Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 8
ГЛАВА II. Материал и методы исследования 35
ГЛАВА III. Возможности снижения элиминации генотипов на стадии зрелой сформировавшейся пыльцы 45
1. Повышение жизне- и оплодотворяющей способности пыльцы межвидовых гибридов Fj томатов 45
а)действие ультрафиолета на пыльцу 45
б)действие рентгеновских лучей 47
в)действие физиологически активных веществ 50
2. Действие стимуляторов фертильности пыльцы межвидовых гибридов Pj на спектр генотшшческой изменчивости расщепляющихся популяций 52
3. Действие ингибиторов фертильности пыльцы на спектр генотипической изменчивости в 56
а)маркерный анализ .'... 56
б)анализ изменчивости количественных признаков 59
ГЛАВА IV. Влияние места сформирования пыльцы в прбщеяах пыльника у межвидовых гибридов pj на спектр генотипической изменчивости в р2 67
1. Оценка жизне- и оплодотворяющей способности пыльцы, сформированной в различных частях пыльника .67
2. Анализ популяций пыльцы,выделенных из различных частей пыльника у межвидовых гибридов Pj, на Морфокванте (морфологические и цитохимические характеристики генеративного ядра) 69
3. Влияние места формирования пыльцы в пределах пыльника гибридов Pj на спектр генотипической изменчивости расщепляющихся популяций 72
а)анализ моногибридных соотношений 73
б)анализ частот рекомбинаций между сцепленными и несцепленными маркерными генами .76
в)изменчивость количественных признаков 77
ГЛАВА V. Действие отбора в pj пыльцы, устойчивой к тешератшюму фактору, на спектр генотипичесіюй изменчи вости ВР2 81
"а" Влияние пониженных температур в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок гибридов pj на состав популяций и спектр генотипической изменчивости в?2 83
1. Действие пониженных температур на прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок родительских компонентов гибридов Pj in vitro .85
2. Прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок родительских компонентов гибридов Pj in vivo при оптимальных и пониженных температурах 90
3. Действие пониженных температур на прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок гибридов pj in. vivo 93
4. Влияние отбора в Pj микрогаметофитов, устойчивых к пониженной температуре, на спорофитное поколение Р2 96
а)изменение структуры популяций Р2 96
б)изменение устойчивости расщепляющихся популяций 98
"б" Отбор пыльцы гибридов pj на жароустойчивость. влияние отбора на состав и спектр генотипической изменчивости в р2 104
I, Определение длительности и величины температурного воздействия на пыльцу гибридов Pj . 105
2. Реакция пыльцы различных межвидовых гибридов Pj на действие высоких температур 108
3. Влияние отбора в Pj пыльцы, устойчивой к высоким температурам, на состав расщепляющихся популяций .112
4. Влияние отбора в Pj пыльцы, устойчивой к высоким температурам, на спектр генотипической изменчивости расщепляющихся популяций . .116
ГЛАВА VI. Оботдение полученных результатов
Выводы и ржомещащи . 128
Список цитируемой литературы
- Повышение жизне- и оплодотворяющей способности пыльцы межвидовых гибридов Fj томатов
- Оценка жизне- и оплодотворяющей способности пыльцы, сформированной в различных частях пыльника
- Влияние пониженных температур в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок гибридов pj на состав популяций и спектр генотипической изменчивости в?2
- Действие пониженных температур на прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок гибридов pj in. vivo
Введение к работе
Всесторонняя интенсификация сельскохозяйственного производства является основой для реализации Продовольственной программы; утвержденной майским (1982 г,) Пленумом ЦК КПСС, В стратегии многофакторной, всесторонней интенсификации сельского хозяйства в настоящее время центральное место отводят адаптивной селекции растений. Следует отметить, что селекция растений всегда была адаптивной в том смысле, что человек стремился приспособить культивируемые виды к различным условиям внешней среды. Все же стратегия адаптивной селекции на современном этапе имеет качественно новый смысл. ЕЕ особенностями является понимание таких вопросов как необходимость сочетания потенциальной продуктивности и экологической устойчивости, широкого вовлечения в селекционный процесс диких видов и полукультурных разновидностей, представление о трудностях увеличения доступной генотипической изменчивости ( Жученко,1983 ).
