Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы 12
1.1 Микрочипы в диагностике и научных исследованиях 12
1.1.1 Нанотехнологии па основе биологических микрочипов 12
1.1.2 Перспективные методы анализа генетического полиморфизма 15
1.1.3 Биочипы для изучения генетической предрасположенности 21
1.2 Изучение генетического полиморфизма репин-ангиотензиновой и кинин-брадикшшновой системы 23
1.2.1 Генетический полиморфизм и сердечно-сосудистая система 23
1.2.1.1 Определение генетического полиморфизма. Его значение в современной медицинской генетике 23
1.2.1.2 Сердечно-сосудистые заболевания 24
1.2.1.3 Гены «предрасположенности» к сердечно-сосудистым заболеваниям 24
1.2.2 Артериальная гипертензия 31
1.2.2.1 Этиология и патогенез 31
1.2.2.2 Формирование представлений о генетической природе артериальной гипертензии 34
1.2.3 Ренин-ангиотешиновая и кинин-брадикипиновая системы.- 38
1.2.4 Гены «предрасположенности» к артериальной гипертензии 40
1.2.4.1 Репин 40
1.2.4.2 Ангиотензиноген 40
1.2.4.3 Ангиотепзинпревращающий фермент 41
1.2.4.4 Рецептор 1 к ангиотензину II 43
1.2.4.5 Рецептор 2 к ангиотензину II 44
1.2.4.6 Рецептор 2 кбрадикинину 44
1.2,5 Комплексное изучение ассоциации полиморфизма генов ренин-ангиотензиповой системы с предрасположенностью к артериальной ги-
пертензии 45
Глава II 2 Материалы и методы 48
2.1 Характеристика исследуемых групп 48
2.2 Синтез олигонуклеотидов и изготовление микрочипов 50
2.3 Экстракция геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови и клеток буккального эпителия 54
2.4 Проведение полимеразной цепной реакции 55
2.4.1 Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом ПААГ 56
2.4.2 Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом гибридизации на олигонуклеотидном биочипе 57
2.5 Анализ ПЦР продуктов методом ПААГ 62
2.6 Визуализация ПЦР продуктов в агарозном геле 63
2.7 Гибридизация меченого продукта на микрочипе 63
2.8 Регистрация изображения и его обработка 64
2.8.1 Анализ "фармакогенетического биочипа" 65
2.8.2 Анализ "кардиочипа" 66
2.9 Статистическая обработка данных 67
Глава III 3 Результаты и обсуждение 68
3.1 Разработка алгоритма создания биочип-тест-систем для анализа генетического полиморфизма человека , 68
3.1.1 Создание "фармакогенетического биочипа" 68
3.1.1.1 Выбор генов и полиморфных вариантов 68
3.1.1.2 Выбор нуклеотидных последовательностей и длин ПЦР продуктов, последовательностей концевых праимеров и последовательностей иммобилизованных олигонуклеотидных зондов..., 69
3.1.1.3 Особенности проведения мультиплексной ПЦР и гибридизации... 74
3.1.1.4 Конструирование биочипа. Блочный подход 75
3.1.1.5 Блочная организация микрочипа 76
3.1.1.6 Анализ контрольных и диагностических образцов. Специфичность и чувствительность метода 82
3.1.1.7 Алгоритм создания биочипов для анализа генетического полиморфизма 84
3.2 Создание "кардиочипа" 86
3.2,1 Выбор генов и полиморфных вариантов 86
3.2,2. Схема и структура микрочипа 87
3.2.3 Анализ контрольных и диагностических образцов 89
3.3 Сравнение метода гибридизации на биочипах с классическими методами анализа генетического полиморфизма 89
3.4 Применение биочипов в медицине и биологии , 91
3,5, Анализ полиморфизма генов реиин-ангиотензиновой и кинин-брадикшшновой систем у больных артериальной гипертензией и в контроле 92
3.5.1 Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов у детей, больных артериальной гипертонией, и в контроле 92
3.5.1.1 Анализ соответствия распределений закону Харди-Вайнберга 92
3.5Л.2 Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей изученных генов 93
3.5.2 Анализ ассоциации показателей ИМТ, САД, ДАД и генотипов изученных генов у детей, больных артериальной гипертонией 108
3.5.3 Корреляционный анализ взаимосвязи генотипов изученных генов, ИМТ, САД и ДАД у детей, больных артериальной гипертонией, и в контроле , 111
3.5.4 Комплексный анализ ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикиншговой систем у детей, больных артериальной гипертонией, и в контроле 115
Заключение 121
Выводы 124
Список литературы
- Нанотехнологии па основе биологических микрочипов
- Гены «предрасположенности» к сердечно-сосудистым заболеваниям
- Экстракция геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови и клеток буккального эпителия
- Анализ контрольных и диагностических образцов. Специфичность и чувствительность метода
Введение к работе
Лавинообразное нарастание интереса к изучению генетической предрасположенности требует разработки новых подходов к идентификации и анализу ДНК-полиморфизма. Современное развитие науки невозможно без создания новых технологий, позволяющих-проводить анализ множества генетических изменений одновременно. Одним из наиболее перспективных методов для решения этой задачи является метод мультиплексной ПЦР с дальнейшей гибридизацией на олигонуклеотидиой матрице (Kolchmsky and Mirzabekov, 2001; Nasedkina et al, 2003; Колчииский и др., 2005; Wang et al, 2005).
