Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Замораживание 11
1.2. Сублимация 15
1.3. Досушивание 23
Заключение 32
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 34
2.1. Оборудование 34
2.2. Объекты, использованные в работе 34
2.3. Методы исследований 35
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 43
3.1. Анализ промышленных режимов и НТД по сублимационной сушке биопрепаратов 43
3.2. Исследование температур полного замораживания и эвтектических температур живых противобактерийных
вакцин 50
3.3. Расчет длительности стадии сублимации в зависимости от температуры в материале при различных технологических параметрах 52
3.4. Исследование влияния режимных параметров этапа досушивания на показатели качества сухих биопрепаратов 64
3.4.1. Расчет величины ОВ в зависимости от температурно-временных режимов досушивания 72
3.4.2. Исследование допустимого значения остаточной влажности вакцин, выбранных модельными объектами 82
3.4.3. Влияние режимов досушивания на биологическую активность живых противобактерийных вакцин /. 88
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 96
5. ВЫВОДЫ 101
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 102
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 104
ПРИЛОЖЕНИЕ 120
Введение к работе
Актуальность темы. Значительный объем сухих биопрепаратов выпускается, как у нас в стране, так и за рубежом, методом сублимационного высушивания. Этот метод является весьма дорогостоящим и технологически сложным, однако обладает рядом преимуществ перед другими способами стабилизации биологических материалов различной природы (бактерий, вирусов, белковых объектов) [35].
Степень сохранности биологических свойств биопрепарата и экономичность всего процесса его получения в значительной степени определяются научной обоснованностью режима высушивания и корректностью его проведения [80].
Исследования ученых в области консервирования биопрепаратов расширили знания по конструированию, оценке эффективности и выбору защитных сред [12, 23, 70, 109, 135]; оценке максимально допустимых значений величин остаточной влажности сухих биопрепаратов [59, 93, 122]. В достаточной мере оговорены методы выбора условий и режимов замораживания, подбора холодильного и сублимационного оборудования, указаны необходимые условия для проведения процесса сублимационного высушивания [75, 77].
Однако, несмотря на многолетнюю историю производства сухих биопрепаратов, до сих пор не было разработано простых, мало затратных и достаточно точных методик расчета режимных параметров непосредственно сублимационной сушки, отдельных ее этапов. Это, в первую очередь, связано со сложностью самого процесса сушки, его физико-математического моделирования и сложностью математического аппарата для решения дифференциальных уравнений, описывающих термо-газодинамику процесса сублимации, особенно таких сложных систем, как биоматериалы [67].
Важнейшими режимными параметрами, обеспечивающими качество сухого продукта, является температура (отрицательная - при сублимации и положительная - при досушивании) и длительность ее поддержания в материале [25].
В практике производства, совершенствования и разработки промышленной технологии консервирования биопрепаратов параметр длительности сублимации определяется, как правило, эмпирически, т. е. опытным путем. Для разработчиков и технологов цехов сушки определение зависимости длительности сублимации от конкретных режимных и технологических параметров составляет реальную проблему.
Теория дает только общие закономерности и общие формулы расчета длительности сушки влажных материалов [67]. Поэтому необходимы исследования, направленные на разработку оценки продолжительности сублимации материалов в различной посуде и различных фасовках с защитными средами, наиболее часто применяемыми в практике производства биопрепаратов.
В гораздо меньшей степени, чем замораживание и сублимация изучен этап досушивания, целью которого является удаление влаги до определенного значения [40, 47, 71, 112]. Показатель остаточной влажности является одним из критериев качества сухого биопрепарата. Однако до настоящего времени не было способов оценки температурно-временных режимов досушивания, позволяющих достичь необходимой влажности в готовом продукте.
Кроме того, определенное значение ОВ можно получить различными вариантами температурно-временных параметров [83, 84]. Выбор оптимальной температуры досушивания конкретного вида биопрепарата осуществим только на основе исследования влияний максимального нагрева и его длительности на показатель биологической активности в сухом препарате. Поэтому изучение влияния режимов досушивания на показатели качества сухого продукта (физические и биологические) представляет как научный, так и практический интерес.
Решение этих задач позволило бы получать продукты с качественными характеристиками, необходимыми потребителю, а так же снизить материальные затраты при производстве сухих вакцин, унифицировать и стандартизировать производство сухих биопрепаратов [64, 98].
