по изучению генетического разнообразия и определению «отцовских» и «материнских» линий, внесших основной вклад в селекцию чистокровной верховой породы были исследованы 13 микросателлитных локусов. Уровень наблюдаемой гетерозиготности этой породы достаточно низкий (0,628) по сравнению с другими исследованными породами: шотландская (0,642), египетская (0,654) и турецкая (0,671). Вероятно, такой низкий уровень генетического разнообразия обусловлен тем, что вклад в генофонд породы 10 кобыл-основательниц составляет 72%, а одного жеребца-основателя - 95%. Также отмечен высокий уровень инбридинга, связанный со строгой селекцией внутри породы (Cunningham et al., 2001).
Исследование полиморфизма последовательностей мтДНК позволило определить неслучайное распределение разных митотипов среди популяций лошадей на территории Евразии. Участок контрольного региона мтДНК размером 247 п.н. между позициями 15494-15740 был изучен у 962 лошадей. Гаплотипы мтДНК группировались в 7 основных гаплогрупп. Частоты встречаемости гаплотипов и представленность гаплогрупп отличались в зависимости от географического расположения популяций. Изучение филогеографического разнообразия мтДНК показало значимую степень изоляции и дифференциации восточных популяций от европейских (McGahern et al., 2006).
Исследователи ожидали обнаружить высокий уровень генетического разнообразия у липиццианской породы лошадей, т.к. при создании породы в разведении участвовало большое количество кобыл разных пород, и параллельно были созданы разные линии. Изучение контрольного региона мтДНК (в позиции 15450-15834) позволило выявить 37 гаплотипов у 56 «материнских линий» липиццианской породы. Число гаплотипов превысило таковое даже у арабских лошадей (29), что подтвердило предположение ученых о высоком уровне генетического разнообразия липиццианской лошади. (Kavar et al., 2002).
Сравнение последовательностей D-петли мтДНК широко используется для эволюционных и филогенетических исследований в связи с высокой скоростью мутирования этого участка по сравнению с другими района мтДНК и ядерной ДНК, наследованием по материнской линии и отсутствием рекомбинации. Таким методом было показано, что лошади корейского полуострова Чейю произошли от монгольской породы лошадей. Было выявлено 17 гаплотипов у аборигенных лошадей Чейю. Высокий уровень полиморфизма связан с постоянными миграциями на полуостров других популяций лошадей, в том числе монгольской породы (Yang et al., 2001).
Исследование последовательности D-петли мтДНК позволило выявить 22 гаплотипа у итальянских пород лошадей. Наибольшее генетическое разнообразие наблюдалось у пород хафлингер, липиццианская, мареммано и чистокровной верховой, наименьшее - у породы гиара, что возможно связано с малым числом особей этой породы (Cozzi et al., 2004).
Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР
Наименьшее среднее число фрагментов на образец (5,88), из которых полиморфными оказались 33%, было получено с использованием праймера (AG)9C В спектрах CA-ISSR-маркера среднее число фрагментов достигает 10,73, однако для данного маркера показан минимальный процент полиморфных локусов (6,25). GA-ISSR-маркер отличается наибольшим процентом полиморфных локусов среди ISSR-маркеров на основе дикуклеотидных повторов.
Среди ISSR-маркеров на основе тринуклеотидных повторов наименее информативным оказался CAC-ISSR-маркер по причине низкого процента полиморфных локусов (табл. 6). Для GAG—ISSR-маркера и ACC-ISSR-маркера были получены высокие значения среднего числа фрагментов на образец и процента полиморфных локусов, что делает их наиболее перспективными ISSR-маркерами для изучения популяций лошадей.
Низкое среднее число фрагментов на образец и небольшое количество полиморфных локусов маркеров, полученных с использованием праймеров к динуклеотидным повторам, отражается в низких значениях полиморфного информационного содержания (табл. 6) и делает данный тип ISSR-маркеров малопригодным для анализа генетического разнообразия лошадей. Низкие значения полиморфного информационного содержания CAC-ISSR-маркера также свидетельствуют о его малой пригодности для популяционных исследований. GAG-ISSR-маркер и ACC-ISSR-маркер отличаются самыми высокими значениями полиморфного информационного содержания, что делает их оптимальными маркерами, среди исследованных нами, для изучения генетического разнообразия лошадей. В дальнейшем в нашей работе были использованы именно эти два ISSR маркера.
