Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1. Проблема вентральных грыж и патогенетические аспекты их возникновения 11
2. Диффузные заболевания соединительной ткани 20
3. Молекулярно-клеточная биология соединительной ткани 22
4. Молекулярно-генетические аспекты функционирования соединительной ткани 28
4.1. Характеристика матриксных металлопротеиназ 28
4.2 Роль цитокинов 30
4.3. Адгезивные белковые молекулы 30
5. Рибосомные гены и их функциональная активность при различных физиологических состояниях 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 40
2.1.1. Общая характеристика выборки 40
2.1.2. Клиническая характеристика 44
2.2. Методы исследования 45
2.2.1. Технология выполнения биопсии кожи и апоневроза для гистологического исследования, приготовление и анализ препаратов 45
2.2.2. Цитогенетические методы 46
2.2.3. Молекулярно-генетические методы 49
2.2.4. Статистические методы 51
Глава 3. Морфологическое исследование образцов кожи и апоневроза 55
Глава 4. Функциональная активность рибосомных генов у больных с вентральными грыжами 62
4.1. Показатели функциональной активности рибосомных генов у больных с вентральными грыжами 62
4.2. Показатели функциональной активности рибосомных генов у лиц контрольной группы 64
4.3. Сравнительный анализ показателей функциональной активности рибосомных генов у больных с вентральными грыжами и у контрольной группы 67
4.4. Анализ показателей функциональной активности рибосомных генов при дискриминации по полу 73
4.5. Многомерный анализ функциональной активности рибосомных генов 79
Глава 5. Ассоциации полиморфизмов генов матриксных металлопроетиназ и генов цитокинов с развитием вентральных грыж у человека 83
5.1. Распределение генотипов генов цитокинов и генов матриксных металлопротеиназ у больных с вентральными грыжами 84
5.2. Анализ ассоциаций полиморфизма генов цитокинов и генов матриксных металлопротеиназ в группе больных с вентральными грыжами и лицами контрольной 90
Глава 6. Многомерный анализ ассоциаций межгенных взаимодействий и функциональной активности рибосомных генов с предрасположенностью к развитию вентральных грыж 91
6.1. Влияние парных межгенньтх взаимодействий генов цитокинового ряда и генов матриксных металлопротеиназ на предрасположенность к формированию вентральных грыж 91
6.2 Анализ связи сочетаний полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ и генов цитокинов с показателями комплекса функциональной активности рибосомных генов у больных вентральными грыжами 106
6.3. Регрессионный анализ 109
Заключение 114
Выводы 123
Практические рекомендации 124
Список использованной литературы 125
- Проблема вентральных грыж и патогенетические аспекты их возникновения
- Морфологическое исследование образцов кожи и апоневроза
- Распределение генотипов генов цитокинов и генов матриксных металлопротеиназ у больных с вентральными грыжами
- Регрессионный анализ
Введение к работе
Актуальность проблемы
Послеоперационная вентральная грыжа является самым распространенным послеоперационным осложнением абдоминальной хирургии, достигая 20% уровня после срединной лапаротомии. Рядом рандомизированных исследований показано, что после аутопластики грыжевых выпячиваний около 50% послеоперационных грыж рецидивируют. В связи с этим пациенты вынуждены переносить очередное оперативное вмешательство, что сопровождается дополнительными рисками (Hoer J et al., 2002).
Одна из основных проблем возникновения вентральных грыж, в частности послеоперационного грыжеобразования, заключается в отсутствии достоверных прогностических признаков появления данного заболевания. В связи с этим нас заинтересовали более глубокие механизмы патогенеза, механизмы, лежащие на генном уровне.
Ранее некоторые хирурги по ходу выполнения своих исследований, ставили перед собой одну из целей – изучение экспрессии ряда генов, и получали положительные результаты. Так, например, U. Klinge, V. Schumpelick (2001) нашли повышение количества коллагена III типа с одновременным снижением соотношения коллаген I / коллаген III за счет повышения последнего у больных с послеоперационными и, особенно, рецидивными грыжами по сравнению с контролем более чем в два раза. Из наших соотечественников данной проблемой занимался профессор А.А. Гостевской (2008), он описал достоверное увеличение экспрессии гена коллагена III и соотношения коллагенов III/I у больных с клиническими признаками неспецифической дисплазии соединительной ткани выявлено по сравнению с контролем. Кроме того, выявлено достоверное увеличение продукции ММР I у больных с послеоперационными вентральными грыжами (Гостевской А.А., 2008).