Многочисленными исследованиями показано, что дикие виды и полукультурные разновидности растений являются наиболее богатыми генетическими источниками устойчивости к абиотическим и биотическим факторам среды. При межвидовой гибридизации могут появляться новые адаптивные комбинации генов, ценные для селекции. Однако, в настоящее время выявлять ценные формы в потомствах межвидовых гибридов селекционерам удается лишь при изучении большого числа поколений.
Одними из основных причин, препятствующих доступу к "залежам наследственности", считают ингибирование процессов генетической рекомбинации и селективную элиминацию рекомбинантных гамет и зигот. Учитывая это, вовлечение в селекционный процесс зародышевой плазмы диких видов требует разработки принципиально новых методов селекции, основывающихся на индуцировании генетической рекомбинации с целью увеличения спектра генотипической изменчивости, а также со - 6 хранении рекомбинантных гамет и зигот (методы гаметной и зиготной селекции) (Жученко и др.,1983).
Известно (Купцов, 1979,1981; Sarigoria, 1977), что естественный отбор может действовать на любой стадии жизненного цикла организма. В силу этого, гибель "нетрадиционных" рекомбинантных генотипов, а равно и их неспособность конкурировать с "типичными" гаметами, зиготами, могут наблюдаться на различных этапах онтогенеза. Особое внимание в данном случае следует уделять репродуктивным фазам развития растения, как правило, остающимся вне поля зрения селекционера. В настоящее время все процессы, происходящие на этапах репродуктивного развития, должным образом не контролируются при селекционной работе, хотя им принадлежит важная роль в определении спектра доступной генотипической изменчивости.
Одним из предполагаемых "фильтров", генотипы на репродуктивной стадии развития, являлась пониженная фертильность пыльцы межвидовых гибридов томатов (Кученко, 1980). Таким образом, исследование вопроса о возможности уменьшения элиминации "нетрадиционных" генотипов на стадии зрелой пыльцы с целью увеличения потенциала доступной селекционеру генотипической изменчивости при межвидовой гибридизации представляет большой теоретический и практический интерес.
Наряду с сохранением элиминирующих в обычных условиях генотипов в стратегии адаптивной селекции немаловажная роль отводится отбору на гаплоидном уровне. Особенно важным представляется использование отбора в галоидной фазе развития растения (на стадии зрелой сформировавшейся пыльцы, в период ее прорастания и роста пыльцевых трубок) для изменения качества (устойчивости к абиотическим стрессам) спорофитного поколения. Принципиальная возможность проведения такого отбора основывается на предположении о выраженности части
Учитывая вышесказанное, воздействие каким-либо стрессом на гаметы гибридного организма, гетерогенного по устойчивости галоидных генотипов к используемому фактору, могло бы повышать устойчивость расщепляющихся популяций, что в значительной мере способствовало бы ускорению селекционного процесса. Наличие генетической изменчивости по признакам устойчивости к абиотическим факторам среды на стадии зрелой пыльцы, в период ее прорастания и роста пыльцевых трубок у различных культур (Панин, I965;Marcucci, Visser.Van Tuyi, 1982), в том числе у томата (Тараканов и др., 1978; Zamir,TanJcsiey, Jones, 1981), связь в проявлении гаметофитных и спорофитных признаков, а также относительная легкость манипулирования таким важным селекционным материалом, каким являются пыльцевые зерна растений, создают предпосылки для успешного решения рассматриваемого вопроса.
Повышение жизне- и оплодотворяющей способности пыльцы межвидовых гибридов Fj томатов
Литературные данные указывают на то, что фактически наблюдаемый спектр генотипической изменчивости значительно уже потенциального в силу канализированноети процесса рекомбинаций и селективной элиминации рекомбинантов. Известно ( Hick, 1963, 1969; Купцов, 1979; Жученко, 1980 и др.), что элиминация генотипов происходит на различных этапах онтогенеза, в том числе на гапловднои фазе развития растения. При этом, нереализовавшиеся в обычных условиях гаметы могут нести адаптивно-ценные блоки генов и представлять определенный интерес в селекции.
