Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Биотехнологические принципы получения препаратов цитомединов и их биологическая активность 10
1.2. Регуляторные пептиды и система биорегуляции 24
1.3. Заключение 32
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 34
2.1. Материалы и методы исследования 34
2.2. Результаты собственных исследований 42
2.2.1. Биохимическая характеристика и фракционный состав экстракта из ткани простаты быков 42
2.2.2. Влияние отдельных фракций в составе экстракта из ткани простаты быков на содержание эндогенного тестостерона в периферической крови мышей 58
2.2.3. Влияние отдельных фракций в составе экстракта из ткани простаты быков на рост шерсти подопытных животных 70
2.2.4. Влияние отдельных фракций в составе экстракта из ткани простаты быков на сократительную активность гладкой мускулатуры кишки 77
2.3. Перспектива разработки новых препаратов для нужд медицины и животноводства 88
2.3.1. Раствор для внутримышечного введения «Простакор» 90
2.3.2 Суппозитории «Простакор» 96
2.3.3 Суппозитории «Интерпрост» 102
2.3.4 Оценка возможности разработки новых препаратов на основе отдельных фракций экстракта простаты для нужд медицины и животноводства 107
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 108
ВЫВОДЫ 119
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 121
- Биотехнологические принципы получения препаратов цитомединов и их биологическая активность
- Регуляторные пептиды и система биорегуляции
- Материалы и методы исследования
Введение к работе
Актуальность проблемы. Помимо микроорганизмов, животных и растительных клеток биотехнология использует органы и ткани человека и животных для получения большой группы лечебных препаратов – цитомединов (Яковлев Г. М. и др., 1990; Воробьев А. А., 2004).
Одним из них является предстательная железа крупного рогатого скота (КРС), лиофилизированный очищенный экстракт тканей которой в течение последних 20 лет успешно используется для получения различных лекарственных форм препаратов, предназначенных для лечения воспалительных заболеваний предстательной железы у человека (Яковлев Г. М. и др., 1992).
Как показано предыдущими исследованиями (Хавинсон В. Х. и др., 1997) экстракт из ткани простаты представляет собой сложный комплекс биологически активных молекул различной природы, которым свойственны различная функциональная направленность и сложный, до конца не изученный, механизм действия.
Исходя из многогранности функций, выполняемых предстательной железой в организме можно полагать, что далеко не все функциональные особенности действия ее экстракта изучены и используются. Применение в исследованиях новых технологических и методических подходов, новых функциональных тестов может выявить перспективу получения не одного, а нескольких препаратов с индивидуальными свойствами с возможным их использованием не только в медицине, но и животноводстве.
Цель исследования. Физико-химическая и биологическая характеристика компонентов в составе экстракта из ткани простаты КРС и оценка возможности получения на их основе новых лекарственных препаратов.
Задачи исследования:
-
Методом жидкостной гель-хроматографии исследовать фракционный состав экстракта из ткани простаты КРС, дать физико-химическую и биохимическую характеристику фракций.
-
Изучить особенности биологического действия отдельных фракций экстракта простаты с использованием различных функциональных тестов на: содержание «свободного» тестостерона в периферической крови, рост шерсти у экспериментальных животных, сократительную активность гладкой мускулатуры, артериальное давление.
-
Показать технологическую возможность получения отдельных индивидуальных препаратов с определенной биологической активностью из одного и того же сырья – очищенного экстракта простаты.
-
Установить возможность исключения из технологии энергоемкий и дорогостоящий процесс лиофилизации.
5. Разработать основы технологии получения новых лекарственных
форм и новых препаратов из экстракта простаты для возможного применения
в медицинской и сельскохозяйственной практике.
Научная новизна. Впервые показана различная функциональная активность нуклеиново-пептидных фракций по физико-химическим характеристикам.
Обнаружены стабилизирующие свойства мальтозы на биологическую активность очищенного экстракта, позволяющие исключить из технологического процесса его лиофилизацию. Новизна технологического решения оформлена в Заявке на патентование (№ 2004112873/15, положительное решение, 2006).
