Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1. Цитокины, их функциональные свойства и роль в пролиферации и дифференцировке гемопоэтических клеток-предшественников 21
1.2. Характеристика биологических свойств цитокинов, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток эритроидного ряда 27
1.3, АллельныЙ полиморфизм генов цитокинов 30
1.4. Организация клеточных мембран 29
1.5. Характеристика основных мембранных белков эритроцитов 31
ГЛАВА II. Материалы и методы 40
11,1. Материал исследования 40
П.2. Молекулярно-генетические методы 41
II.3. Биохимические методы 42
П.4. Статистические методы 52
Результаты собственных исследований. 57
ГЛАВА III. Полиморфизм генов цитокинов в популяциях человека 57
III. 1. Распространенность полиморфных вариантов генов цитокинов в различных популяциях мира 57
III.2. Распространенность полиморфных вариантов генов цитокинов в популяции Курской области 62
IIL3. Сравнительный анализ популяционной распространенности полиморфизма генов цитокинов среди жителей Курской области и других популяций мира 64
Ш.4. Анализ неравновесия по сцеплению между полиморфизмами генов цитокинов 68
III.5. Обсуждение 70
ГЛАВА IV. Белки клеточных мембран эритроцитов у человека 73
IV. 1. Количественное содержание основных белков клеточных мембран эритроцитов и их сравнительный анализ в выборках мужчин и женщин 73
IV.2. Корреляционные взаимосвязи количественного содержания белковых фракций клеточных мембран в выборках мужчин и женщин и их сравнительный анализ... 76
IV.3. Обсуждение 80
ГЛАВА V. Полиморфизм генов цитокинов и количественные характеристики мембранных белков эритроцитов 84
V. 1. Сравнительный анализ количественных характеристик основных мембранных белков эритроцитов у лиц с различными полиморфными вариантами генов цитокинов 84
V.2. Многомерный статистический анализ связи ДНК- полиморфизма генов цитокинов с количественными характеристиками основных белковых фракций эритроцитов 89
V.3. Обсуждение 96
ГЛАВА VI. Вклад полиморфизма генов цитокинов в количественную вариабельность белков эритроцитарных мембран 106
VI. 1. Проявление фенотипических эффектов аллелей генов цитокинов в количественной вариабельности основных мембранных белков эритроцитов 106
VI.2. Оценка вклада генотипических различий по исследуемым локусам в дисперсию количественного содержания мембранных белков 111
VI.3. Обсуждение 118
Заключение 121
Выводы 126
Список литературы
- Цитокины, их функциональные свойства и роль в пролиферации и дифференцировке гемопоэтических клеток-предшественников
- Молекулярно-генетические методы
- Распространенность полиморфных вариантов генов цитокинов в различных популяциях мира
- Количественное содержание основных белков клеточных мембран эритроцитов и их сравнительный анализ в выборках мужчин и женщин
Введение к работе
Цитокины являются полипотентными веществами белковой природы, обладающими множественными биологическими эффектами. Они представляют собой трансмиттеры межклеточных взаимодействий, с их помощью осуществляется контроль большинства физиологических процессов [40, 150]. Обладая значительной вариабельностью, гены цитокинов характеризуются наличием однонуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных с изменением синтеза биохимических продуктов [44]. Данные полиморфизмы представляют собой удобный объект исследований, позволяющий выявить связь генов, в которых они локализованы, с регуляцией тех или иных физиологических процессов [1].