Сердечно-сосудистая патология является самой распространенной причиной смертности во всем мире. Изучение патогенеза и диагностика генетической предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям имеет большое значение не только для фундаментальной медицинской науки, но и становиться важным инструментом, для решения задач профилактической (предиктивной) медицины. Уже па сегодняшний день для многих социально-значимых заболеваний сердечно-сосудистой системы, таких как артериальная гипертеизия, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, атеросклероз и другие, показана ассоциация определенных полиморфных вариантов некоторых генов с данными болезнями (Нефедова и Шварц, 1998, Баранов и др., 2000, 2003; Иващенко и др., 2004, Babunova et а!., 2003). Очевидно, что для более точной оценки роли генетического полиморфизма в этиологии заболевания необходимо использование системного подхода, заключающегося в выборе и анализе генов, продукты которых находятся в биохимически последовательно связанных реакциях. В связи с чем, особый интерес представляет изучение полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем, принимающих участие в регулировании артериального давления и обмене электролитов. Показано, что генетический по-
лиморфизм данных систем существенно меняет их активность, что и является зачастую причиной сердечно-сосудистой патологии (Пузырев, 2003; Chistiakov et al, 1998, 2000; Rupert et al, 2003; Zhu et al, 2003; Naber et al, 2004a,b). С другой стороны большое значение имеет анализ генетического полиморфизма у больных в детском возрасте, где значительно сильнее проявляются внутренние - генетические факторы, накладывающиеся на факторы внешней среды во взрослом состоянии (Obraztsova et al, 1998).
Таким образом, разработка методических (биочипы) и методологических основ современного анализа генетического полиморфизма человека является актуальной проблемой современной молекулярной биологии и медицинской генетики.
Цель работы заключается в разработке тест-систем на основе гелевых биочипов для анализа генетического полиморфизма человека и их использование при изучении генетической предрасположенности к артериальной гипертензии у детей.
Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач:
1. Разработать алгоритм создания биочип-тест-систсм для анализа генетического
^\ _f .;« ' . ' ' ,
полиморфизма человека на примере детекции мутаций в' генах CYP1A1 (4S870A, 4889A>G и 6235Т>С), CYP2D6 (19340А и 2637delA), GSTM1 (деле-ция), GSTT1 (делеция), NAT2 (481Т>С, 590A>G и 857A>G), MTHFR (6770Т), CYP2C9 (430ОТ и 1075ОТ) и CYP2CI9 (681G>A).
2. Разработать биочип для анализа генетического полиморфизма генов REN (19-
83G>A), AGT (М235Т), AGTR1 (1166А>С), AGTR2 (31230А), BKR2 (-58Т>С),
MTHFR (6770Т), ADRB2 (48A>G и 810G) ("кардиочип").
/ 3. Проанализировать полиморфные варианты генов REN (I9-83G>A), AGT (М235Т), АСЕ (I/D), AGTR1 (1166A>C), AGTR2 (31230A), BKR2 (-58T>C и I/D) у детей, больных артериальной гипертензией, и в популяционном контроле.
Провести сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем в подгруппах больных артериальной гипертензией с различными клиническими проявлениями.