При этом в научной литературе отсутствуют комплексные исследования генетических аспектов послеоперационного грыжеобразования в частности и всех вентральных грыж в целом.
Цель исследования
Изучить функциональную активность рибосомных генов и полиморфизм некоторых структурных генов и их вовлеченность в формирование вентральных грыж у человека.
Задачи исследования
-
Изучить соотношение коллагенов I и III типов в коже и апоневрозе у людей с вентральными грыжами и у лиц контрольной группы.
-
Изучить функциональную активность рибосомных генов в группе людей с вентральными грыжами и у лиц контрольной группы.
-
Изучить полиморфизм генов матриксных металлопротеиназ и генов цитокинового ряда в группе людей с вентральными грыжами и у лиц контрольной группы.
-
Изучить комплексное влияние и взаимовлияние полиморфизмов исследуемых генов и функциональной активности рибосомных генов на формирование вентральных грыж.
-
На базе полученных данных разработать метод прогнозирования вентральных грыж и рекомендации по профилактике вентральных грыж с использованием молекулярно-генетических и цитогенетических подходов.
Новизна исследования
Впервые осуществлен комплексный подход, заключающийся в анализе клинических, морфологических, цитогенетических и молекулярно-генетических факторов такого значимого, распространенного и опасного осложнения, как послеоперационная вентральная грыжа в частности и все вентральные грыжи в общем. Установлено, что отношение типов коллагена I к коллагену III у больных с вентральными грыжами было в 2 раза меньше, чем у лиц без вентральных грыж. Установлены взаимосвязи показателей функциональной активности рибосомных с риском развития заболевания, у больных с вентральными грыжами была достоверно снижена функциональная активность рибосомных генов за счет выключения из работы рибосомных цистронов хромосом группы G. Помимо этого, реализованный в настоящей работе комплексный подход, включающий стандартные методы генетической эпидемиологии, статистической генетики и компьютерного моделирования, позволил установить 3 генетических маркера предрасположенности к грыжеобразованию: MMP3 -1171 5A->6A, TGFВ1 C-509T, EGF А+61G. Данные нашего исследования наглядно демонстрируют наличие индивидуальных генетических особенностей, формирующих норму реакции организма, реализующуюся в условиях воздействия стрессорного фактора в отношении грыжеобразования.
Практическая значимость работы
Полученные в ходе исследования данные о взаимосвязи показателей функциональной активности рибосомных генов, результаты типирования полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ и цитокинов открывают перспективы для превентивной диагностики послеоперационных осложнений. С учетом того, что ранее не было комплексных генетических исследований причин возникновения вентральных грыж, данное исследование открывает перспективы для дальнейшего более углубленного и более точного исследования генетических детерминант развития вышеописанного заболевания.
Апробация работы
Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: 75-й итоговой Всероссийской конференции студентов и молодых учёных с международным участием (Курск, 2010), 76-й итоговой Всероссийской конференции студентов и молодых учёных с международным участием (Курск, 2011), IV международном медицинском конгрессе (Санкт-Петербург, 2011), пятидесятой юбилейной международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2012),
VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2013), итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной
78-летию Курского государственного медицинского университета (Курск, 2013).
Личный вклад автора
Автором лично определены цели и задачи исследования, разработаны методические подходы для их решения, проведено клиническое обследование всех больных вентральными грыжами. Автор проводил контроль результатов морфологического исследования, лично выполнял цитогенетическое и молекулярно-генетическое исследования, проводил обработку, анализ и обобщение полученных результатов, апробацию результатов исследования, подготовку основных публикаций по выполненной работе, написание и оформление рукописи.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 в журналах из перечня ВАК Минобрнауки РФ.