В последнее время является общепризнанной роль цитокинов в регуляции пролиферации и дифференциации эритроидных клеток-предшественниц [17, 301]. В процессе эритропоэза формируется специфическая структура эритроцитарной мембраны, которая является одним из главнейших критериев зрелости эритроидных клеток, от нее во многом зависит нормальное функционирование циркулирующих эритроцитов [75]. Сложная структурная организация цитоплазматических мембран эритроцитов во многом определяются белковыми молекулами, являющимися их важнейшими компонентами [4, 32]. Будучи тесно связанными друг с другом в структуре мембраны, белки демонстрируют взаимозависимость их количественного содержания [32]. Это приводит к тому, что в ответ на изменение продукции одного белка может наблюдаться изменение содержания в мембране целого ряда других белков, и, как следствие, - нарушение выполнения своих функций как мембраной, так и всей клеткой, что, в свою очередь, может быть причиной развития патологических состояний. Изложенное подтверждается результатами исследований вовлеченности клеточных мембран в патогенез ряда аследственных заболеваний [33, 69]. В этой связи представляется важным изучение генетического контроля за формированием белковых структур мембран эритроцитов, который осуществляется не только конкретными генами, кодирующими определенные мембранные белки, но и включает в себя массу факторов, регулирующих их экспрессию, посттрансляционную модификацию, а также процесс включения белков в состав мембраны [190, 312,326].
Одними из наиболее вероятностных факторов, участвующих в регуляции формирования белковой структуры клеточных мембран, представляются цитокины, проявляющие свои свойства на всех этапах созревания эритроидных клеток [31, 161, 301]. Однако этот аспект их влияния на эритропоэз еще не получил должного освещения, что и определило проведение настоящего исследования.
Цель.
Целью настоящей работы являлось изучение популяционных особенностей распределения полиморфизма генов цитокинов и оценка его вклада в вариабельность количественного содержания основных белков мембран эритроцитов человека.
Задачи.
1. Исследовать распределение однонуклеотидных полиморфизмов шести генов цитокинов по одиннадцати точечным заменам (-511 С/Т IL-lfi; S27P и -16Т/СIL-3; -174G/C IL-б; ТІ 13МIL-9; L10P, R25P и -509С/Т TGFfih -308G/A, -238G/A и -863С/А TNFa) среди населения Курской области и сопоставить его с распределением одноименных полиморфизмов среди других российских и мировых популяций;
2. Изучить количественное содержание основных белков мембран эритроцитов у человека и особенности их вариабельности у мужчин и женщин;
3. Выявить ассоциации отдельных ДНК-полиморфизмов генов цитокинов с особенностями количественного содержания мембранных белков эритроцитов;
4. Провести анализ взаимосвязи полиморфных вариантов генов цитокинов с характером взаимного варьирования количественного содержания компонентов белкового спектра мембран эритроцитов;
5. Оценить степень генетической детерминации количественного содержания фракций исследуемых белков мембран эритроцитов;
6. Определить вклад аллельного полиморфизма генов цитокинов в формирование фенотипической вариабельности количественного содержания белков эритроцитарных мембран.
Научная новизна работы.
Впервые проведено комплексное исследование 11 полиморфизмом 6 генов цитокинов, вовлеченных в регуляцию эритропоэза у человека. В результате исследования получены новые данные о влиянии полиморфизмов генов цитокинов на формирование количественной представительности основных белков мембран эритроцитов человека. Оценен вклад аллельных вариантов в формирование общей фенотипической и генетически обусловленной дисперсии количественной представительности отдельных белковых фракций эритроцитарых мембран. Установлена связь отдельных полиморфных вариантов генов цитокинов с количественным содержанием основных белковых продуктов, входящих в состав мембран эритроцитов. Полученные данные о сопряженности генетического полиморфизма цитокинов с характером взаимного варьирования количественного содержания мембранных белков эритроцитов расширяют представления о роли генетических факторов в формировании белковой структуры эритроцитарных мембран.
Научно-практическое значение работы.
Результаты работы представляют практический интерес для клеточной биологии, цитологии, молекулярной, клеточной и популяционной генетики, биоинформатики, нормальной физиологии человека, биохимии, гематологии и других научных дисциплинах. Они могут быть использованы в учебных процессах в высших учебных заведениях на соответствующих кафедрах.