Оценка генетического разнообразия лошадей с использованием ISSR-маркеров В нашей работе впервые с помощью межмикросателлитного анализа (ISSR-фингерпринтинга) с использованием двух праймеров (ACC G и (GAG)6C к микросателлитный локусам (TGG)n и (СТС)п была исследована генетическая изменчивость 641 лошади из 15 выборок шести пород (четырех из Монголии, четырех из Алтая, четырех из Тывы, одной из Бурятии, одной из Забайкалья и одной из Астрахани). Как подробно изложено в разделе 3.1, нами была показана низкая информативность праймеров (AG)9C и (GA C (Воронкова и др., 2011), поэтому именно АСС- и GAG-ISSR маркеры были использованы в основной части работы.
В лаборатории сравнительной генетики животных метод ISSR фингерпринтинга широко используется для анализа генофондов сельскохозяйственных животных (Ахани-Азари и др., 2006; Кол и др., 2006; Столповский и др., 2009; Столповский и др., 2010-а; Столповский и др., 2010-б; Столповский и др., 2011). Для более точной оценки длин выявленных ISSR-фрагментов на основании сравнительного анализа спектров продуктов амплификации ДНК у различных видов сельскохозяйственных животных (в том числе были привлечены и данные ISSR-анализа, полученные в данной работе) была разработана универсальная шкала, где применена градация фрагментов ДНК по молекулярным массам (Столповский и др., 2010-а; Столповский и др., 2010-6; Столповский и др., 2011). В зависимости от зоны («тяжелые», «средние» и «легкие» фрагменты) использовался определенный шаг от 10 до 200 п.н. В результате было выделено 38 зон с фиксированным интервалом, которые позволяют достаточно точно определять молекулярную массу для 38 ПЦР-продуктов разной длины и стандартизировать результаты анализа. Размеры и обозначения ПЦР-продуктов приведены в таблицах 7 и 8. Поскольку данная шкала разрабатывалась как универсальная шкала для мониторинга генофондов различных видов сельскохозяйственных животных с использованием ISSR-PCR маркеров, то у конкретных видов могут быть представлены не все ISSR фрагменты. Так у изученных пород лошадей при использовании ACC-ISSR праймера было выявлено 24 фрагмента (табл. 7), а при использовании GAG-ISSR праймера был выявлен 21 фрагмент (табл. 8).
Частоты встречаемости ISSR фрагментов сильно варьируют у различных популяций лошадей (табл. 7 и 8). Многие фрагменты с достаточно высокой частотой обнаруживаются у всех исследованных популяций, некоторые встречаются у одной или нескольких выборок.
ISSR-анализ использовался с целью оценки генетического разнообразия и степени родства исследуемых популяций лошадей. Были обнаружены различия по наличию/отсутствию отдельных фрагментов между популяциями, а также по частоте их встречаемости. С использованием праймера (ACC)eG было получено 24 амплифицируемых фрагмента (23 из которых оказались полиморфными), праймер (GAG C позволил получить 21 фрагмент (19 из них полиморфные). Для анализа был взят диапазон длин фрагментов от 200 п.н. до 1800 п.н., все фрагменты внутри которого стабильно амлифицировались в нескольких повторностях (табл. 7 и 8).
С использованием ACC-ISSR маркера был получен один фрагмент (А27 = 430-4Юп.н.), встречающийся у всех особей среди изученных популяций, а также четыре фрагмента (А16=870-820, А18=750-720, А23=550-530, A3 6=23 0-220), встречающиеся во всех изученных популяциях у большинства особей (табл. 7).