Положения, выносимые на защиту
-
У больных с вентральными грыжами определяется достоверное снижение соотношения коллагенов I/III типа в коже и апоневрозе в сравнении с пациентами контрольной группы.
-
При всех клинических формах вентральных грыж наблюдается снижение функциональной активности рибосомных генов в сравнении с контролем. Доказано, что снижение происходит за счет выключения из работы рибосомных цистронов хромосом группы G, что может служить прогностическим признаком для послеоперационного грыжеобразования.
-
Полиморфизмы генов MMP3 -1171 5A->6A, TGFВ1 C-509T, EGF А+61G достоверно ассоциированы с развитием вентральных грыж.
-
Разработаны метод прогнозирования и практические рекомендации для превентивной диагностики послеоперационного грыжеобразования.
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в работу Курской областной клинической больницы, лаборатории медицинской генетики кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета и лаборатории «Генетика» Курского государственного университета, а также в учебный процесс на кафедре хирургических болезней № 1.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу и 14 рисунков. Библиографический список используемой литературы включает
187 источников, из которых 100 зарубежные.
Проблема вентральных грыж и патогенетические аспекты их возникновения
Наружной грыжей живота называют заболевание, при котором через различные отверстия в мышечно-апоневротическом слое передней или задней брюшной стенки и тазового дна происходит выпячивание внутренних органов вместе с пристеночным листком брюшины при целостности кожных покровов. Эти отверстия ("слабые места") могут являться естественными анатомическими образованиями, такими как пупочное кольцо, щели в белой линии живота, паховый канал, бедренное кольцо, треугольник Пти, промежуток Грюнфельда-Лесгафта и т.д., либо возникают вследствие травм, операций или заболеваний. Внутренними называют такие грыжи живота, которые образуются внутри брюшной полости в брюшинных карманах и складках или проникают в грудную полость через естественные или приобретенные отверстия и щели диафрагмы [33, 69].
Количество грыженосителей на протяжении десятилетий остается стабильным и составляет 3-6% численности населения [49, 57, 69, 75]. В общехирургических стационарах пациенты с грыжами составляют до 10%, а операция герниопластика является одной из распространенных достигая 10-21% [10, 14, 173, 159]
Послеоперационные вентральные грыжи
В структуре грыжевой болезни ведущее место занимают послеоперационные вентральные грыжи [56]. Являясь сложным, многоплановым состоянием, их лечение представляет собой серьезную проблему любого хирургического стационара, так как большие грыжи, помимо повреждений кожного покрова и мышц, могут вызывать нарушения дыхательной системы и внутренних органов [40, 68, 175]. Послеоперационная вентральная грыжа — частое осложнение в абдоминальной хирургии, возникающее, по данным разных авторов, у 2—15% больных, перенесших лапаротомическое вмешательство [100, 128, 76, 39]. Примерно в 50% случаев послеоперационные вентральные грыжи развиваются в течение первых 2 лет с момента хирургического вмешательства [160].
Современная тенденция такова, что послеоперационные вентральные грыжи рассматриваются как самостоятельное полиэтиологическое и комплексное заболевание с нарушением функций внутренних органов, ухудшением деятельности дыхательной и сердечно-сосудистой систем, изменением взаимодействия мышечно-апоневротических образований брюшной стенки, дистопией органов живота, выраженными косметическими дефектами [5, 19, 40, 67, 68, 69, 167].
Этиология и патогенез
Этиологические факторы многообразны и проявляют себя лишь при определённых условиях. В одних случаях возникновение дефекта в мышечно-апоневротическом слое является следствием ранних послеоперационных осложнений, эвентрации или глубоких подапоневротических нагноений. В других - нарушение функции передней брюшной стенки развивается постепенно, вследствие дряблости и атрофии мышц, истончения и дегенерации апоневрозов и фасций. И, наконец, третья группа причин находится в непосредственной связи с качеством регенераторных процессов в ушитой послеоперационной ране, когда образующиеся рубцы слишком податливы и непрочны, чтобы противодействовать внутрибрюшному давлению [19].