К числу причин, ограничивающих потенциал изменчивости на стадии развития мужского гаметофита, наряду с дифференциальной скоростью прорастания пыльцевых зерен и.ростом пыльцевых трубок, относят пониженную фертильность пыльцы. При этом полагают (Жученко. и др. 1979, 1980), что гаметы с нетрадиционным набором генов имеют невысокую жизнеспособность, являющуюся причиной их элиминации. Следовательно, стимуляция фертильности пыльцы могла бы способствовать более широкому вовлечению таких генотипов в процесс оплодотворения.
В данной главе рассматривается возможность расширения спектра генотипической изменчивости в расщепляющихся популяциях за счет стимуляции фертильности пыльцы межвидовых гибридов Рт томатов.
I. Повышение жизне- и оплодотворяющей способности пыльцы межвидовых гибридов Pj а) действие ультрафиолета на пыльцу В качестве предполагаемых стимуляторов фертильности пыльцы бы ли выбраны: ультрафиолетовые лучи, рентгеновские лучи, физиологически активные вещества.
Б литературном обзоре отмечалось, что облучение пыльцы различных культур УФ-ом в небольших дозах повышает активность полифенол-оксидазы, ускоряет прорастание in vitro и in vivo, улучшает скрещиваемость при отдаленной гибридизации. Учитывая это, малые дозы ультрафиолета испытывали на способность стимулировать жизнеспособность пыльцы межвидовых томатов, характеризующихся пониженной фер-тильностыо.
Известно, что ультрафиолетовый спектр в зависимости от его действия на биологические системы делится на 3 района ( stadier, иъег, 1942; Swanson,stadier, 1955). Исходя из конкретной задачи исследования, УФ не должен индуцировать ядерных изменений, но вместе с тем, должен быть эффективным в отношении физиологических характеристик объекта. Используемое в эксперименте УФ излучение с длиной волны, равной 0.33 мкМ, отвечает этим требованиям.
Из анализа действия УФ-а на жизнеспособность пыльцы межвидовых гибридов томатов следует, что в вариантах с экспозицией облучения 0,5 и I мин., в зависимости от гибрида, наблюдалось стимулирование прорастания пыльцы in vitro. При дальнейшем увеличении дозы жизнеспособность постепенно снижалась и достигала минимума при облучении микроспор в течение 30 минут (рис.1).
Интересно отметить, что обработка влияла не только на прорастание пыльцы, но и на рост пыльцевых трубок. При этом, максимум распределения количества пыльцевых трубок по их длине смещался в сторону увеличения длины пыльцевых трубок в вариантах с большей экспозицией.
Поскольку метод проращивания на искусственной питательной среде недостаточно эффективен для оценки оплодотворяющей способности пыльцы, был учтен такой показатель как среднее число семян в одном плоде. Между данным показателем и оплодотворяющей способностью пыльцы имеется прямая зависимость: чем выше фертильность, тем больше число образовавшихся семян.
Данные о величине осемененности плодов гибридов Fj в различных вариантах обработки пыльцы представлены в таблице 3.І. В опыте использовали дозы УФ а как максимально стимулирующие, так и ингиби-рующие жизнеспособность пыльцы in vitro на питательной среде.
Как это видно из табл.3.І, в вариантах обработки пыльцы УФ-ом в течение I мин. во всех комбинациях скрещивания наблюдается увеличение числа семян в плоде. Более длительное воздействие (30 мин.) приводит к значительному снижению осемененности плодов.
Обращает на себя внимание тот факт, что наибольшие различия между опытными вариантами и контролем (пыльца без обработки) проявляются при проведении опылений в условиях теплицы. По-видимому, это объясняется тем, что фертильность пыльцы контрольных растений в осенне-зимний период в теплице значительно ниже, чем в поле. В этом случае УФ лучи эффективнее интенсифицируют окислительные процессы и тем самым в большей степени повышают фертильность.