Полученные данные создают основу для более глубокого понимания молекулярно-генетических механизмов регуляции биосинтеза белков мембран эритроцитов и открывают перспективы для разработки методов управления экспрессией их генов при различных заболеваниях человека. Результаты исследования могут найти применение в цитокиновой и антицитокиновой терапии, расширяя представления о вероятных побочных эффектах названных методов лечения.
Положения, выносимые на защиту.
1. В популяции Курской области гены цитокинов характеризуются значительной вариабельностью: оценки частот аллелей рассмотренных генных вариантов лежат в пределах от 2.4% для -238G/A до 44% для -174G/C, что позволяет рассматривать изменчивость названных генов как полиморфизм, а не мутации.
2. Частоты аллелей и генотипов исследованных полиморфных вариантов генов цитокинов в популяции Курской области отличаются от частот соответствующих аллелей и генотипов в других российских и мировых популяциях и этнических группах.
3. Индивиды, обладающие разными полиморфными вариантами генов цитокинов, характеризуются определенными различиями в количественном содержании и фенотипической вариабельности основных мембранных белков эритроцитов.
4. Носители разных полиморфных вариантов генов цитокинов отличаются особенностями взаимного варьирования у них количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов.
Полиморфизм генов цитокинов вносит вклад в формирование вариабельности количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов, определяя от 0,45% дисперсии 2.3-анкирина до 6.91% дисперсии АТБ.
Апробация работы и публикации.
Результаты работы представлены на 70-й и 71-й итоговых научных конференциях КГМУ и сессиях Централы-ю-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2005, 2006), XII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005), научных конференциях студентов и молодых ученых КГМУ (Курск, 2005, 2006), Всероссийском научном симпозиуме с международным участием «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет» (Новосибирск, 2005), IV международной научно-практической конференции «Динамика научных достижений - 2005» (Днепропетровск, 2005), Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006), научной конференции «Интеграция медицины и образования» (Курск, 2006), V Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2006). По материалам исследования опубликовано 19 работ.
Объем и структура диссертации.
Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, включает в себя 12 таблиц, 6 рисунков. Состоит из списка сокращений, введения, 6 глав, заключения, выводов и 12 приложений. Библиографический список включает 360 источников, из них 94 отечественных и 266 иностранных.
Цитокины, их функциональные свойства и роль в пролиферации и дифференцировке гемопоэтических клеток-предшественников
Эршпропоэтин. Является наиболее изученным гуморальным регулятором эритропоэза, представляет собой сиалосодержащий гликопротеин с Mw=34 Ш [237]. Его ген локализован на 7q21-q22 [145]. На его выработку влияют разнообразные факторы: гипоксия, продукты гемолиза эритроцитов и др. [173, 237, 309]. Больше всего рецепторов ЭПО имеют КОЕ-Э, в дальнейшем количество мРНК рецептора снижается [64, 165, 179]. Одни исследователи регистрируют индуцирующее влияние ЭПО на пролиферацию и дифференцировку отдельных эритроидных клеток-предшествнников, другие говорят о его вовлеченности в контроль практически всех этапов эритропоэза [31, 60, 64]. ЭПО укорачивает интермитотичєскии период у делящихся клеток эритрона, предотвращает их апоптоз, ускоряет выход ретикулоцитов в кровь. На молекулярном уровне он инициирует синтез глобина в проэритробластах [28, 54]. Индуцирующее влияние ЭПО распространяется и на синтез мембранных белков эритроцитов (спектрина, АТБ, белка 4.1). Передача эритропоэтинового сигнала опосредуется через транскрипционные факторы, среди которых выделяется NF-E1 (GATA-1), который как раз и участвует в активации генов белков эритроцитарного цитоскелета [61, 291, 326].
Обнаружено увеличение внутриклеточного содержания Са после воздействия ЭПО, что представляется важным в виду участия ионов кальция в регуляции межбелковых взаимодействий цитоскелета [121, 126, 132, 137, 175, 192, 211, 212, 288, 294] В последнее время появляется все больше исследований, посвященных его физиологическим свойствам вне гемопродуцирующеи ткани [197].