Сочетание научно-обоснованных режимов и высоких технико-экономических показателей процесса обезвоживания представляет собой оптимальный вариант технологии сушки, обеспечивающий качество высушиваемых материалов [27, 106]. Научное обоснование режимов сушки каждого биопрепарата или группы сходных по определенным параметрам препаратов возможно лишь на основе комплексного изучения всего круга проблем, необходимость решения которых определила выбор темы диссертационной работы.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - разработать расчетные зависимости для оценки температурно-временных параметров сушки биопрепаратов с основными промышленными защитными средами и исследовать влияние температуры и времени досушивания на качественные показатели живых противобактерийных вакцин. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи исследования: провести анализ режимов сублимационного высушивания, приведенных в нормативной документации по изготовлению сухих биопрепаратов; разработать расчетные зависимости для оценки длительности этапа сублимации до момента удаления большей части свободной и слабосвязанной влаги в зависимости от температуры в материалах, высушиваемых с различными защитными средами, в разных видах посуды и объемах фасовок; разработать расчетные зависимости для оценки величин остаточной влажности при различных температурно-временных параметрах досушивания материалов с наиболее применяемыми защитными средами, фасовками, видами посуды; исследовать физико-химические характеристики (температуры полного затвердевания, верхние и нижние эвтектические температуры) модельных противобактерийных вакцин как объектов сублимационной сушки; исследовать влияние различных величин остаточной влажности на биологическую активность живых вакцин: против паратифа свиней из шт. ТС-177; против сальмонеллеза водоплавающих птиц из шт. СВП №3; против листериоза с/х животных из шт. «АУФ»; исследовать влияние температуры и времени досушивания на биологическую активность модельных противобактерийных вакцин
Научная новизна работы. Разработаны эмпирические зависимости для оценки длительности этапа сублимации биоматериалов с защитными средами на основе пептон-лактозы, сахарозо - желатины, обезжиренного молока при сушке в пенициллиновых флаконах, емкостью 20 см и 10 см , ампулах ШП-5, ШПВ-6.
Разработаны эмпирические зависимости для оценки величины остаточной влажности в биопрепаратах с различными защитными средами при высушивании в разной посуде и различных фасовках в зависимости от температурно-временных параметров досушивания.
Определены критические величины остаточной влажности для вакцин: против паратифа свиней из шт. ТС-177; против сальмонеллеза водоплавающих птиц из шт. СВП №3; против листериоза с/х животных из шт. «АУФ».
Показано комплексное влияние температурно- временных параметров досушивания на биологические показатели модельных вакцин: против паратифа свиней из шт. ТС-177; против сальмонеллеза водоплавающих птиц из шт. СВП №3; против листериоза с/х животных из шт. «АУФ».
Научно-практическое значение. Научно-практическая значимость работы заключается в том, что на основании полученных данных разработана «Методика расчета режимных параметров сублимационной сушки биопрепаратов», позволяющая разработчику определить технологические режимы сублимационной сушки создаваемых биопрепаратов, упростить и ускорить проведение научных исследований и внедренческих работ. Использование расчетных зависимостей по оценке длительностей этапа сублимации и досушивания дает возможность технологу цеха сушки оперативно вносить изменения в технологические параметры сублимационного высушивания биопрепаратов, учитывая реальные условия промышленного производства и выполнять требования заказчика по изменению объема фасовки и вида посуды без снижения качества готового продукта.
Проведенные исследования расширяют существующие представления о воздействии температурно-временных параметров сублимационной сушки, в частности досушивания, на выживаемость микробных клеток в живых проти-вобактерийных вакцинах.
Основные положения, выносимые на защиту. По результатам выполненных исследований на защиту выносятся следующие положения: оценка длительности этапа сублимации до момента удаления большей части свободной и слабосвязанной влаги в зависимости от температуры в материалах, высушиваемых с защитными средами, наиболее часто применяемыми в производстве биопрепаратов в разных видах посуды и объемах фасовок; оценка величин остаточной влажности при различных температурно-временных параметрах досушивания материалов с различными защитными средами, при использовании разных объемов фасовок и видов посуды; оценка влияния температурно-временных режимов досушивания на показатели биологической активности живых противобактерийных вакцин.