Впервые в экспериментах на белых мышах выявлено, что однократное парентеральное введение экстракта приводит к волновому повышению содержания «свободного» несвязанного тестостерона в периферической крови: через 3, 6 и 72 часа. Выделены и охарактеризованы по физико-химическим и биологическим свойствам фракции, отвечающие за этот эффект, перспективные для разработки препарата, регулирующего уровень «свободного» тестостерона в крови.
Разработан количественный метод контроля специфической биологический активности в тесте повышения уровня эндогенного тестостерона в периферической крови мышей, пригодный для характеристики качества любых лекарственных препаратов, приготовленных на основе экстракта простаты (патент РФ № 2000113922 «Способ определения биологической активности препаратов из ткани предстательной железы», 2002 г).
Впервые на экспериментальных животных показано, что многократное введение экстракта стимулирует у них рост шерсти. Выделены и охарактеризованы по физико-химическим и биохимическим фракции, отвечающие за этот эффект. Определены дозы при различных способах введения.
Выделены и охарактеризованы по физико-химическим и биохимическим свойствам фракции, оказывающие влияние на сократительную способность гладкой мускулатуры и артериальное давление, связанные с присутствием окситоциноподобных пептидов.
Разработаны 3 новых лечебных препарат, содержащие а качестве действующего начала очищенный жидкий очищенный экстракт простаты, новизна которых защищена патентами РФ (№ 2152204, 2002; № 2160114, 2000 и положительным решением на выдачу патента).
Практическая значимость и реализация результатов исследования.
Показано, что очищенный концентрированный экстракт простаты может служить полифункциональным безотходным сырьем для получения новых препаратов с направленными свойствами.
Установлено, что для получения высокоактивного экстракта целесообразно использовать предстательную железу от забоя КРС, проведенного в апреле-августе месяцах.
Обоснована необходимость использования жидких полуфабрикатов для разработки новых лекарственных форм, так как процесс лиофильного высушивания существенно изменяет их количественный и качественный состав.
Предложена жидкая лекарственная форма «Простакор раствор для внутримышечного введения», в состав которой в качестве стабилизирующего агента введена мальтоза. Отработаны доза стабилизатора, модицирова-ны методы ее качественного и количественного контроля в препарате.
Разработаны биотехнологические основы получения и контроля трех новых лечебных препаратов, содержащих жидкий экстракт из ткани простаты, для нужд здравоохранения.
Разработан и включен в НТД метод количественного контроля биологической активности в тесте повышения уровня «свободного» тестостерона в крови мышей-самцов, пригодный для контроля качества различных лекарственных форм препаратов на основе экстракта простаты.
Дано научно-методическое обоснование возможности использования отдельных фракций экстракта простаты КРС в производстве препаратов для нужд сельского хозяйства. Образцы апробированы с положительным результатом на быках–производителях – донорах спермы для искусственного осеменения и в звероводческом хозяйстве на черно-бурых лисицах.
Результаты проведенных исследований оформлены в виде научно-технической документации на субстанцию «Экстракт из ткани простаты крупного рогатого скота очищенный концентрированный жидкий», «Проста-кор раствор для внутримышечного введения», суппозитории «Простакор» и «Интерпрост».
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции, посвященной: 95-летию НИИВС им. И.И. Мечникова (Уфа, 2000 г), Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной: 100-летию со дня основания филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ (Уфа, 2005 г.), расширенном заседании общества морфологов при ФГОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» (13 мая 2006 г.).
Диссертация апробирована на заседании ученого совета НИИВС им. И.И. Мечникова филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ (протокол № 2 от 28 марта 2000 года).
Публикации. Основные положения диссертационной работы изложены в 5 научных статьях, опубликованных в материалах научно-практических конференций, тематических сборниках вузов. По материалам диссертации получено 3 патента РФ и одно положительное решение по Заявке на патентование.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ___ страницах компьютерного текста, состоит из разделов «Общая характеристика работы», «Обзор литературы», «Собственные исследования», «Обсуждение полученных результатов», «Выводы», «Библиографический список».
Биотехнологические принципы получения препаратов цитомединов и их биологическая активность
Биотехнология представляет собой область знаний, которая возникла и оформилась на стыке микробиологии, молекулярной биологии, генетической инженерии, иммунологии, химической технологии и ряда других наук. Ее рождение обусловлено потребностями общества в новых, более дешевых продуктах для народного хозяйства, в том числе для медицины и ветеринарии, а также принципиально новых технологиях (Воробьев А. А., 2004).