ИЛ 1р. Протеин с Mw=17kD [168], локализация гена: 2ql3 [257]. Источник: активированные моноциты разного происхождения. Также его могут синтезировать лимфоциты, фибробласты, эпителиальные клетки слизистой ЖКТ [2, 168]. Представляет собой провоспалительный плейотропный медиатор, играющий ключевую роль в развитии и регуляции неспецифической защиты и специфического иммунитета [181].
Активирует нейтрофилы, моноциты, фибробласты (продукция цитокинов и др.), эндотелиальные клетки, остеокласты, хондроциты, кератиноциты, гепатоциты, р-клетки островков Лангерганса. Стимулирует пролиферацию и дифференцировку ПСКК, неЙтрофилов, фибробластов, кератиноцитов, клеток гладкой мускулатуры, пре-В-лимфоцитов, зрелых ТН-2-лимфоцитов, В-лимфоцитов. Усиливает поступление нейтрофилов из костного мозга в кровь. Повышает хемотаксис, фагоцитоз, проницаемость сосудистой стенки, цитотоксическую и бактерицидную активность [36, 40, 49, 73, 84, 150, 306]. Действует на пул стволовых кроветворных клеток, побуждая их к вступлению в клеточный цикл, а также повышая их чувствительность к ИЛ-3 [57].
Активирует гипоталамический центр терморегуляции, стимулирует высвобождение из гипофиза адренокортикотропного гормона. Связывание его с рецепторами сопровождается рядом биологических эффектов (повышение температуры тела, нарушение сна, анорексия, миалгия, артралгия, головная боль, некоторые гастроинтестинальные нарушения). Стимулирует продукцию эндотелиапьными клетками хемокинов, усиливает экспрессию сосудистых адгезивных молекул и хемоаттрактантов. Данные о его биологических эффектах часто противоречивы. Так, он усиливает синтез белков острой фазы, цитокинов (ИЛ-2, 3, 4, 6, ФНОа, ИФНу), прокоагулянтов, повышает экспрессию рецепторов ТФРр [27, 91]. С другой стороны, он, уменьшает число рецепторов ФНОа, снижает аффинность рецептора ЭФР, снижает количество РНК, кодирующей синтез рецепторов ИЛ-6, подавляет продукцию ЭПО [101, 166, 253,330]. Таким образом, судя по отдельным эффектам, ИЛ-1[і нельзя отнести четко к стимулирующим или ингибирующим эритропоэз пептидам.
ИЛ-3, Гликопротеин с Mw=25-32 кД, локализация: 5q23-31 [112, 303]. Его основные продуценты - активированные: Т-лимфоциты, тучные клетки, кератиноциты, эозинофилы. Усиливает пролиферацию, фагоцитарную активность, антигенпредставляющую способность и продукцию ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНОа в макрофагах, высвобождение гистамина из базофилов [73, 150, 181], ИЛ-3 классифицируют как раннедействующий гемопоэтический ростовой фактор. Являясь полипотентным колониестимулирующим фактором, наряду с другими цитокинами, такими, как фактор стволовой клетки (ФСК), ИЛ-6, -1, -11, КСФ-Г, КСФ-ГМ, ЭПО, усиливает пролиферацию костномозговых клеток-предшественников всех гемопоэтических линий, нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, тучных клеток, мегакариоцитов, макрофагов, эритроцитов [49, 73, 150, 174, 181]. Его присутствие требуется для дальнейшей пролиферации стволовых кроветворных клеток сразу после покидания последними Go фазы клеточного цикла [311]. Показано, что ИЛ-3 повышает количество предшественников, которые могут быть коммитированы в сторону эритропоэза в присутствии ЭПО [18].
ИЛ-3 активирует некоторые популяции Т-лимфоцитов, повышает выживаемость тучных клеток и мегакариоцитов, выживаемость, антителозависимую цитотоксичность, кислородный метаболизм эозинофилов. Является ингибитором апоптоза. Повышает иммуносупрессивные свойства ИЛ-10, ТФРр [149, 225, 336]. ИЛ-3 способен поддерживать высокий уровень АТФ, действуя на гликолиз, регулирует синтез протеаз в тучных клетках [18].