Таким образом, облучение пыльцы УФ-ом (Я= 0.33 мкМ) в течение 0.5-1 мин. стимулирует жизнеспособность и активизирует ее оплодотворяющую способность, тогда как 30-и минутное облучение приводит к значительному снижению жизне- и оплодотворяющей способности пыльцы.
Оценка жизне- и оплодотворяющей способности пыльцы, сформированной в различных частях пыльника
В предыдущей главе отмечалось, что между оплодотворяющей способностью пыльцы и осеменненностью плодов тлеется прямая зависимость. Поэтому, среднее число семян в одном плоде можно считать достаточно объективным показателем при оценке качества пыльцы.
Условия проведения эксперимента требовали, чтобы при наличии созревших и пригодных для оплодотворения пыльцевых зерен, пыльцевые мешки еще не были вскрыты. По данным Даскалова и др. (1978), пыльца томатов высыпается из пыльников через 24-48 часов после раскрытия цветка и к этому моменту обладает наиболее высокой жизне-и оплодотворяющей способностью. Учитывая это, выделение пыльцы из цветков проводили не позднее, чем через 24 часа после раскрытия лепестков венчика.
В эксперименте оценивали качество пыльцы межвидовых гибридов FT различных комбинаций скрещивания.
Примечание. " - различия между вариантами I и 2,3,4 существенны при 5/ь-ном уровне значимости; ш - 1%; 555 - 0,1$.
Анализ осемененности плодов как в FT, так и в BCj, полученных от опылешш пыльцой, выделенной из различных частей пыльника гибридного растения, показан, что место формирования пыльцы заметно влияло на ее оплодотворяющую способность. Как правило, она была выше в средней или нижней частях пыльника. Пыльца из верхушки пыльника при нанесении на рыльце обеспечивала образование наименьшего, по сравнению с другими вариантами, числа семян во всех изученных комбинациях скрещивания (табл.4.1).
Полученные данные согласуются с уже опубликованными Кисимовой (1966), которая отмечала, что в нижней части пыльника содержится наибольшее число жизнеспособных пыльцевых зерен, а в верхней -наименьшее.
Помимо оценки оплодотворяющей способности, у пыльцы межвидовых гибридов Ру исследуемых вариантов опыта определяли жизнеспособность. С втой целью ее высевали на искусственную питательную среду. Проращивание in vitro показало, что образцы пыльцы, выделенные из верхушки пыльника, характеризовались значительно меньшим числом жизнеспособных пыльцевых зерен по сравнению с двумя другими вариантами.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что, как жизнеспособность, так и оплодотворяющая способность пыльцы зависят от места ее формирования. При этом, наибольшая стерилизация пыльцевых зерен наблюдается в верхней части пыльника. Метод анализа пыльцы на Морфокванте, по сравнению с существующими, позволяет значительно ускорить и улучшить качество определения различных морфологических и цитохимических характеристик пыльцевого зерна. Указанный метод был использован в эксперименте для оценки изменчивости ряда параметров ядер вегетативной и генеративной клеток пыльцевых зерен гибридов в зависимости от их локализации в пыльнике. Исследуемыми характеристиками являлись: периметр, площадь, диаметр, ширина ядер и содержание ДНК в ядрах в относительных единицах.
Рассмотрим изменчивость признаков генеративного ядра в популяциях пыльцы из различных частей пыльника гибрида Fj Mo 628 х Ъ.esc.var.racemigerum.
Согласно данным, приведенным в табл.4.2, формирование пыльцы в верхней части пыльника по сравнению с нижней, приводит к значимому увеличению диаметра, площади и периметра генеративного ядра. Причем, по этим же признакам наблюдается и увеличение дисперсий.
Гистограммы распределения генеративных ядер по площади и периметру хорошо иллюстрируют более широкий спектр изменчивости по этим.признакам в популяциях пыльцы из верхней части пыльника (рис.6,7). Из рис.6,7 видно, что в первом варианте частоты ядер в классах с наибольшими значениями исследуемых параметров существенно увеличиваются.