Замораживание
Замораживание является подготовительной стадией консервирования биопрепаратов методом сублимационного высушивания. В этот период происходит замедление метаболических реакций в высушиваемом материале вплоть до почти полной их остановки. Живые объекты вводятся в состояние обратимого анабиоза, стабилизировать который, призваны все последующие стадии высушивания [29, 10]. Работы исследователей по изучению анабиоза помогают понять механизмы, с помощью которых формируется защита живых микроорганизмов в процессе замораживания - высушивания [11, 100]. По современным представлениям об анабиозе причины инактивации клеток неокончательно установлены, но ряд явлений считается доказанным - необратимые перестройки генетического материала, повреждения белоксинтезирующего аппарата, истощение энергозапасов, нарушение барьерной функции биомембран и транспорта ионов через мембраны, ослабление адаптивных и репаративных механизмов и т.д.
В настоящее время имеется значительное число теоретических и экспериментальных работ, посвященных вопросам замораживания биологических объектов [15, 80, 82, 94, 95,125].
Под влиянием низких температур физиологические процессы в клетке изменяются, вплоть до полного их прекращения. Для уменьшения разрушающих воздействий применяются специально подобранные защитные среды, которые помогают свести к минимуму механические повреждения биоструктуры,
уменьшить деструктивные биохимические и физико-химические процессы [22, 70, 102, 1411.
Температурный диапазон замораживания наиболее полно изучен в интервале от-20С до - 78С, который охватывает почти всю область температур, встречающихся в практике сублимационного высушивания биопрепаратов. В указанных пределах различия в выживаемости микроорганизмов, как правило, зависят от состава защитной среды, а так же вида и штамма биообъекта [36, 80].
Большое значение при замораживании имеет групповая и индивидуальная чувствительность микроорганизмов [108]. Так, грамположительные бактерии лучше переносят замораживание, чем грамотрицательные [81, 104]. Клетки, находящиеся в стадии стационарного роста более устойчивы к замораживанию и последующему высушиванию [147, 150].
Главное явление при замораживании биомассы - фазовое превращение воды в лед. Процессы, происходящие в живых вирусных частицах, бактериальных клетках, макромолекулах при замораживании, во многом зависят от структуры воды в мембранах и видов связи воды с биомакромолекулами [1, 26].
Жидкая вакцина содержит различные минеральные и органические вещества, растворенные в воде, поэтому понижение температуры сопровождается изменением концентрации растворов, что в свою очередь, изменяет температуру замерзания или криоскопическую температуру вещества. Поскольку крио-скопическая температура раствора зависит от его концентрации, а концентрация возрастает с понижением температуры, процесс происходит с непрерывным уменьшением криоскопической температуры до того ее значения, при которой кристаллы льда выделяются из раствора без переохлаждения раствора. Самая низкая температура замораживания для данного вещества зависит от природы отдельных его составляющих и является эвтектической [114].
Воздействие концентрированных растворов в процессе охлаждения является одной из наиболее существенных причин необратимых изменений лабильных биопрепаратов. Эти изменения связаны с денатурацией белков и других соединений, в частности липопротеидов. Гибель живых клеток при охлаждении может быть вызвана не только воздействием гипертонических растворов, но и механическим действием внеклеточного льда, внутриклеточной кристаллизацией воды, частичной дегидратацией содержимого клеток, нарушением взаимосвязи ферментативных процессов, изменением проницаемости клеточных мембран, нарушением коллоидной структуры протоплазмы и др. [24, 46, 50, 85, 106].
Показано, что на сохранение клеточных структур оказывает влияние скорость охлаждения, поскольку от этого зависит формирование тех или иных структур кристаллов льда [89]. Кроме того, температурный - «холодовой шок» отмечается при быстром замораживании (более 10 град в мин) от положительных температур до нуля градусов и ниже [99]. Особенно подвержены этому молодые клетки, находящиеся в стадии логарифмического роста [11].Снижение скорости охлаждения способствует холодовой адаптации клеток, поскольку медленное охлаждение ослабляет интенсивность изменения осмотического давления вследствие диффузии воды из клеток через клеточные мембраны и кристаллизации ее в межклеточных пространствах [91, 145].