Молекулярно-генетические методы
Выделение ДНК производили стандартным методом фенол-хлороформной экстракции из замороженной венозной крови [51]. Осажденные в PBS (рН=8.4) лейкоциты лизировались в ТЕ-буфере протеиназой К в течении 16 часов при 42С в присутствии 0,4% ДСН. ДНК лизированных лейкоцитов отмывалась в несколько этапов. Сначала 1:1 фенолом, забуференным НС1 (рН=7.4), затем забуфуренным фенолом и хлороформом (по одному объему фенола и хлороформа на два объема надосадочной жидкости) и затем хлороформом (1:1). После чего ДНК преципитировали этанолом (-20С), высушивали, растворяли ТЕ-буфером и замораживали (-20С).
Амплификация фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции. При приготовлении растворов для проведения ГЩР использовали только импортные реагенты высокой степени очистки (Ultra pure и Biotechnology Grade). ПНР проводили в 12 мкл реакционной смеси, содержащей 0.5 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включала: 67 мМ Трис-HCl рН=8.8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мкМ ЭДТА, 2,0-7,0 мМ MgCl2, 1 мМ р-меркаптоэтанола, 1 мМ каждого dNTPs (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), 15 нМ каждого из праймеров и Ш Taq-полимеразы. Для предотвращения испарения амплификационной смеси и образования конденсата на реакционную смесь наслаивали 30 мкл минерального масла. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "Терцик" (НПО "ДНК-Технология", Москва). С целью оптимизации ПЦР для каждой пары праймеров был рассчитан оптимальный температурно-временной режим отжига и подобрана соответствующая концентрация MgCl2. Последовательности праймеров и условия ГЩР для каждого исследуемого ДНК-полиморфизма приведены в таблице 2.
Рестрикционный анализ. Рестрикция амплифицированных фрагментов (5-10 мкл амплификата) производилась с помощью 5-10 U эндонуклеаз, перечень которых приведенных в таблице 2. Реакция протекала в присутствии буферов и при температурных условиях, рекомендованных производителями эндонуклеаз. Продукты рестрикции фракционировали в 7%-ПААГ геле и окрашивали в этидиумбромиде, для полиморфизма L10P TGFfil, для остальных - в 2%-агарозном геле с этидиумбромидом. Образовавшиеся в результате фракции визуализировали в проходящем УФ-свете на приборе GDS-8000 ("UVP", США). В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага А,, гидролизированную эндонуклеазой Pstl.
Реактивы. Декстран Т-500, HBS-целлюлоза, акриламид фирмы «Sigma» (США); одно- и двухвалентный фосфорнокислый натрий, додецил сульфат натрия (ДСН) и хлористый натрий фирмы «Диа-Фарм» (Россия); глицин и персульфат аммония фирмы «Reanal» (Венгрия); N,N -метилен бисакриламид, бромфеноловый синий фирмы «Fluka» (Швейцария); кумасси G-250 и Трис фирмы «Serva» (Германия); ТЕМЕД, мочевина фирмы «Bio-Ra6 (США); Р-меркаптоэтанол и ингибитор протеаз PMSF фирмы «Loba Feinchemie» (Австрия); силикон фирмы «Backman» (США) и набор маркерных белков MS-2 (Россия). Использованные в данной работе реактивы отечественного производства были марки ХЧ и ОСЧ.
Получение эритроцитов. Эритроциты получали из 5-7 мл гепаринизированной венозной крови традиционным методом Beutler [129] с незначительной модификацией. После центрифугирования крови удаляли сыворотку. Для осаждения эритроцитов использовали 3%-раствор декстрана в изотоническом Na-фосфатном буфере (PBS) с NaCl (рН=7,4±0,05). Эритроциты осаждали 2х-кратно по 30 минут при температуре 37 С. Надосадочная жидкость удалялась. Эритроцитарный осадок фильтровали через колонку с HBS-целлюлозой с целью дополнительной очистки от других форменных элементов крови и свободного гемоглобина. Затем эритроцитарную массу однократно центрифугровали с раствором PBS при 3000 оборотах в минуту.