Морфологическая недостаточность тканей может быть не только результатом эвентрации или обширного нагноения. Примером может служить частое образование грыжи у пожилых и престарелых больных. С возрастом мышцы, апоневрозы и фасции живота теряют свою эластичность и прочность вследствие истончения мышечных и коллагеновых волокон, появления между ними включений жировой клетчатки [19].
Определённое количество послеоперационных грыж возникает исподволь при, казалось бы, вполне благоприятном заживлении раны. Почему они возникают? Ответ на этот вопрос базируется на трёх моментах. Во-первых, может наблюдаться резко замедленная регенерация. Наиболее частыми причинами, как мы уже указывали, являются расстройства обменных процессов и авитаминоз, способствующие нарушению нормального заживления раны. Во-вторых, - чрезмерная физическая нагрузка на ещё не сформировавшийся рубец (тяжёлая физическая работа в раннем послеоперационном периоде, беременность, запоры, расстройства мочеиспускания). В-третьих, -техническое несовершенство операции. Сюда следует отнести, прежде всего, применение кетгута для сшивания апоневроза и фасций, который рассасывается быстрее, чем образуется полноценный рубец, а также те случаи, когда хирург нарушает анатомичность соединения слоев, накладывает слишком редкие швы, в результате чего в одних случаях резко ухудшается кровоснабжение сшиваемых тканей, а в других - недостаточно равномерно сопоставляются края раны [19].
Безусловно, одним из главных факторов возникновения послеоперационных грыж является выполнение оперативных доступов большой длины и часто - без учёта топографо-анатомического строения передней брюшной стенки. Это ведёт к пересечению большого количества тканей, мощных мышечных пластов, магистральных сосудов и нервов и, как следствие, - к образованию послеоперационных грыж и вообще к плохим лечебным и косметическим результатам. Установлено, что чем больше оперативный доступ, тем тяжелее послеоперационный период [С.С. Слесаренко с соавт., 1999]. На сегодняшний день происходит осознание необходимости уменьшения длины разреза передней брюшной стенки и более бережного отношения к её тканям. Операции выполняются из небольших, так называемых мини-доступов, причём, с применением как обычных инструментов, так и инструментов и ранорасширителей оригинальных конструкций, а также лапароскопических манипуляторов. Грыжи наблюдаются и после эндоскопических операций, но несравнимо реже, и при том они редко бывают больших и гигантских размеров [19].
Микроциркуляторное русло представлено крайне ограниченным количеством сосудов. Строение апоневроза в зоне грыжевых ворот также изменяется. Он истончается. Между его волокнистыми структурами возникают множественные пустоты Даже через 2-3 года после перенесенного нагноения налицо явления хронического воспаления в тканях, что выражается в диффузной лимфоцитарной и гистиоцитарпой инфильтрации мышц, апоневроза и фасций. В толще рубцов и в подкожной основе можно видеть микроабсцессы, окружённые соединительно-тканной капсулой, а также рыхлые клеточные гранулёмы вокруг шёлковых лигатур (Ш.А. Фадель, 1997). Таким образом, при световой микроскопии обнаружены дистрофические изменения в волокнистых структурах апоневроза, выражающиеся в истончении коллагеновых волокон и резком уменьшении клеточных элементов, которые, в основном, представлены фиброцитами, а также в уменьшении количества и частичной фрагментации эластических волокон [19].
Важной отличительной особенностью морфологических проявлений у больных с послеоперационными грыжами являются признаки продолжающейся регенерации даже через 3-5 лет после предыдущей операции, проявляющиеся в новообразовании волокон, молодых клеток соединительной ткани, в новообразовании сосудов.
По данным электронно-микроскопических исследований, независимо от сроков заживления в материале обнаруживаются разнонаправленные изменения. Помимо обширных полей зрелой сформированной соединительной и фиброзной тканей с многочисленными фиброцитами встречаются зоны, в которых происходит интенсивное коллагенообразование. [19].