Таким образом, результаты анализа на Морфокванте показывают, что популяции пыльцы из различных частей пыльника характеризуются неодинаковой изменчивостью по ряду морфологических признаков генеративного -ядра.
Влияние пониженных температур в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок гибридов pj на состав популяций и спектр генотипической изменчивости в?2
Внешние условия, особенно температура, оказывают существенное влияние на прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок. Обычно, высокая температура ускоряет, а низкая, наоборот, замедляет эти процессы (Поддубная-Арнольди, 1976). Такая же зависимость роста пыльцевых трубок от температуры обнаружена и у томатов (Smith,Cochran, 1935).
Наилучшими температурными условиями для прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок томатов являются 28-30С. Однако, она способна прорастать и расти при более низких температурах (Scariat, 1978).
Исходя из тлеющихся сведении, микрогаметофит томатов характеризуется неоднозначной реакцией на действие низких положительных температур. На это указывает наличие в генофонде, наряду с нехолодостойкими, форм, способных завязывать плоды при пониженных температурах, так как известно, что плодообразование зависит не только от пыльцевой продуктивности растений, но и от успешного протекания процессов опыления-оплодотворения. Следовательно, формы, обильно завязывающие плоды в неблагоприятных условиях среды, за исключением партенокарпических, должны характеризоваться хорошим прорастанием пыльцы на рыльце и ростом пыльцевых трубок в ткани столбика.
Согласно Даскалову и др. (1978), минимальной температурой для цветения и плодоношения томатов является 15С. При температуре ниже 15С цветение прекращается. Однако, в настоящее время уже созданы сорта отличающиеся.хорошим плодообразованием ниже границы температурного минимума. По данным Маслова (1947), Брежнева (1955),
Юрьевой (1973), высокой холодостойкостью в период плодообразова-ния характеризуются сорта Грунтовый грибовский, Крайний север, Rocket,Campbell И др. Philouse,Maisonneuve (1978) отобрали образцы, которые обеспечивают образование большого количества высококачественной пыльцы и характеризуются высокой урожайностью в холодном помещении. Как показали Sooat,Rick (1957), пыльца одних сортов томатов обеспечивает завязывание плодов в более широких температурных пределах, чем других.
Значительный интерес как источники зародышевой плазмы в отношении устойчивости микрогаметофитного поколения к пониженным температурам могут представлять некоторые дикие виды полукультурные разновидности рода Lycopersicon. Тогггп.На меньшую чувствительность гаметофитов ряда диких видов к действию низких положительных температур по сравнению с большинством сортов может указывать тот факт, что родиной многих из них являются горные, а часто и высокогорные районы с прохладным климатом. В частности, по данным Геор-гиевой (1976) и др., цветение и плодообразование у L.hirsutum Humb.et Bonpi.произрастающего на высокогорных плато Перу, продолжается до заморозков. РІедавно (Zamir,Tanksley, Jones, 1981), В результате проведенных экспериментальных исследований было действительно установлено, что прорастание пыльцы культурного томата L. escuientum Мііі.ингибируется пониженной температурой значительно сильнее, чем L.hirsutum Humb.et Bonpl.
Наблюдаемая в пределах рода Lycopersicon Tourn.изменчивость ПО прорастанию пыльцы и росту пыльцевых трубок при пониженных температурах дает основание для проведения отбора на данных фазах развития мужского гаметофита у гетерозиготных по этим признакам организмов. При этом, знание реакции пыльцы родительских компонентов на действие температуры может быть использовано для изменения в_ потомстве гибридов Pj числа растений с признаками исходных форм (Жученко, 1973).
Кроме того, отбор микрогаметофитов, устойчивых к какому-либо экстремальному фактору, в частности к температурам, может обеспечивать появление спорофитов со сходной устойчивостью. Этот вывод вытекает из предположения, что часть спорофитного генома экспрес-сируется в гаметофитной части жизненного цикла растения (Mulcahy, 1979).
На перспективность отбора пыльцы по устойчивости к пониженной температуре в период прорастания на рыльце и роста пыльцевых трубок в ткани столбика указывал Hogenboom (1978). Высказывая это мнение, автор исходил из предположения, что рост пыльцевой трубки в стрессовых условиях кореллирует с ростом растения.