Помимо микроорганизмов, животных и растительных клеток биотехнология в качестве биологических объектов использует органы и ткани человека и животных для получения большой группы лечебных препаратов -цитомединов (Яковлев Г. М. и др., 1999; Воробьев А. А., 2004).
Метод выделения цитомединов был разработан В. Г. Морозовым и В. X. Хавинсоном (В. Г. Морозов, В. Н. Хавинсон, 1974; 1978). Принцип его заключается в следующем: после измельчения исследуемые ткани высушиваются ацетоном, после чего подвергаются экстракции с помощью уксусной кислоты; после центрифугирования осадок удаляется, а к надосадочной жидкости добавляется ацетон и в ряде случаев дополнительно цинк; полученный осадок и представляет собой цитомедин.
Первые детальные исследования цитомединов были осуществлены на препаратах, выделенных из вилочковой железы и эпифиза мозга крупного рогатого скота и получивших наименование «тималин» и эпиталамин» (В. Г. Морозов, В. Н. Хавинсон, 1981).
Установлено, что тималин обладает не только специфическим действием, модулируя реакции клеточного и гуморального иммунитета, но и одновременно осуществляет неспецифические функции. Он изменяет фагоцитарную активность лейкоцитов, оказывает влияние на сосудисто-тромбоцитарный гомеостаз, свертываемость крови и фибринолиз у крыс (Хышова Р. Д., 1982; Хышова Р. Д., 1983; Кузник Б. И. и др., 1989) и у кошек (Кузник Б. И. и др., 1981).
Эпиталамин обладает антигонадотропным эффектом, восстанавливает центральную регуляцию репродуктивной системы на уровне гипоталамуса, нормализует цикличность выделения фолликулостимулирующего и лютеи-низирующего гормонов и понижает содержание сахара в крови при гипергликемии (Карпов Е. С. и др., 1985). Этот цитомедин нормализует реакции клеточного иммунитета, ускоряет отторжение аллогенных трансплантатов, стимулирует противоопухолевую и противоинфекционную резистентность, повышает показатели фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови и титра антител (AT) при иммунизации животных эритроцитами барана и Vi-антигеном сальмонелл. (Косых В. А., Козлова Ю. Г., 1986; Сле-пушкин В. Д. и др., 1990). Установлено, что эпиталамин повышает также чувствительность гипоталамуса к эндогенным регулирующим воздействиям, способствуя, таким образом, восстановлению гормональной регуляции (Яковлев Г. М. и др., 1990).
Вскоре цитомедины были выделены и из сосудистой стенки (Кузник Б. И., Иванов В. Н., Хавинсон В. X. и др., 1974). Под их влиянием нормализовались обменные процессы в сосудах, а также предотвращалось развитие атеросклероза (Кузник Б. И., Морозов В. Г., Хавинсон В. X., 1998).
В дальнейшем цитомедины были получены из первичных (сумка Фабрициуса, костный мозг) и вторичных (лимфатические узлы различной локализации, лимфоэпителиальные образования, селезенка) органов иммунной системы (Морозов В. Г., Хавинсон В. X., Писарев О. А., 1977; Морозов В. Г., Хавинсон В. X., 1981; Кузник Б. И., Степанов А. В., Цыбиков Н. Н., 1987; Кузник Б. И., Степанов А. В., Цыбиков Н. Н., 1988; Жгенти Г. Р., 1993).
С помощью гель-хроматографии из них были выделены биорегуляторы, которые в эксперименте на животных кроме воздействий на ЦНС оказывали выраженное влияние на защитные функции организма, состояние гемопоэза и репродуктивной системы (Сепиашвили Р. И., 2002).