В некоторых участках превалируют активно функционирующие фибробласты с характерными изменениями ультраструктуры в виде изменений формы ядра с перераспределением хроматина, появления множественных митохондрий с плотным матриксом, умеренной гиперплазией цитоплазматической сети и наличием в цитоплазме центров коллагенообразования. В зонах вокруг лигатур обнаруживались юные, незрелые фиброциты, находившиеся в стадии подготовки к активному функционированию, что указывает на незавершённость процессов образования и созревания соединительной ткани. Нередко можно встретить и новообразованные сосуды капиллярного типа. Тромбоциты плотно прилегают к поверхности эндотелия. В цитоплазме эндотелиальной клетки наблюдаются множественные очаговые просветления, являющиеся результатом внутриклеточного (интрацеллюлярного) отёка. Митохондрии мелкие с плотным электронно-оптическим матриксом. В центральной части ядра имеет место разрежение хроматина с его конденсацией в виде гетероформы вблизи ядерной мембраны. Как при световой, так и при электронной микроскопии были получены объективные и аргументированные сведения о цикличности в формировании рубца брюшной стенки и незавершённости регенераторного процесса даже в течение 5-8-ми лет после предыдущей операции. По всей видимости, подобное заживление в зоне послеоперационной грыжи протекает по типу порочного круга: хроническое воспаление — деструкция участков ткани в зоне рубца — регенерация — обострение хронического воспаления — деструкция — регенерация [19].
Морфологическое исследование образцов кожи и апоневроза
В приведенной ниже таблице представлены результаты морфологического исследования кожи у пациентов с вентральными грыжами и пациентов контрольной группы - без грыжевой болезни. Также были составлены пропорции соотношения коллагена I типа к коллагену III типа.
При исследовании гистологических препаратов кожи у больных 1 группы (исследуемой) было установлено, что среднее содержание коллагена I и III типа составляет 51,48±1,83% и 48,52±1,83% соответственно.
Соотношение коллагена I и III типа в коже у больных 1 группы составляет 1,06±0,1, в связи с чем происходила окраска препарата в зеленый цвет.
Исследование гистологического препарата кожи у лиц 2 группы (контрольной) выявило содержание коллагена I типа 69,07±2,66%, III типа 30,93±2,66%.
Окраска препарата при данном типе исследования в красный цвет объясняет значительное преобладание коллагена I типа над III. Отмечается мелкая зернистость.
Соотношение типов коллагена составляет 2,26±0,29.
Далее были изучены гистологические препараты образцов апоневроза у больных с вентральными грыжами и у лиц контрольной группы. Аналогично, как и в исследовании образцов кожи, были составлены коэффициенты соотношения типов коллагена I/III
Микроскопическая картина участка апоневроза у больного с ВГ. Поляризационная микроскопия. Окраска Sirius Red. Объектив Х400.
Исследование гистологических препаратов апоневроза группы больных с вентральными грыжами показало, что содержание коллагена I типа 52,35±2,97%, а III типа 47,65±2,97%. Соотношение типов коллагена в апоневрозе у больных с грыжами составляет 1,11 ±0,15, что значительно ниже уровней коллагена у обследованных без вентральных грыж.
При поляризационной микроскопии гистологического препарата апоневроза у больных контрольной группы было выявлено, что содержание коллагена I типа составило 69,11±2,68%, а III типа 30,89±2,68%. Коэффициент соотношения типов коллагена 2,27±0,3, что значительно больше в сравнении с исследуемой группой.
Таким образом, у больных с вентральными грыжами отмечается достоверное снижение соотношения типов коллагена как в препарате кожи, так и апоневроза в сравнении с лицами контрольной группы.
При сравнительном анализе полученных результатов можно отметить, что у больных исследуемой и контрольной групп между сериями (сравнение результатов кожи и апоневроза в одной группе) достоверных отличий не установлено. В связи с чем, была определена закономерность соотношения коллагена в коже и апоневрозе. Таким образом, уровень соотношения типов коллагена в коже и апоневрозе аналогичен у больных одной группы.
Исследуя соотношение типов коллагена в коже у лиц контрольной группы и с грыжами были выявлены достоверные отличия содержания коллагена. Соотношение типов коллагена у пациентов без вентральных грыж составило 2,26, а у больных с грыжами это соотношение было достоверно ниже -1,06.