Провести комплексную оценку влияния полиморфизма генов ренин-ангиотензи новой и кинин-брадикининовой систем на развитие артериальной ги-пертензии у детей. і .1 "";' "'':-'
Нанотехнологии па основе биологических микрочипов
С помощью биочипов можно анализировать различные варианты изменений в молекуле ДНК: начиная от трансклокаций, дупликаций, протяженных делений и заканчивая микродупликациями и микроделециями, а также однонуклеотидными заменами (Kolchinsky and Mtrzabekov, 2001; Nasedkina et al, 2002, 2003; Favis et al, 2000; Landi et al, 2003; Колчинский и др., 2005; Wang et al, 2005).
Технологии разработки и изготовления ДНК-чипов различаются размером наносимых фрагментов ДНК, методами иммобилизации, процедурами гибридизации и системами детекции (Gerold et al, 1999; LipshutEef а/., 1999).
По конечному этапу детекции микрочипы разделяют на два основных типа -гибридизационные и ферментативные. В свою очередь гибридизационные чипы подразделяются на варианты в зависимости от способа считывания сигнала: электронные -"Nanogen" и флуоресцентные - "Affyrnetrix", "Биочип" и т.д.; и в зависимости от этапа дискриминации мутаций: в процессе подготовки пробы (до гибридизации) - "Applied Biosystems", "Affyrnetrix" и в процессе гибридизации проб - "Биочип"), Для примера проиллюстрируем гибридизационные методы анализа мутаций, используемые фирмами "Affyrnetrix" и "Биочип".
Для анализа генетического полиморфизма, используя технологию "Affyrnetrix", предполагается применение так называемых "специальных проб". Такие пробы состоят из нескольких фрагментов: HI и Н2 - специфичных для анализируемой последовательности ДНК; Р1 кР2 являющихся универсальными праймерами и фланкирующих сайт для клсвазы; и /ag-последовательности - специфической метки для выявления определенного SNP при гибридизации иа микрочипе (рис. 2). Детекция мутаций происходит следующим образом: в исследуемый образец, содержащий одноцепочечную ДНК с ис-комрй мутаций, добавляют "специальную пробу ". Проба комплементарно гибридизует ся с последовательностью ДНК анализируемого образца (фрагментами НІ и Н2) (рис. 2А). Далее добавляют термостабильную ДНК-полимеразу и четыре разных нуклеозид-трифосфата (используют, соответственно четыре пробирки). ДНК-полимераза достраивает 3 -конец пробы НІ на одно основание, соответствующее вариабельной позиции (рис. 2В). Затем проводят лигазную реакцию, при которой происходит соединение 5 -конеца встроенного основания с 3 -концом пробы Н2 (рис. 2С). На следующей стадии (рис. 2D) экзонуклеаза разрушает оставшуюся ДНК исходного образца. С целью дальнейшей амплификации кольцевую молекулу пробы разрезают клевазой (рис. 2). Амплификацию проводят с использованием универсальных праймеров Р1 и Р2 (рис. 2F). Далее пробы гибридизуют с микрочипом. Специфичность гибридизации достигается за счет специально сконструированного tag фрагмента (что является одним из "ноу-хау" "Afrymetrix" наряду с последовательностями универсальных праймеров). Таким образом, можно однозначно выявлять до 1000 и более SNPs в исследуемом образце. Точность метода при анализе тысячи SNPs составляет около 90%.
Разработанная в ИМБ РАН (фирма "Биочип") технология анализа генетического полиморфизма предполагает предварительную мультиплексную амплификацию иссле дуемых фрагментов ДНК с использованием флуоресцентно меченных праймеров. В результате добавления избытка меченного праймера и за счет проведения 2-х раундов ПНР достигается образование большого количества преимущественно меченного од-ноцепочечного продукта. Этот продукт добавляют на биочип, где происходит его гибридизация с иммобилизованными в геле олигонуклеотидными зондами (рис. 3). Если последовательность анализируемой ДНК полностью комплементарна последовательность зонда, то образуется стабильный дуплекс (детектируют сигнал флуоресценции), если искомого фрагмента нет, или же в нем находится некомплементарное основание, то стабильного дуплекса не образуется (сигнала флуоресценции нет) (рис. 3). Данные метод позволяет анализировать до 50 полиморфных вариантов с точностью более 98%.
