Введение к работе
Актуальность проблемы
Проблема биосинтеза белка - одна из наиболее важных и острых проблем современного естествознания: если в неживой природе принципиально новые пути получения энергии будут найдены благодаря успехам физики элементарных частиц, то в живой природе решение кардинального вопроса управления самой жизнью может быть получено в результате познания химии и биологии белковых тел. В изучении строения и биосинтеза белка, как в фокусе, скрещиваются пути решения важнейших вопросов биологической науки: выяснение законов наследственности и изменчивости, управление ростом и разработка методов лечения многих болезней и т.п.
Современное развитие молекулярной генетики открывает новые возможности оценки работы целого генома - в перспективе изучения и понимания различных аспектов работы кластеров рибосомных генов. В настоящее время активно изучается транскрипция генов рРНК и ее регуляция. Во многих случаях уже идентифицированы различные регуляторные элементы: промоторы, терминаторы, энхансеры - в последовательности ри-босомной ДНК (рДНК), а также соответствующие белки - факторы транскрипции. Однако в современной литературе существует множество противоречивых сведений относительно онтогенетического постоянства функциональной активности рибосомных генов (ФАРГ). По мнению одних ученых, ФАРГ является величиной строго постоянной и не меняется на протяжении всей жизни организма [Wellaver, Р. К, 1979; Gaiperin-Lemaitre, Н., 1980; Xie, W. Q., 1992].
В последнее время появляется все больше данных, подтверждающих возможность изменчивости ФАРГ. Достаточно подробно изучены индивидуальные особенности варьирования числа копий функционально активных рибосомных генов в пределах генома в зависимости от принадлежности к той или иной клеточной популяции или типу ткани [Муха, Д.В. и др., 1995, 2000]; работами целого ряда авторов показана изменчивость функционального состояния рибосомных генов как в ходе клеточных диффе-ренцировок, так и при смене клеточных циклов [Бродский, В.Я., 1991; Во-ронкова, Л.Н., 1993; Цветкова, Т.Г. и др., 1997]. Обнаружены изменения показателя функциональной активности рибосомных генов (ФАРГ) при различных физиологических состояниях организма: голодании, охлаждении, действии на клетки ингибиторов ферментов и при патологии человека различного генеза и локализации [Мамаев, Н.Н., 1997 Hartwell, L., 1995].
Рядом исследований последних лет по изменчивости функциональной активности рибосомных генов человека [Жарская, О.О. и др. 1993; Бочков, Н.П., 2004; Бучинская, Л.Г., 1989] обнаружено, что активность рибосомных цистронов является важным интегральным маркером функцио-
\ '}
нального состояния клеток [Вейко Н.Н., 2000], который может быть использован для решения многих теоретических и практических задач цитологии и медицины.
На сегодняшний день известны данные по работе генома не только человека, но и животных, связанные с функциональной активности рибосомных генов в лимфоцитах периферической крови у разных видов млекопитающих [Стржижевский, А.Д., 1972]. К примеру, достаточно хорошо изучены особенности строения и работы кластеров рибосомных генов у копытных [Стромская, Т.П., 1972], грызунов [Ментейфель, В.М., 1986; Де-рюшева, С.Е., 1997] и др. Согласно имеющимся данным, не вызывает сомнений схожесть функционирования рибосомных генов человека и других представителей класса Млекопитающие как в зависимости от общего функционального состояния клеток, так и при воздействии разного рода экзогенных факторов [Стржижевский, А.Д., 1972; Хабриев, М.У., 2005].
Имеющиеся на сегодняшний день данные о факторах экзогенной природы, оказывающих влияние на изменение экспрессии рибосомных генов в клетках эукариот, без сомнения дают основания считать, что интерес ученых к процессам регуляции активности рибосомных генов весьма высок. Такое интенсивное изучение активности рибосомных генов отнюдь не случайно - оно является архиважным для понимания механизмов синтеза белка в клетке, - одного из главнейших процессов, происходящих во всех живых организмах. Однако проблема изменчивости функциональной активности рибосомных генов при воздействии экзогенных факторов еще далека от решения и остается весьма актуальной.
Говоря о функциональной активности рибосомных генов и их экспрессии, следует сказать, что мы еще очень мало знаем все тонкости этого сложнейшего процесса. Рибосомные гены, кодирующие 18S, 5.8S и 28S рРНК, являются одними из наиболее активно транскрибируемых генов в клетках эукариот. Специфика в том, что их транскрипция происходит в ядрышке главным образом на стадии интерфазы. При вступлении клеток в митоз транскрипция рибосомных генов прекращается и возобновляется только при выходе клеток из митотического цикла. Известно также, что прекращение транскрипции рДНК сопровождается распадом ядрышка и миграций части его компонентов в цитоплазму. Однако, несмотря на результаты исследований ученых, механизмы, регулирующие изменения в транскрипции рибосомных генов, до сих пор остаются невыясненными.
Настоящая работа представляет собой попытку расширения представлений о работе белоксинтезирующего аппарата в аспекте детального рассмотрения вопроса о регуляции активности рибосомных генов в условиях дозированного действия на клетку экзогенных факторов химической природы.
Цель исследования
Изучить изменчивость параметров функциональной активности рибосомных генов лимфоцитов периферической крови человека и животных при дозированном воздействии ряда экзогенных факторов химической природы.