Выделение мембран. С целью выделения мембран производили гемолиз эритроцитов осмотическим шоком по методу Dodge [170] 3-кратным центрифугированием эритроцитарной массы (при 8000 оборотах в минуту) с 10 и 5 мМ гипотоническим Na-фосфатным буфером (рН=7,4) в присутствии 1 гаМ PMSF (ингибитор эндогенного протеолиза). Впоследствии суспензию мембран лиофилизировали и хранили при t 20C.
Одномерный электрофорез. Одномерный градиентный электрофорез в полиакриламидном геле по модифицированному методу Laemmeli [239] использовался для разделения мембранных белков относительно их молекулярных масс.
Используемые растворы: 1. 60%, акриламид-0,8% метиленбисакриламидный раствор; 2. Буфер для разделяющего геля: Ш Трис-HCl (рН=8,8); 3. Буфер для концентрирующего геля: 0,5М Трис-HCl (рН=6,8); 4. 10% додецилсульфат натрия; 5. 10% персульфат аммония; 6. ТЕМЕД; 7. Электродный буфер для ЭФ: 0,025М Трис, 0Д93М глицин, 0,1%-растворДСН.
Электрофорез проводили в пластинах ПААГ размером 160 160х1мм, приготовленных с линейным градиентом концентрации акриламида 5 - 25%. «Сэндвич» для заливки ПААГ состоял из двух стекол размером 180 180x3 мм, между которыми находились смазанные силиконом спейсеры толщиной 1 мм.
Для приготовления одной пластины ПААГ сначала готовили легкий 5%-раствор, содержащий: 0,85 мл раствора 1, 5,5 мл дистиллированной воды, 3,6 мл раствора 2, 101 мкл раствора 4, 5 мкл раствора 6 и 20 мкл раствора 5. В тяжелом 25%-растворе, в отличие от легкого, бралось 4,2 мл раствора 1 и 2,6 мл дистиллированной воды. Через смеситель эти растворы подавались с помощью перистальтического насоса в «сэндвич», заполняя до уровня 4 см от верхнего его края. Сверху на разделяющий гель наслаивали 0,5 мл дистиллированной воды. После 40-минутной полимеризации разделяющего геля удаляли воду и сверху наслаивали раствор, формирующий концентрирующий гель. Для его приготовления брали 660 мкл раствора 1, 100 мкл раствора 4, 2,5 мл раствора 3, 4 мкл раствора 6, 70 мкл раствора 5 и 6 мл дистиллированной воды, Между стеклянными пластинами в концентрирующий гель вставляли формирователь лунок и наслаивали 0,3 мл дистиллированной воды. Через 20 минут после полимеризации концентрирующего геля формирователь пластины ПААГ помещался в холодильник и хранился при +4С в течение суток. Подготовка проб. Для приготовления пробы для ЭФ брали 1 мг лиофилизированной взвеси мембран эритроцитов и растворяли в 40 мкл уравновешивающего буфера,
Распространенность полиморфных вариантов генов цитокинов в различных популяциях мира
Для сравнения частот исследованных полиморфизмов, полученных для курской популяции, с данными по другим российским и мировым популяциям из доступной литературы нами были привлечены результаты генотипирования выборок неродственных здоровых индивидов (табл. 3). К сожалению, собрать информацию для других популяций по частотам всех исследованных полиморфизмов в каждой из них представлялось весьма проблематичной задачей. Поэтому собраны данные по различным популяциям. Однако и они говорят о наличии межпопуляционных и межэтнических особенностей в распределении частот исследованных полиморфных вариантов генов цитокинов.