Регуляторные пептиды и система биорегуляции
Низкомолекулярные пептиды являются основной составной частью цитомединов и играют большую роль в реализации сложной системы биорегуляции, осуществляя ее на разных уровнях, включая нейроэндокринные, иммунологические, клеточные, молекулярные (Менцлер Д., 1980; Яковлев Г. М. и др., 1992; Михайлова А. А., 2001 ; Сепиашвили Р. И., 2003). Они представляют собой олигомерные молекулы, состоящие из аминокислот, соединенных между собой пептидными (амидными) связями (Терней А., 1980; Алов И. А и др., 1996). Возникшие в процессе эволюции как первые координаторы жизнедеятельности, пептиды стали носителями и передатчиками межклеточной информации (Ашмарин И. П., 82; Ашмарин И. П., Обухова М. Д., 1986; Rothe Y. et al, 1985).
В организме пептиды образуются в результате рибосомального и нерибосомального синтезов. В процессе рибосомального синтеза пептида в системе полирибосом отдельные рибосомы движутся по пронизывающей их нити информационной рибонуклеиновой кислоты (иРНК), «считывая» заложенную в ней информацию, и соответствующим образом укладывая аминокислоты. Рибосома, завершившая образование полипептидной цепи, освобождает ее, а сама сходит с цепи иРНК (Алов И. А и др., 1966). При не-рибосомальном синтезе пептиды получаются путем расщепления белков под действием эндонуклеаз, находящихся в лизосомах и эндосомах клеток до 15-20 мерных пептидов (Дамбаева С. В. и др., 2002). При этом происходит денатурация белка, при которой вся структурная конформация белка кроме первичной пептидной разрушается, сопровождаясь частичной или полной потерей его специфической биологической активности (Терней А., 1980).
Несмотря на огромное разнообразие пептидов в их молекуле, за исключением, пожалуй, самых коротких, можно выделить активные и неактивные зоны. Пептидные рецепторы располагаются на клеточных мембранах. Пептиды плохо проходят гистогематические барьеры и, как правило, независимо действуют на центральные и периферические механизмы регуляции (с. 10) (Кузник Б. И., Морозов В. Г., Хавинсон В. X., 1998).
Выяснение зависимости между химической структурой пептида и его биологической активностью является одним из наиболее важных направлений, позволяющих установить конкретные молекулярные механизмы регуляции гомеостаза, более глубоко изучить физиологические процессы и соответственно разработать новые подходы к лечению заболеваний животных и человека (Яковлев Г. М. и др., 1990; Харкевич Д. А., 1996).
По принципу действия пептиды делятся на следующие группы: регуля-торные пептиды, мембраноактивные пептиды, экспонируемые пептиды и пептиды, взаимодействующие с ДНК и РНК (Иванов В. П., 2001; Wienake Р., 1999; Yang Q. et al., 1999; Ходяков А. В., 2001; Jnnes К. Е., Byers Т. Е., 2001).
В последнее время все большее внимание привлекают регуляторные пептиды (РП). Полагают, что они относятся к медиаторному звену системы биорегуляции и содержатся в различных тканях, принимая участие в механизме межгенных взаимодействий на уровне популяций специализированных клеток (Морозов В. Г. и др., 1982; Морозов В. Г. и др., 1984; Яковлев Г. М. и др., 1990). Высказывается предположение, что эти вещества переносят от клетки к клетке определенную информацию, закодированную с помощью аминокислотной последовательности (Мирошниченко И. В. и др., 1997). Установлено, что РП обладают широким спектром биологической активности, оказывая выраженное иммуномодулирующее и регенераторное воздействие, что говорит о важном значении этих молекул в координации функций многоклеточного организма (Яковлев Г. М. и др., 1992). Многие из РП органоспецифичны (Морозов В. Г, Хавинсон В. X., 1983). Однако некоторые РП выделяются клетками одной определенной ткани, а регулируют обмен веществ в клетках - мишенях, принадлежащих другой ткани. Предполагают, что связывание этих РП с рецепто рами изменяет структуру (кон формацию) последних, и это событие инициирует цепь реакций, приводящих к биологическому ответу на действие регуляторного пептида (Менцлер Д., 1980; Poulain D.A., Wakerley J. В., 1982; Fuchs A. R. et al., 1982; Hausmann H., etal., 1995).
Материалы и методы исследования
Работа выполнена в НИИВС им. И.И. Мечникова филиала ФГУП «НПО «Микроген» «Иммунопрепарат» (г. Уфа) в лаборатории препаратов крови и на кафедре фармакологии - 2 «Башкирский государственный медицинский университет».
