Введение к работе
Актуальность темы
Плазма донорской крови является уникальным источником различных белков, обладающих высокой лечебной эффективностью. Одной из важных функций плазмы крови является поддержание системы гемостаза, которая включает в себя процессы свертывания крови и фибринолиза, и обеспечивает нормальную циркуляцию крови.
В процессах свертывания и фибринолиза участвуют большое количество белков плазмы. Совокупность их превращений приводит к образованию тромба, и в дальнейшем его лизиса. Смещение равновесия между образованием тромба и его растворением в одну из сторон может привести к развитию сложных патологических состояний.
По мере развития медицины ученые нашли причины многих заболеваний крови, таких как гемофилия, болезнь Виллебранда, различные тромбозы и др. Выяснилось, что они связаны с врожденным недостатком или отсутствием определенного белка в плазме крови больного. Поэтому при лечении этих заболеваний пациенту показаны переливания плазмы донорской крови, в которой в норме содержатся все белки. Однако наряду с необходимым для выздоровления компонентом крови при таких переливаниях больной получает
Работа выполнена при участии кандидата химических наук Берковского А.Л. Список используемых сокращений: AT III - антитромбин III, FVIII - фактор свертывания крови VIII, FIX - фактор свертывания крови IX, ППУ - плазма после удаления факторов свертывания FVIII и FIX, СЗП - свежезамороженная плазма донорской крови, ИЭФ - изоэлектрическое фокусирование, ME - международная единица активности, НМГ - низкомолекулярный гепарин, pi - изоэлектрическая точка.
весь комплекс белков плазмы крови, осложняющих процесс лечения. Крайнюю степень осложнений больной приобретает при так называемом синдроме массивных трансфузий. При трансфузии умеренных доз плазмы фаза угнетения физиологических реакций не всегда проявляется клинически, но ее всегда можно обнаружить лабораторными методами. При массивной трансфузии плазмы донорской крови неблагоприятные эффекты многократно усиливаются. Все эти проблемы привели к развитию методов разработки лекарственных препаратов из плазмы донорской крови.
В последние годы препараты антитромбина III (AT III), выделенные из плазмы донорской крови, занимают одно из ведущих мест в современной медицинской практике. Это связано с тем, что риск развития тромбозов различной этиологии возникает не только вследствие наследственных изменений, но и в процессе лечения ряда различных сложных заболеваний и постоперационной реабилитации. Образование тромба после операционного вмешательства и риск его «отрыва» является очень острой проблемой в современной медицине. Поэтому разработка и получение препарата AT III является актуальной проблемой в современной российской биофармацевтической промышленности.
Работа выполнена при финансовой поддержке и в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (государственный контракт № 14.740.11.0120).
Цель данной работы заключается в разработке метода выделения AT III из плазмы донорской крови после удаления факторов свертывания FVIII и FIX (ППУ) с высоким выходом без дополнительной переподготовки сырья. Это требуется для соблюдения непрерывности потока исходного сырья, необходимой для обеспечения стерильности процесса фракционирования плазмы донорской крови, существующего на базе производственного отдела ГУ Гематологического научного центра.
Задачи исследования заключались в следующем:
Разработать метод получения антитромбина III из плазмы после удаления факторов свертывания FVIII и FIX в рамках расширения выпускаемых препаратов из плазмы донорской крови на базе Гематологического научного центра;
Оценить сорбционные свойства двух аффинных сорбентов по отношению к белку антитромбину III;
Разработать условия колоночной хроматографии выделения AT III из плазмы после удаления факторов свертывания FVIII и FIX на выбранном сорбенте;
Подобрать условия для вирусной инактивации AT III;
Выбрать стабилизаторы для лиофилизации готового концентрата AT III. Научную новизну этой работы можно сформулировать следующим
образом: разрабатываемая схема выделения AT III может рассматриваться как модуль, который можно встроить в любой процесс фракционирования плазмы донорской крови. Создание таких модулей для различных белков плазмы позволяет расширить количество получаемых субстанций и снизить затраты на фракционирование плазмы и дополнительное исходное сырье. Также в работе показано преимущество использования малоизвестного сорбента Toyopearl AF-Heparin НС-650М по сравнению с популярным носителем Heparin-Sepharose FF. Использование данного аффинного носителя на стадии очистки пастеризованного концентрата AT III от продуктов деградации позволяет очистить белок на 97 % и сохранить активность белка в процессе вирусной инактивации на 83 %.
Практическая значимость состоит в том, что в настоящее время на территории России не производят препараты AT III. Их недостаток компенсируется исключительно за счет приобретения зарубежных аналогов препарата. Потребность в препаратах на основе белка AT III возрастает с
каждым годом, потому что риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, трансплантация искусственных органов и сосудов и увеличение раковых больных приводят к проблемам с тромбообразованием. Разработанная нами технология применяется на базе опытно-промышленного производства препаратов плазмы в ФГБУ Гематологическом научном центре.
Апробация работы
Результаты работы докладывались на XII международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2008» (Волгоград, Россия, 2008) и на Московской международной научно-практической конференции "Биотехнология: экология крупных городов" (Москва, Россия, 2010).
Публикации
По результатам диссертационной работы опубликовано 2 оригинальных статьи в журналах, входящих в список изданий, рекомендованных ВАК, а также 2 тезисов докладов на Российских и Международных конференциях.
Структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 94 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, обсуждения и результаты, выводы и список литературы, включающий 91 источник. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 9 таблицами.
Во введении сформулированы задачи исследования, обозначена цель работы и ее практическая значимость.
Литературный обзор состоит из трех частей. В первой части литературного обзора рассматривается физиологическая значимость и механизм действия AT III. Уделяется внимание структурным особенностям белка и клиническому применению препаратов на основе AT III. Вторая часть литературного обзора посвящена существующим способам выделения белка AT III из плазмы донорской крови. Также рассматриваются методы количественной
и качественной оценки концентратов на основе AT III. В третьей части описываются дополнительные стадии технологического процесса, необходимые для получения готовой лекарственной формы, и способы определения лечебной эффективности концентрата AT III.
В основной части дается описание оборудования и материалов, использованных при проведении исследования и методик анализа.
В обсуждении результатов представлены этапы разработки технологии получения AT III из плазмы после удаления факторов свертывания (ППУ), проблемы и способы их устранения. Приводятся результаты количественной и качественной оценки, полученного концентрата AT III.