Задачи исследования
Проанализировать специализированные литературные данные на предмет наличия изменений в работе белоксинтезирующего аппарата, прямым или косвенным образом связанных с применением тех или иных экзогенных химических факторов.
На основании рассмотрения структурных и функциональных характеристик ряда экзогенных факторов, вовлеченных в изменение процесса биосинтеза белка, a priori оценить способность их воздействия на транскрипцию рибосомных генов.
Оценить степень интенсивности количественных и качественных параметров воздействия выбранных факторов химической природы: цианко-баламина, фолиевой кислоты, метиландростендиола, нифтолида, метотрекса-та, и доксорубицина на уровень экспрессии рибосомных генов в условиях in vitro на лимфоцитах периферической крови человека.
Исследовать изменения параметров функциональной активности рибосомных генов на интерфазных ядрах лимфоцитов периферической крови кроликов in vivo при дозированном воздействии вышеперечисленных ксенобиотиков.
Научная новизна работы
Впервые проведена комплексная оценка функциональной активности рибосомных генов при воздействии целого ряда экзогенных химических факторов - in vitro, на лимфоцитах периферической крови людей, и in vivo, в организмах экспериментальных кроликов.
Установлено, что в ответ на воздействие на генетический аппарат клеточных популяций людей и животных экзогенных химических факторов в транскрипции рибосомных генов имеют место изменения, носящие как положительный (усиление транскрипции), так и отрицательный (подавление транскрипции) характер.
Впервые выявлены достоверные изменения в работе белоксинтезирующего аппарата лимфоцитов периферической крови как в метафазном, так и в интерфазном состоянии клеточных популяций, что говорит об устойчивом характере изменчивости ФАРГ в течение всего жизненного цикле клетки.
Доказан схожий характер изменения транскрипции генов рДНК в организмах людей и животных при воздействии одних и тех же ксенобиотиков.
Практическая значимость
Полученные экспериментальные данные, свидетельствующие о наличии устойчивых изменений в параметрах функциональной активности рибосомных генов при воздействии на генетический аппарат экзогенных факторов химической природы, позволяют по-новому взглянуть на особенности работы рибосомального аппарата и в новом свете интерпретировать специфику вариативной изменчивости транскрипции рибосомных генов в живом организме при воздействии на него ряда условий внешней среды.
Полученные результаты могут быть с успехом использованы для решения многих теоретических и практических задач в области цитологии и особенно в области медицины как один из факторов успешного лечения человека при обширном спектре заболеваний как ненаследственной, так и наследственной природы, прямым или косвенным образом связанных с изменениями в биосинтезе белка.
Устойчивый характер наблюдаемых изменений в параметрах ФАРГ экспериментальных кроликов дает возможность целенаправленного изменения работы белоксинтезирующего аппарата организма в целях повышения продуктивности пород сельскохозяйственных животных.
Основные положения, выносимые на защиту
При воздействии на генетический аппарат популяций лимфоцитов периферической крови экзогенных химических факторов в клетках наблюдаются статистически значимые изменения параметров функцональной активности рибосомных генов.
При воздействии на генетический аппарат лимфоцитов периферической крови цианкобаламина, метиландростендиола, доксорубицина и метотрексата in vitro наблюдается статистически достоверное увеличение функциональной активности рибосомных генов (t=ll,10 для цианкобаламина при концентрации 4 мкг/мл, 8,05 и 5,24 для метиландростендиола в концентрациях 4 и 40 мкг/мл соответственно, 4,51 для доксорубицина в концентрации 10 мкг/мл и 6,39 для метотрексата в концентрации 400 мкг/мл).
При воздействии на генетический аппарат лимфоцитов периферической крови фолиевой кислоты и нифтолида in vitro наблюдается статистически достоверное уменьшение функциональной активности рибосомных генов (г= 11,64 для фолиевой кислоты в концентрации 400 мкг/мл и 7,83 для нифтолида в концентрации 4 мкг/мл).
Изменения параметров функциональной активности рибосомных генов при воздействии всех вышеперечисленных ксенобиотиков выявлены и в условиях in vivo - при воздействии на лимфоциты периферической крови экспериментальных кроликов. Ответные реакции на воздействие ксено-
биотиков в данном случае проявляются в характере, схожем с таковым у людей in vitro.
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в работу Курской областной медико-генетической консультации, кафедры общей биологии КГУ, кафедры медицинской биологии, генетики и экологии КГМУ, научно-исследовательской лаборатории «Генетика» КГУ.
Апробация и публикации
Результаты работы доложены на конференциях студентов и молодых ученых КГМУ (Курск, 2008, 2009), итоговых научных сессиях КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН, «Университетская наука: Теория, практика, инновации» (Курск, 2008, 2009), юбилейной научно-практической конференции, посвященной 200-летию кафедры биологии имени академика Е.Н. Павловского, «Актуальные вопросы медицинской биологии и паразитологии» (Санкт-Петербург, 2009), международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических и технико-экономических сфер жизни общества» (Курск, 2008, 2009), XXXVII межвузовской студенческой научной конференции факультета ветеринарной медицины Курской ГСХА, «Вклад студенческой науки в решение биологических проблем» (Курск, 2009). По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ.
Структура и объем диссертации