Среди всех полиморфизмов выделялись L10P и С-509Т гена TGFfil, частоты аллелей которых статистически значимо отличались во всех популяциях (табл. 3, 4). Частоты аллелей полиморфизма -511 С/Т статистически значимо отличались у финнов и русских (г. Белгород), у финнов и итальянцев, полиморфизма -238G/A у белых граждан США и египтян, а также у голландцев и египтян. Специфичность распределения частот аллелей была менее выражена для ТИЗМ (отличалась популяция русских жителей г. Томска и бурятов), для R25P (отличались испанцы от шотландцев) и для -308G/A (разнились частоты аллелей у русских г. Белгорода и Шведов). Наименьшие межпопуляционные различия были характерны для -174G/C, различия в частотах аллелей по которому носили статистически незначимый характер.
Существенные различия по характеру распределения генотипов были обнаружены по полиморфизму -511 С/Т (табл. 3, 4). Частоты генотипов СС и СТ статистически значимо разнились во всех этнических группах. Относительно ТИЗМ русские г. Томска отличались от бурятов и таджиков по генотипам ТТ и ТМ. Итальянцы отличались от финнов и шотландцев по генотипу LL полиморфизма L10P, также для этого полиморфизма были характерны статистически значимые различия в частотах генотипа РР в группе финнов от частоты данного генотипа в группах шотландцев и итальянцев. Значимый характер носила разница между распределением частых гомозигот и гетерозигот (генотипы RR и RP) по SNP R25P у испанцев относительно шотландцев и немцев. Все рассмотренные по полиморфизму -509С/Т группы лиц (финны, итальянцы, англичане) отличались по представленности среди них генотипов СС и ТТ, но не по СТ, частота которого в этих трех популяциях была близкой. Белгородцы отличались от жителей Уфы и шведов по частотам генотипов GG и GA (полиморфизм -308G/A), но были схожи по частотам гетерозигот. Египтяне существенно отличались по распределению частых гомозигот GG полиморфизма -238G/A от белых граждан США и голландцев и, по редким гомозиготам (АА), от белых американцев.
В распределении полиморфных вариантов генов цитокинов (как по частотам генотипов, так и по частотам аллелей) не было обнаружено статистически значимых различий между жителями Томска и таджиками. Также отсутствовали различия между немцами и шотландцами по R25P, жителями Уфы и шведами по -308G/A, между голландцами и белыми американцами по -238G/A (табл. 3, 4). Среди всех исследуемых SNP выделялся полиморфизм -174G/C, который, кроме отсутствия различий по частотам аллелей, не отличался также и по частотам всех генотипов, несмотря на то, что уровень аллельного разнообразия по этому полиморфизму во всех популяциях был одним из самых высоких.
Таким образом, анализ литературных данных свидетельствует в пользу существенных межпопуляционных различий исследованных полиморфных вариантов генов цитокинов, что может бьгть связано с закономерностями распространения различных МФЗ в популяциях различных рас и народов [13, 70, 258]. Исключение в данном случае составил -174G/C гена IL6, не обнаруживший межпопуляционной специфики распространения полиморфных вариантов, это может быть объяснено более поздним происхождением данного полиморфизма по сравнению с другими SNP.
Количественное содержание основных белков клеточных мембран эритроцитов и их сравнительный анализ в выборках мужчин и женщин
Одной из причин ассоциации генетической изменчивости с теми или иными качественными или количественными признаками, помимо собственной функциональной значимости ассоциированного полиморфизма является его неравновесие по сцеплению с другим причинным геном. В ЭТОЙ связи для более точной интерпретации полученных данных был проведен анализ неравновесия по сцеплению исследованного полиморфизма генов цитокинов.