Таким образом, отбор в P-j- микрогаметофитов, устойчивых к низким положителышм температурам-, может оказывать действие не только на структуру расщепляющейся популяции Р2» но и на качество спорофитного поколения, выражающееся в устойчивости растений к данному фактору отбора.
Действие пониженных температур на прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок гибридов pj in. vivo
Более высокую скорость роста пыльцевых трубок мутантного образца по сравнению с диким видом при 22/28С подтверждает также следующий опыт. Плоды контрольного варианта, образовавшиеся от опыления смесью пыльцы, разрезали на две части. В потомстве семян, выделенной из каждой части плода, определяли соотношение проростков мутантного и дикого типов. Такой подход основан на известном факте, что оплодотворение яйцеклеток в.завязях томатов происходит начиная с верхней (цветковой) части. И, следовательно, семена из этой части плода образуются от опыления пыльцой с быстрорастущими трубками (Kedar,Verkerk, 1968, Аяпатьев, Юрьева, 1970; Аяпатьев и др., 1975).
Согласно данным, представленным в табл.5.4, в оплодотворении яйцеклеток верхней части завязи участвовали, главным образом, гаметы Мо 628. Пыльцевые трубки L.hirsutum не успевали дорастать до зародышевого мешка. И, лишь позднее, по-видимому, когда число быстрорастущих микроспор мутанта, в нанесенной на рыльце смеси пыльцы, относительно уменьшилось, гаметы дикого вида могли принимать участие в оплодотворении. Об этом свидетельствует увеличение частоты проростков типа L.hirsutum в потомстве семян из нижней части завязи по сравнению с верхней.
Таким образом, прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок в варианте с нормальной температурой у Мо 628 проходят быстрее. Зти данные не противоречат полученным на основе анализа in vitrdvue также отмеч&тюсь, что скорость прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок культурного вида (мутантный образец Мо 628) при 28С превышали аналогичные показатели L.hirsutum var.glabraturn.
Как видно из табл.5.3, пыльца L.hirsutum в период прорастания и роста пыльцевых трубок была менее чувствительной к действию пониженных температур по сравнешш с Мо 628. На это указывает значительное преобладание в потомстве, полученном от опыления при t 8/12С смесью пыльцы, растений, имеющих дикий фенотип. Если в оптимальных температурных условиях (22/28С) число растений дикого типа не превышало 20-25$, то в опытных вариантах (8/12С) - достигало 60S. Естественно, что частота форм L.hirsutum - варьировала в зависимости от жизнеспособности пыльцы компонентов, составляющих смесь.
Таким образом, использование низкой температуры позволило четко дифференцировать исследуемые образцы по устойчивости мужских гаметошитов к данному фактору. Вместе с тем,in vitro на искусственной питательной среде различий в росте пыльцевых трубок мутантыой формы и дикого віща при ЮС не обнаруживалось. По-видимому, в данном случае следует согласиться с мнением Поддубной-Лрнольди (1976) о том, что характер роста пыльцевых трубок в тканях пестика и вне его может отличаться.
На основе полученных данных можно сделать вывод о том, что в результате воздействия низких температур на гаметофитном уровне происходил ди ференциалышй отбор. При этом, преимущество в реализации получали гаметы L.hirsutum var.glabraturn.
Необходимо отметить, что отбор мог происходить не только в период прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок, но и на более поздних стадиях, таких как оплодотворение и ранняя зигота. Однако, элшлинация на стадии зиготы, вероятно, не является основным фактором, влияющим на конечный результат. Согласно условиям проведения данного эксперимента, время действия селективного фактора было ограничено 26 часами начиная с момента опыления. Вместе с тем, известно (Charlea,Harris,1972)» что при ЮС пыльцевые зерна томатов образуют трубки, которые проникают в зародышевый мешок только через 84 часа. Отсюда следует, что наиболее длительному воздействию пониженными температурами в эксперименте подвергались стадии прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок, и, очевидно, отбор происходил на этих этапах развития мужского гаметофита.