Сравнивая соотношение коллагена в апоневрозе у больных с грыжами и без них, так же выявлены достоверные отличия, заключающиеся в снижении этого соотношения у больных с грыжами. Так соотношение коллагена в апоневрозе у больных без грыж составил 2,27, а у больных с грыжами - 1,12.
По итогам полученных результатов можно заключенить, что имеются достоверные отличия содержания коллагена как в коже, так и в апоневрозе у больных без грыж и с грыжами.
Из приведенной выше диаграммы видно, что соотношение коллагена I и III типа в коже и апоневрозе у больных без грыж равно 2,26 и 2,27 соответственно, что говорит об отсутствии достоверных отличий и высокой степени корреляционной связи.
Соотношение коллагена I и III типа в коже и апоневрозе у больных с вентральными грыжами.
У больных с грыжами соотношение коллагена I и III типа в коже - 1,06, апоневрозе - 1,12, что в свою очередь так же говорит о высокой корреляционной связи и отсутствии достоверных отличий. Оценивая показатели коллагена I и III типа между контрольной и исследуемой групп отмечено, что имеются достоверные отличия. Снижение процентного содержания коллагена I и III типа является одной из причин развития послеоперационных грыж.
Распределение генотипов генов цитокинов и генов матриксных металлопротеиназ у больных с вентральными грыжами
Для исследования вовлеченности генов цитокинового ряда и генов коллагеназ в формирование предрасположенности к вентральным грыжам была взята популяционная выборка неродственных людей проживающих на территории Курской области, у которой было проведена оценка функциональной активности рибосомных генов и исследование кандидатных генов. Геномная ДНК выделенная из крови 313 человек, была подвергнута генотипированию по 4 полиморфизмам 4 генов цитокинового ряда и 2 полиморфизмов 2 генов матриксных металлопротеиназ. Распределение частот генотипов данных полиморфизмов и их соответствие популяциоиному равновесию Харди-Вайберга (РХВ) проводилось раздельно в контрольной группе и в группе больных с вентральными грыжами. В таблице 23 представлены частоты генотипов в контрольной выборке.
В результате проведенного анализа распределения генотипов на равновесие Харди-Вайнберга в контрольной группе выявлено, что все полиморфизмы соответствуют нормальному популяциоиному равновесию Харди-Вайнберга.
В таблице 24 представлены результаты расчета распределения генотипов и значения гетерозиготности по полиморфным вариантам генов в выборке больных с вентральными грыжами.
В результате проведенного анализа установлено, что в полиморфизме 469 A/G гена ICAM1 распределение генотипов не подчинялось закону Харди-Вайнберга. Здесь отмечалось уменьшение гетерозиготности. Их ожидаемое количество было в 1,2 раза выше наблюдаемого значения. По остальным полиморфизмам отклонения от равновесия Харди-Вайнберга не наблюдалось.
Следующим этапом настоящего исследования было изучение ассоциаций аллелей и генотипов генов матриксных металлопротеиназ и цитокинов с риском развития вентральных грыж.
В таблице 25 представлены частоты аллелей изучаемых полиморфных генов и результаты их сравнительного анализа между выборкой больных с вентральными грыжами и контрольной группами. Из нее следует, что статистически значимые различия между выборками по частотам аллелей были выявлены в гене TGFB1 (OR 1,61, С195% 1,25-2,50). В гене EGF различия по частотам аллелей также были статистически значимыми (OR 1,61, С195% 1,15-2,28) как и по гену ММРЗ (OR 1,71, С195% 1,20-2,43). Это может свидетельствовать о положительной ассоциации изучаемых полиморфизмов данных генов с вентральными грыжами.
Так как анализ ассоциации аллелей не дает полной картины о характере взаимосвязи рассматриваемых полиморфизмов с предрасположенностью к грыжеобразованию, было проведено исследование влияния генотипов исследуемых полиморфизмов на риск развития вентральных грыж (Таблица 26).