Для получения высокой степени дискриминации гибридизационных сигналов ("мутантного" и "дикого" типа) одним из наиболее перспективных направлений является использование ферментативных реакций.
В настоящее время метод SBE (от англ. single base primer extension - удлинение праймера на одно основание) является одним из наиболее популярных методов при одновременном проведении большого числа параллельных реакций с целью анализа генетического полиморфизма. При подготовке проб для этого метода используют предварительную амплификацию исследуемого фрагмента (ов) ДНК, содержащего SNP, и последующую гибридизацию его с зондом на биочипе. Последовательность зонда должна быть комплементарна последовательности исследуемой ДНК, причем последние основание на 3 -конце зонда должно быть комплементарно основанию в ДНК, после которого следует вариабельный пуклеотид. Принцип детекции заключается в следующем: после гибридизации зонда с образцом в реакцию добавляют меченные диде-зоксинуклеотиды и ДНК-полимеразу. Возможно присоединение одпого-единственного нуклеотида к 3 концу иммобилизованного зонда, поскольку дидезоксинуклеотиды не содержат на З -конце гидроксильной группы, с которой соединяется 5 -фосфатный остаток следующего нуклеотида. После отмывки чипа флуоресценция его ячеек определяется именно этим меченным дидезоксинуклеотидом. По степени дискриминации между гомозиготными и гетерозиготными генотипами метод SBE в среднем па порядок превосходит гибридизацию с аллель-специфичными зондами (Pastmen et at, 1997). Недостатки этого метода состоят в необходимости синтеза олигонуклеотидов, иммобилизованных на чипе со свободным 3 концом, что исключает применение метода для наиболее перспективного типа чипов, синтезируемых способом фотолитографии, т.к. синтез олигонуклеотидов идёт в 3 - 5 направлении и свободным является 5 конец.
Схожа с методом SBE технология APEX основанная на достройке массива праймеров, синтезированных на обе цепи ДНК (arrayed primer extension). Отличие этой технологии от метода SBE в том, что для анализа используют обе цепи ДНК и несколько различных иммобилизованных зондов для каждой позиции, что дает возможность получения исчерпывающей информации, позволяя идентифицировать, в том числе, новые мутации с высокой степенью надежности (рис. 4). На рис. 4 показан принцип APEX технологии, используемый эстонской фирмой "Asper Biotech".
Гены «предрасположенности» к сердечно-сосудистым заболеваниям
На данный момент известно более полутора сотен генов, полиморфные варианты которых связывают с предрасположенностью к сердечно-сосудистым заболеваниям (Нефедова и Шварц, 1998; Шляхто и Конради, 2002; Пузырев, 2003; Cheng et ah, 1999; Liljedahl et al, 2003; Zateishchikov et at, 2004).
Стоит отметить, что одними из первых в мире подобные исследования были проведены в начале 90-х годов прошлого века в Санкт-Петербурге под руководством проф. Е.И. Шварца. Было показано, что полиморфизм генов метаболизма липидов и ренин-ангиотензиновой системы ассоциированы с предрасположенностью к артериальной гипертензии, ИБС, инфаркту миокарда и другим заболеваниям (Нефедова и Шварц, 1998; Akhmedova et al, 1996; Popov et al, 1996; Volkova et al, 1996, 1997; Obraztsova et al, 1998; Fomichevae/aA, 2000). групп: 1. 2. 3. В настоящее время все гены-кандидаты можно подразделить на несколько Гены, кодирующие белки метаболизма липидов. Гены, продукты которых вовлечены в регуляцию артериального давления. Гены, контролирующие выработку факторов свертывания крови и фибрино лиз. 4. Гены молекулярных мессенджеров (сигнальных белков). 5. Гены, кодирующие факторы пролиферации клеток. 6. Гены ионных каналов. 7. Гены, кодирующие белки метаболизма гомоцистеина. 8. Гены, кодирующие белки структурной и функциональной организации миокарда. 9. Другие гены.
В табл. № 1 приведены полиморфные варианты наиболее изученных на сегодняшний день генов, полиморфизм которых может влиять на развитие сердечно-сосудистой патологии.