Оценка генетического разнообразия лошадей с использованием ISSR-маркеров
Использование ISSR-анализа является высокоинформативным методом анализа генофонда домашних видов животных. Однако информативность различного типа ISSR-маркеров может варьировать в зависимости от исследуемого вида. Нами было показано, что, в отличие от других копытных, для лошадей наиболее информативными являются маркеры на основе тринуклеотидных повторов, в частности GAG- и ACC-ISSR маркеры (полиморфное информационное содержание, РІС = 3,61 и 2,50 соответственно).
Наиболее высокий уровень генетического разнообразия (по Нею) был отмечен для алтайской выборки «Амальдива» и двух тувинских -«Кошкорлыг» и «Ямаалыг», а также для монгольской выборки из пустыни Гоби. Высокий уровень генетического разнообразия алтайских популяций «Амальдива» и «Джумбаев» можно объяснить географическим расположением популяций - их территория обитания граничит с Казахстаном, Китаем и Монголией, что может способствовать генетическому обмену между живущими в этой области табунами.
Исследуемые выборки распределяются в пространстве главных компонент в соответствии с географическим распространением. Алтайские популяции расположены ближе к монгольским, нежели тувинские, что может свидетельствовать о более тесном генетическом родстве между ними. Забайкальская выборка попадает в группу тувинских лошадей. Внутри монгольской группы выделяется лошадь из пустыни Гоби, она расположена дискретно, демонстрируя высокую степень консолидированности, что может быть связано с сильно отличными от остальных популяций условиями обитания и изоляцией. В то же время высокий уровень генетического разнообразия монгольской лошади из пустыни Гоби не вызывает опасений, связанных с возможными пагубными воздействиями изоляции и инбридинга.
Анализ структуры генофонда в исследуемых выборках лошадей с использованием обработки данных ISSR в программе STRUCTURE позволил выявить помесных животных и дать оценку консолидированности популяций. В забайкальской, астраханской и двух алтайских популяциях («Амальдива» и «Джумбаев») показана однородность структуры генофонда, за исключением отдельных особей (одна в забайкальской выборке и одна в алтайской «Амальдива»). Таким образом, несмотря на высокий уровень генетического разнообразия по Нею эти популяции остаются консолидированными. У двух тувинских выборок наблюдается сходная генетическая структура, которая отражается в одинаковом окрашивании столбцов в два цвета (присвоенных каждой из популяции и при смешении из-за схожести генофондов дающих двойное окрашивание столбца).
Показано, что нуклеотидное разнообразие гипервариабельного участка D-петли мтДНК лошадей Саяно-Алтайского региона находится на высоком, не вызывающем опасения о статусе пород уровне. На дендрограмме, построенной методом ближайшего соседа в программе MEGA, монгольская популяция из пустыни Гоби снова выделяется в отдельную группу (кластер) как и в результате ISSR-анализа. Таким образом, продемонстрирована высокая степень генетического отличия монгольской лошади Гоби по совокупным данным анализа последовательностей мтДНК и ISST-анализа.
Монгольская популяция из Гоби и тувинская «Арыг-Хем» демонстрируют высокий уровень генетического разнообразия D-петли мтДНК и попадают во все кластеры сети NeighborNet и даже образуют собственный уникальный кластер (IV), в котором не встречаются образцы других пород. Остальные исследованные выборки встречаются в большинстве кластеров, как характерных для примитивных, восточных и европейских пород, так и смешанных.
Выявлено 16 гаплотипов мтДНК среди исследованных нами выборок с использованием программы Network. Среди монгольской, бурятской, забайкальской и тувинской пород лошадей были обнаружены гаплотипы, идентичные гаплотипам древних лошадей Европы и Азии (A, D2, D3 и группы Х2).
У аборигенных лошадей Саяно-Алтайского региона выявлена нуклеотидная замена g.66493737C в области первого интрона гена миостатина, достоверно ассоциированная со скоростными качествами лошадей. Однако данная замена встречается с весьма низкой частотой (средняя частота 0,11) и генотипы С/С практически не встречаются, что может свидетельствовать о давлении отбора. Таким образом, для лошадей, содержащихся табунным способом в сложных условиях обитания, как и для диких видов рода Equus (зебра, осел) более характерен вариант g.66493737T.