Объектом изучения являлись парные образцы (п=14) сухих и жидких г экстрактов из ткани простаты быков с содержанием от 4 до 6 мг/мл общих пептидов (о.п.) и жидкие экстракты-(п=5) с содержанием от 7 до 15 мг/мл о.п., полученные в цехе цитомединов филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген».
Биохимическая характеристика состава экстракта, наличие в нем глицина проведена с использованием методов спектрофотометрии, потенциометрии и хроматографии на бумаге согласно ВФС 42-2077-91 и ФС 42-344, ВС-90:
1) количественное определение общих пептидов проводили с помощью спектрофотометра СФ-26 при длинах волн X 225,215 нм по формуле: (Д2і5-Д225)х 25x25x0,144 X =- , (1) 5х 1 где: Д215 -Д225 - оптические плотности раствора при 215 225 нм; 25 - первое разведение; 25 - второе разведение 5 - количество ампул, взятых на анализ; 1 - объем одной ампулы; 0,144 - экспериментальный коэффициент в мг/мл для белков при дифференцированном измерении поглощения растворов;
2) определение концентрации нуклеиновых кислот в исследуемых образцах проводили по методу Спирина по формуле: Д270 -Д29 X = x 10,3 x 6 , (2) 0,19 где: Д27о и Д290 - значения оптической плотности при соответствующих длинах волн; 0,19- удельная экстинкция; 10,3 - коэффициент пересчета количества фосфата на нуклеиновые кислоты; 6 - разведение препарата; 3) способность исследуемых образцов экстракта восстанавливать активность щелочной фосфатазы, ингибированной цистеином, определяли с помощью спектрофотометра СФ-26 при длине волны X 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм по формуле: (Дм-Дм) X = х 100 , (3) Дм где: Дб-5 , Д4-3) Дг-і - оптические плотности растворов из пробирок 2, 4, 6 против соответствующих контролей 1, 3 ,5; 100 - перевод в проценты;
4) определение рН исследуемых растворов проводили с помощью иономера универсального СВ-74;
5) качественное/количественное определение глицина в образцах проводили методом хроматографии на бумаге в восходящем потоке смеси растворителей: н-бутиловый спирт : ледяная уксусная кислота : вода в соотношении 3:1:1 (по объему) с последующей обработкой хроматограммы ортофталевым альдегидом с образованием зеленого окрашивания (Остерман Л. А.,1985). Предварительно на стартовую линию наслоили по 5 мкл исследуемых образцов (по 10 мкг о.п. в каждом) и образца - свидетеля глицина СОВС (10 мкг).
Исследования фракционного состава экстракта простаты быков проводили при температуре (6-Ю)0 С на хроматографической установке («LKB», Швеция) с помощью колонки с ультрагелем «АсА - 202» «свободным» объемом (Vo) 46,8 мл и размерами (1,5x66,0) см. На колонку наслаивали исследуемые образцы в объеме 1,6 мл. Элюцию проводили стерильным 0,01 M Na-фосфатным буфером (рН 7,2) со скоростью 12 кап/мин с детекцией оптической плотности при длине волны X 280 нм и объемом собираемых проб 3,6 мл. Коэффициент доступности KAV (Остерман Л. А., 1985), характеризующий движение зоны вдоль колонки, вычисляли по формуле: VR-Vo KAV = , (4) Vt-Vo где: VR - объем элюата до момента выхода из колонки вершины пика; Vo - свободный объем колонки; Vt - объем незаполненной колонки. Для исследования селективности АсА-202 использовали стандартные весовые маркеры для фильтрационной гель-хроматографии: голубой декстран, апротинин А, цитохром С, цианкобаламин («Sigma», США); голубой тетра-золий хлорид, глицин - СОВС, DNP-L-аланин, миоглобин A (horse), цитотрип-синоген («Serva», США); миоглобин I, III («Pharmacia», США); стрептомицина сульфат («Merk», Германия); лизоцим («Reanal», Венгрия); окситоцин синтетический, 10 мг/мл (государственный стандарт, Россия), инсулин человеческий («Эли Лили», США)
Похожие диссертации на Биологическая активность экстракта предстательной железы крупного рогатого скота и биотехнологические основы разработки новых лекарственных препаратов