Сведения о влиянии наследственного фактора при развитии артериальной гипертензии стали накапливать достаточно давно. Однако первая обобщенная информация о наследовании АГ в семьях появились к 20-30-м годам XX века (Пузырев, 2003). На основе этих данных было установлено следующее: причиной АГ является как сре-довые, так и наследственные факторы. Причем характер наследования далеко не всегда можно было объяснить менделеевскими закономерностями. Таким образом, было установлено, что АГ является мультифакториальным заболеванием, в основе которого лежат разные повреждения генома (Пузырев, 2003). Однако существует и ряд моногенных форм АГ (O Shaughnessy, 2000; Lifton etal, 2001).
Для определения генетического вклада в развития заболевания был предложен критерий оценки наследственной составляющей заболевания - коэффициент наследуемости, рассчитанный на основании близнецовых исследований. По разным данным тех лет коэффициенты наследуемости для систолического и диастолического АД составили 0,38-0,46 (Александров, 1997; Пузырев, 2003), Позднее была предложена модель мультифакториального заболевания (МФЗ), в которой выделяли два класса генов - класс главных генов и класс олигогенов и полигенов (ранжированных по вкладу в заболевание и частоте) (Нефедова и Шварц, 1998; Пузырев, 2003). Предполагалось, что главные гены можно будет легко идентифицировать сегрегационным анализом, а полигены и олигогены - анализом неравновесия по сцеплению. Однако в дальнейшем такая модель оказалась частично эффективной только для анализа лишь отдельных форм АГ.
Современные методы картирования сложнонаследуемых признаков (в том числе и МФЗ) включают четыре основных подхода: 1) анализ сцепления, 2) исследование ассоциаций, 3) метод идентичных по происхождению общих аллелей (TDT), 4) анализ скрещиваний модельных организмов, 5) метод "компьютерной геномики" или биоинформатики (ГТузырев, 2003). Анализ сцепления обычно применяют при изучении родственных индивидуумов для идентификации локуса(ов) заболевания. Метод основан на проверке конкретной модели наследования болезни в разветвленных семьях. Хотя данный метод и эффективен для анализа моногенных заболеваний, но не всегда подходит для изучения мульти-факториальных или полигенных заболеваний. В последнее время были картированы несколысо локусов, ответственных за гипертонию: во 2-ой хромосоме (с 2р22Л до 2р21), в 3-ей (3q), в 5-ой (с 5q33.3 до 5q34), в 6-ой (с 6q23.1 до 6q24.1), в 10-ой (Юр), в 12-ой (12р), в 14-ой (14q), в 15-ой (с 15q25.1 до 15q26.I), в 17-ой, в 18-ой, в 22-ой (22q) и в Х-хромосоме (Хр) (Naber е( ah, 2004a,b). Стоит отметить, что при использовании данного метода существует ряд трудностей. К примеру, при отборе генов-кандидатов из хромосомных локусов, определенных при анализе сцепления, не всегда регион, с максимумом сцепления может быть идентифицирован как локус гена-кандидата. В большинстве же случаев гены - кандидаты АГ идентифицируют на основе их биохимической или физиологической функции, которая влияет на регуляцию кровяного дав ления. Примерами могут выступать гены, кодирующие компоненты ренин-ангиотензиновой системы, адренорецепторы или компоненты эндотелиальпой функции (Naber etal, 2004а).
Другой стратегией идентификации генов-кандидатов являются полногеномный анализ ассоциации гаплотипов (генотипов) большого числа полиморфных маркеров у неродственных больных и в контроле. Особенностью анализа «контроль-случай» является, прежде всего, то, что сила статистических критериев, используемых при сравнении данных в анализе, зависит от объема выборки (чем больше выборка, тем достовернее будут отличия между группами). С другой стороны, изучение генетических ассоциаций определенного локуса с заболеванием, не может исключить ложно-положительных результатов, в отличие от анализа сцепления. Данный подход является адекватным инструментом для исследования, прежде всего, потенциальных эффектов полиморфизма по генам-кандидатам, предварительно картированным при анализе сцепления (Naber et ah, 2004а). Однако, несмотря на то, что количество описанных полиморфных вариантов в потенциальных генах-кандидатах артериальной гипертензии быстро увеличивается, количество исследований с отрицательными результатами также возрастает. Последнее обстоятельство ряд исследователей склонны связывать с генетическим фоном изучаемых популяций (Naber et al, 2004а).