По данным таблицы 26 было установлено, что вариантный генотип 509ТТ гена TGF ассоциировался с повышенным риском развития вентральных грыж (OR 1,94 С195% 1,12-2,5), при этом количество диких гомозигот 509 СС этого же гена были статистически значимо выше в контрольной группе (OR 0,49 С195% 0,29-0,85). Частота гомозигот 61АА гена EGF среди людей с вентральными грыжами была выше, чем в контрольной группе (OR 1,89 С195% 1,01-3,55). В данном гене частота дикого генотипа 61 GG также была статистически значимо выше в контрольной группе (OR 0,58 С195% 0,36-0,93). В гене ММРЗ была выявлена положительная ассоциация генотипа 1171 6А6А связана с вентральным грыжеобразованием (OR 0,58 С195% 0,36-0,93). Генотип 1171 5А5А имел обратный эффект и имела статистически значимую отрицательную ассоциацию с вентральным грыжеобразованием (OR 2,08 С195% 1,01-4,25). По остальным генотипам статистически значимых различий не выявлено.
Также был проведен сравнительный анализ между больными послеоперационными вентральными грыжами и прочими грыжами. Результаты представлены в таблицах 27 и 28.
Достоверных различий между двумя группами ни по одному из параметров выявлено не было.
Регрессионный анализ
Комплексная оценка генетических факторов риска развития болезни является наиболее адекватной в отношении прогнозирования вероятности его возникновения потому как учитывает сочетание всех возможных предикторов, имеющих этиологическое значение для формирования предрасположенности к тому или иному заболеванию (Cooper R.S., 2003). С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования риска развития вентральной грыжи на основании исследованных особенностей функциональной активности рибосомных генов, на основании исследованных полиморфизмов генов-цитокинов и генов матриксных металлопротеиназ и данных общего обследования больных. Основная цель данного этапа - создать модель для своевременного выявления больных с предрасположенность к послеоперационному грыжеобразованию еще до проведения оперативного лечения. Оценка влияния изучаемых параметров на риск развития вентральных грыж осуществлялась методом бинарной логистической регрессии, которая позволяла построить статистическую модель для прогнозирования вероятности заболевания (Hosmer D.W., Lemeshow S., 2000). Результатом логистического регрессионного анализа является расчет оценок регрессионных коэффициентов bo, bh b2, ...b,уравнения (Реброва О.Ю., 2003):
Y=b0 + b,X1 + b2X2+...bXi,
где ХІ..,ХІ - прогностически ценные независимые (объясняющие) признаки (в нашем случае это ФАРГ, исследуемые ДНК-маркеры и данные клинического обследования). Значения коэффициентов bt представляют собой натуральные логарифмы отношения шансов (OR) для каждого из соответствующих предикторов Xj. Значение Y в уравнении регрессии - это натуральный логарифм OR для изучаемого события (для риска возникновения вентральной грыжи), т.е. Y = In (Р/(1 -Р)). Вероятность свершения события (для риска возникновения вентральной грыжи) для каждого конкретного индивида вычисляется по формуле (Реброва О.Ю., 2003):
Р = еу/(1+еу),
где Р — вероятность свершения события, е — математическая константа, приблизительно равная 2,72.
При оценке уравнений регрессии был использован метод пошагового включения предикторов, который ранжировал признаки в соответствии с их вкладом в модель. Относительный вклад отдельных предикторов оценивался величинами статистик %2 Вальда, величин стандартизированных коэффициентов регрессии и соответствующих уровней значимости. В качестве критерия согласия реального распределения наблюдений по отдельным градациям исследуемых факторов риска на основе уравнения логистической регрессии использовался процент правильной классификации. С использованием метода пошагового включения предикторов и расчета отношения правдоподобия были оценены все возможные сочетания показателей функциональной активности рибосомных генов, полиморфизмов изучаемых генов и данных клинического исследования с целью поиска наилучшей статистической модели, предсказывающей риск развития вентральной грыжи. Наилучшая предикативная статистическая модель отбиралась по следующим критериям: наивысший уровень статистической значимости модели в целом, наличие статистически значимых эффектов каждого из предикторов, включенных в модель, наиболее высокие значения процента правильной классификации больных вентральными грыжами и здоровых. Среди всех оцененных моделей статистических моделей наиболее прогностически ценной в отношении риска развития вентральных грыж была модель, включающая следующие предикторы: количество активных рибосомных цистронов хромосом группы G, полиморфизм -1171 5А- 6А гена ММРЗ, полиморфизм С-509Т гена TGFB1, полиморфизм A+61G гена EGF и наличие отрицательного резус-фактора (Rh - ). Параметры логистической регрессионной модели представлены в таблице 41.