В результате была выявлено абсолютное неравновесие по сцеплению полиморфизмов -16Т/С и S27P гена 1L3 (ГХХ198; 337.49; рО.001). В сильном неравновесии по сцеплению находились также полиморфизмы L10P и -509С/Т гена TGFpl (ЕЙ). 186; %2=222.10; р 0.001). Тенденция к сцеплению была характерна для всех полиморфизмов TGFfil. Так, совместно сегрегировали частые аллели замены L10P и R25P (D=0.041, % =37.46; рО.001), в то время как частые аллели замен R25P и -509С/Т обнаружили «эффект отталкивания» (D=-0.022; %2=12.13; р=0.001). Также совместно сегрегировали аллели полиморфизмов -238G/A и -863С/А в промоторной области гена TNFa (D=0.006; %2=9.51; р=0.002), причем из исследованных полиморфизмов TNFa в сцеплении находились только эти два. Были также выявлены две межхромосомных корреляции. Они обе носили отрицательный характер, полиморфизмы, обнаружившие неравновесие по сцеплению, находились в генах TGFfil (19 хромосома) и TNFa (6 хромосома). Тенденция к взаимному отталкиванию частых аллелей наблюдалась для -863С/А и L10P (D=-0.0T1; х2=6.068; р=0.014), а также -863С/А и -509С/Т (D=-0.009; х2=4.537, р=0.033). Частоты генотипов полиморфизмов, проявивших неравновесие по сцеплению, отображены графически в приложении 4.
Таким образом, было обнаружено, что часть исследованных однонуклеотидных полиморфизмов находилась в неравновесии по сцеплению, что, несомненно, необходимо будет учитывать при последующей интерпретации результатов исследования. Это в наибольшей степени относится к парам -16Т/С и S27P, L10P и -509С/Т, которые проявили самые высокие показатели гаметической корреляции, а также к -238G/A и -863С/А, так как в данном случае относительно небольшое значение D и меньший уровень статистической значимости были обусловлены малой частотой редкого аллеля в обоих полиморфизмах (табл. 7). В более ранних работах был прослежен факт наличия совместного сегрегирования аллелей по следующим полиморфизмам: -16Т/С и S27P [112], L10P и -509С/Т [98], -238G/A и -863С/А [337]. Для остальных полиморфизмов в доступной литературе не было обнаружено информации о наличии неравновесия по сцеплению.
Установленные популяционные частоты исследуемых полиморфных вариантов генов цитокинов указывают на высокую степень гетерогенности выборки по исследуемым маркерам. Это приводит к тому, что в популяции
Курской области (как, впрочем, и в любой другой популяции, не прибывающей в изоляции в силу особенностей географического положения заселяемой территории, традиций заключения браков внутри изолята) индивиды обладают различными вариантами комбинаций генотипов. Как правило, фенотидические эффекты отдельных полиморфизмов не велики, но в их сочетаниях, по всей видимости, лежит основа различий в характере протекания процессов, контролируемых их генами [70, 151, 215, 258, 318]. Большое количество частых функционально значимых полиморфизмов (таких, как ПОР, -511С/Т, -174G/C, S27P, Т113М, -509С/Т) приводит к тому, что в популяциях получают значительную распространенность так называемые «полярные» комбинации генотипов. А в совокупности с вовлеченностью данных цитокинов в регуляцию важнейших физиологических процессов, широкое распространение исследованных полиморфизмов может быть связано с межиндивидуальными особенностями патогенеза ряда мультифакториальньгх заболеваний (МФЗ) человека. Это должно учитываться при определении подходов в лечении, в частности, цитокиновой и антицитокиновой терапии. Таким образом, для пациентов с комбинацией генотипов, приводящей к стимуляции процесса, который необходимо медикаментозно корректировать, будет эффективной терапия путем введения аналогов цитокинов, ингибирующих данный физиологический процесс, а для лиц с «ингибирующим» генотипом -малоэффективна или даже опасна. Обратная ситуация характерна при «ингибирующем» генотипе [174, 344]. Комплексное определение генотипов по полиморфизмам, ассоциированным с той или иной патологией, может позволить сделать долгосрочный прогноз для предотвращения развития заболевания или снижения тяжести его протекания.