Экстракция геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови и клеток буккального эпителия
Выделение ядер проводили в соответствии с методикой приведенной в руководстве Сэмбрука (Sambrook et al, 1989), с некоторыми модификациями. 1. К 2 мл крови добавляли _100 мкл ЭДТА 2. Смешивали кровь (обычно на пробу брали 500-1000 мкл) с равным объемом буфера (4С), состава: 0.32М сахароза, 5 мМ MgCI2,1% Тритон Х-100М, 0.1М TrisHCI рН 7.5. 3. Центрифугировали, 5000 об/мин, при 4С. Ядерный осадок и ресуспензировали в 400 мкл буфера, состава: 10 мМ TrisHCI рН 10.5, 0.15MNaCI, 1 мМ ЭДТА ("Sigma", США). 4. Добавляли SDS ("Sigma", США) до конечной концентрации 0.5% и инкубировали в присутствии протеииазы К (концентрации 20 мкг/мл) в течение 16 часов при 37С. 5. После инкубации добавляли 400 мкл забуферениого фенола (Sambrook et al, 1989), осторожно перемешивали 10 мин и центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин. 6. Далее переносили верхнюю фазу в другую пробирку, добавляли 400 мкл смеси фенол-хлороформ (1:1). Перемешивали 5 мин, центрифугировали. Экстрагировали фенол из верхней обводненной фазы равным объемом хлороформа, 7. К раствору ДНК добавляли последовательно 50 мкл З М ацетата Na и 800 мкл охлажденного 96% этанола. Перемешивали и центрифугировали 15 мин. при 14000 об/мин, промывали преципитат 1 мл 70% этанола. Центрифугировали повторно, осадок высушивали и растворяли ДНК в буфере ТЕ (10 тМ TrisHCI рН 7.4; 1 тМ ЭДТА рН 8.0).
Концентрацию ДНК оценивали при измерении оптической плотности при 260 и 280 им. Считали, что вьщелеиное ДНК высокого качества, если отношение А260/А280 &f, было 1.8 . ДНК хранили в ТЕ при +4С. Б) Выделение ДНК из клеток буккального эпителия. 1. Соскобы эпителия ротовой полости помешали в пробирку на 2 мл, заполненную физиологическим раствором (0,9% NaCl). Центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин. Су-пернатант сливали. 2. В пробирку, содержащую осадок добавляли 400 мкл буфера для протеиназы К. 3. Далее см.п.4 раздела 2.А.4.
Нуклеотидные последовательности искомых фрагментов генов получали из интернет-базы "Nucleotide" ("NCBI", США). Праймеры, необходимые для амплификации этих фрагментов, подбирали с использованием программы "Oligo 6" (США). Специфичность праймеров проверяли в программе "Nucleotide-nucleotide BLAST" ("NCBI", США).
Методом полимеразной цепной реакции исследовали полиморфизм двух генов: АСЕ и BKR2, Типы изученных полиморфных аллелей, последовательности олигопраЙ-меров приведены в таблице 5.
Реакционная смесь для амплификации, объемом 25 мкл включала 15 нМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCI2, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1 е.а. Taq-ДНК-полимеразы (ООО "СибЭнзим", г. Новосибирск). Для амплификации использовали программируемый ДНК-амплификатор фирмы "ДНК-технология" (Россия). После предварительной денатурации ДНК (5 минут при 94С) проводили амплификацию в режиме: для гена АСЕ: денатурация при 94 С (7мин), 33 цикла амплификации: 94 С (1мин), 60С (1мин), 72С (1мин). Заключительный синтез 72С - 5 мин. для гена BKR2: денатурация 94С (7мин), 35 циклов амплификации: 94С (ЗОсек), 58С (ЗОсек), 72С (Імші). Заключительный синтез 72С - 5 мин. А) Гены системы биотрансфорліации и метаболизма лекарств (типы изученных мутаций (полиморфизма) и последовательности олигопраймеров приведены в табл. б). Таблица 6. Нуклсотидные последовательности праймеров для мультиплексных ПЦР с последующим анализом методом гибридизации на "фармакогенетическом биочипе".