Уровни значимости коэффициентов регрессии для всех предикторов были менее 0,05, т.е. каждый из них оказывал статистически значимое влияние на риск возникновения вентральной грыжи. Величина отношения шансов для представленной регрессионной модели составляла 54,7, демонстрируя, что при увеличении на единицу значения і-го признака шанс возникновения вентральной грыжи увеличивается более чем в 50 раз. Указанная модель корректно предсказывает в 73% случаев вероятность возникновения вентральных грыж и в 68% случаев правильно классифицирует здоровых индивидов.
С целью проверки работоспособности модели нами были смоделированы трое пациентов, поступивших на оперативное лечение в хирургическое отделение. Им была показана предоперационная диагностика развития послеоперационной вентральной грыжи с использованием указанных факторов риска развития болезни.
1. Пациент А.: количество активных рибосомных цистронов хромосом группы G (RC G) составило 2,2 (Х1=2,2), имеет генотипы ММРЗ -1171 6А6А (Х2=3), TGF -509ТТ (Х3=3), EGF +61АА (Х4=3), имеет отрицательный резус-фактор (Х5=0). Подставив эти значения в уравнение регрессии, получим для пациента A.: Y = -1,05 + (-0,84) х 2,2 + 0,72 х 3 + 0,32 х 3 + 0,85 х 3 + (-1,48) х 0 = 2,772, соответственно Р = 2,722,772/ (1+2/722,772) = 0,95, т.е. вероятность риска возникновения вентральной грыжи у пациента А высока и составляет около 95%.
2. Пациент Б: количество активных рибосомных цистронов хромосом группы G (RC G) составило 3,8 (Х1=3,8), имеет генотипы ММРЗ -1171 5А5А (X2=l), TGF -509СС (X3=l), EGF +61GG (Х4=1), имеет положительный резус-фактор (Х5=1). Подставив эти значения в уравнение регрессии, получим для пациента A.: Y - -1,05 + (-0,84) х 3,8 + 0,72 х 1 + 0,32 х 1 + 0,85 х 1 + (-1,48) х 1 = -3,832, соответственно Р = 2,72"3 832/ (1+2,72 3 832) или (1/2,723 832) / 1+ (1/2,72 ) =0,02 , т.е. вероятность риска возникновения вентральной грыжи у пациента Б крайне мала и составляет около 2%.
3. Пациент В: количество активных рибосомных цистронов хромосом группы G (RC G) составило 2,7 (Х1=2,7), имеет генотипы ММРЗ -1171 5А6А (Х2=2), TGF -509СС (X3=l), EGF +61АА (Х4=3), имеет положительный резус-фактор (Х5=1). Подставив эти значения в уравнение регрессии, получим для пациента A.: Y = -1,05 + (-0,84) х 2,7 + 0,72 х 2 + 0,32 х 1 + 0,85 х 3 + (-1,48) х 1 = -0,488, соответственно Р = 2,72 ш/ (1+2,72 0,488) = 0,69, т.е. вероятность риска возникновения вентральной грыжи у пациента В достаточно высока и составляет около 69%.
Таким образом, учитывая прогностическую ценность моделей в отношении риска развития вентральных грыж, разработанные статистические модели могут использоваться для формирования среди пациентов группы риска развития вентральных и, в частности, послеоперационных вентральных грыж и формировать тактику ведения лечения основываясь на риске развития заболевания. Разработанные модели можно использовать как для профилактики послеоперационного грыжеобразования, так и для выявления среди населения лиц, предрасположенных к вентральному грыжеобразованию при медико-генетическом консультировании.