Анализ контрольных и диагностических образцов. Специфичность и чувствительность метода
На основе общих принципов, выработанных при разработке "фармакогенетического биочипа" (п. 3.1.1.2 - 3.1.1.5) нами предложен алгоритм (см. рис. 18) для создания «тематических» биочипов, состоящий из шести этапов: Этап 1. На данном этапе необходимо осуществить выбор генов, найти интересующие наиболее значимые полиморфные варианты (на биочипах возможен анализ однонуклеотидных замен, микро и макроделеций и микроиисерций). Гены (полиморфные варианты) группируют по блокам на основе сходства их функции и/или предрасположенности к одним и тем же заболеваниям (до 5-ти вариантов на блок). Далее выбирают нуклеотидную последовательность, содержащую искомый вариант (-1000 п.о.).
Этап 2. На втором этапе производят подбор олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидных зондов. Праймеры 1-го раунда подбирают согласно следующим основным критериям: длина ПЦР-продукта не должна превышать 800 нуклеотидов (300-800 п.о.), олигонуклеотидные праймеры должны быть высокоспецифичными для последовательности анализируемого гена и не иметь внутренней вторичной структуры, между З -концами праймеров должна отсутствовать комплементарность (внутри одного блока), а также все праймеры должны иметь единую температуру плавления (59+0,5С).
Праймеры 2-го раунда подбирают согласно следующим критериям: длина ПЦР-продукта не должна превышать 300 нуклеотидов (90-300 п.о.), праймеры не должны иметь внутренней вторичной структуры, между З -концами праймеров должна отсутствовать комплементарность (внутри одного блока), а также все праймеры должны иметь единую температуру плавления (61±0,5С).
При выборе олигонуклеотидных зондов учитывают температуру плавления, подбирая зонды длиной в 15-24 нуклеотида с вариабельной позицией в центральном положении.
Этап 3. На третьем этапе проводят подбор условиий мультиплексных ПЦР (как 1-го, так и 2-го раундов). Если с использованием выбранных праймеров ПЦР-продукты нарабатываются не достаточно эффективно, то необходимо вернуться к этапу №2 и заново подбирать соответствующие праймеры. На пятом этапе формируют схему расположения олигопуклеотидных зондов на биочипе и разрабатывают программу для автоматической обработки результатов гибридизации. Этап 6. На шестом этапе оценивают эффективность выявления полиморфных вариантов на контрольных образцах,
При создании "кардиочипа" был использован разработанный нами алгоритм. Для выявления генетической предрасположенности к артериальной гипертензии были выбраны полиморфные варианты следующих генов: REN (I9-83G A), AGT (М235Т), AGTR1 (1166А С), AGTR2 (31230А), BKR2 (-581 С), MTHFR (6770Т), ADRB2 (48A G и 810G). Белковые продукты генов ренин-ангиотензиновой системы (REN, AGT, AGTR1, AGTR2) являются одними из наиболее важных регуляторов кровяного давления и гомеостатической функции почки, обеспечивая поддержание жизненно необходимых процессов в организме. Брадикининовый рецептор II участвует в вазорелаксации сосудов, стимулируя выработку эндотелиальной NO-синтазы и последующую генерацию N0, метилентетрогидрофолатредуктаза участвует в обмене гомоцистеина, катализируя превращение 5,10-метилентетрагидрофолата в 5-метилентетрагидрофолат субстрат для реметилирования гомоцистеина в метионин, ADRB2 активирует аденилатциклазу через G-белок, влияя, таким образом, на артериальное давление, Популяционные частоты аллелей генов предложенные для их включения в «кардиочип» известны и они функционально значимы (смотреть п. 1.2.4).
Схема "кардиочипа" показана на рис. 19. Олигонуклеотидные зонды обозначены ячейками, каждой из которых соответствует определенная аллель или гаплотип конкретного гена.
Олигонуклеотидные пробы в составе биочипа также сгруппированы в блоки. Блок №1 предназначен для выявления полиморфизма по генам REN (I9-83G A), AGT (М235Т), AGTR1 (1166А С), AGTR2 (31230А). Выявление этих однокуклеотидных замен позволяет выявлять как мутантные аллели. -83REN A, 235AGT T, JJ66AGTRJ C, 3123AGTR2M, так и аллели дикого типа - 83REN G, 235AGT M, 1166AGTR1 A, 3123AGTR2 C вышеперечисленных генов (Lifton et al., 2001; Naber et al, 2004a,b; Frossard et al, 1999; Jones et al., 2003a).