Одним из отрицательных последствий быстрого замораживания является кристаллизация воды внутри клетки, что, как правило, приводит к разрушению структуры и гибели клетки [14, 17, 19]. Некоторые исследователи считают, что замораживание необходимо проводить в две стадии - вначале медленное - менее 0,5 град в мин, затем быстрое - до 5 град в мин [13, 108, 149].
В условиях промышленного производства величина скорости замораживания ограничена техническими характеристиками и технологическими особенностями холодильных установок, поэтому речь может идти только о медленном замораживании и, следовательно, о минимальном влиянии этапа замораживания на биологические свойства живого объекта [74].
Условия замораживания, реально осуществимые в промышленном производстве определяют, в основном, формирование той или иной макроструктуры сухого материала [76].
Установлено, что различные условия замораживания определяют различный макровид биопрепаратов [75].Скорость замораживания не более 0,5 С в мин формирует плотную таблетку однородной окраски, мелкокристаллической структуры достаточно однородной по серии биопрепарата. Замораживание со скоростью более 1 - 1,5 С в минуту формирует рыхлую таблетку неоднородной окраски и ребристой «усоподобной» структуры. Экспериментально обоснованы режимы замораживания ряда биопрепаратов. Показано, что при разработке и проведении режимов замораживания-высушивания необходимо обязательное согласование физико-химических характеристик биопрепаратов с параметрами замораживания и сушки [42, 43, 77].
На этапе замораживания параметрами, определяющими качественный исход процесса, являются стандартно воспроизводимые условия первичной и вторичной кристаллизации, а также достижение температуры полного затвердевания жидкой вакцины [75].
При промышленном производстве процессы кристаллизации, происходящие в отдельных флаконах, могут различаться из-за разных условий теплообмена в камере холодильной установки. Кроме того, при большой загрузке камеры кассеты, расположенные внизу и вверху, могут так же находиться в различных условиях охлаждения. Условия конвективного теплообмена в промышленных холодильниках таковы, что нельзя полностью устранить возможность получения в серии различного по структуре материала
Оборудование
Замораживание вакцин проводили в холодильных установках "FRIGERA" НС 700/50 (ЧССР), NZ 280/75 ( ЧССР), "REVCO" (США). Для высушивания препаратов использовали сублимационные установки: LZ - 30.2 (ЧССР), TG -50.5 (Германия) - промышленного типа; TG - 5.2 (Германия) - полупромышленного типа; S.M.G. "USIFROID" (Франция) - лабораторного типа. Аналитические весы "WA - 33" (Польша) были использованы в работе для определения остаточной влажности сухих образцов биопрепаратов.
Объекты, использованные в работе
Объектами для изучения длительностей этапов сублимационной сушки служили основные защитные среды, наиболее часто применяющиеся в практике отечественного производства ветеринарных сухих биопрепаратов:
(ПЛ) - на основе пептона(5 %) и лактозы (5 %);
(СЖ) - на основе сахарозы (10 %) и желатины (1,5 %);
(ОМ) - обезжиренное молоко (50 %).
В качестве моделей биологических объектов были использованы живые противобактерийные вакцины. В работе использованы промышленные серии вакцин производства Щелковского биокомбината, Сумской, Алма - Атинской биофабрик; экспериментальные и опытно-промышленные серии вакцин, изготовленные в отделе разработки промышленной технологии производства про-тивобактерийных препаратов ВНИТИБП из штаммов, полученных из ВГНКИ ветеринарных препаратов: Salmonella cholerae suis ТС - 177, Listeria monocitogenes «АУФ», Salmonella tiphimurium № 3.
Жидкие вакцины перед замораживанием разливали в стерильную посуду. Были использованы наиболее технологичные и часто встречающиеся в практике производства сухих биопрепаратов величины фасовок, объем которых составлял для флаконов емкостью 20 см - от 2 до 6мл; для флаконов емкостью 10 см" - от 1 до 4мл; в ампулы ШП-5 , ШПВ-6 от 0,5 до 2мл.
Материалом для проведения анализа промышленной технологии производства сухих биопрепаратов являлась регламентирующая технологическая документация па производство, данные о производственных режимах замораживания и высушивания биопрепаратов.
Определение температур полного замораживания, эвтектических температур биопрепаратов и защитных сред осуществляли общепринятым методом, с использованием специального электронного блока, вмонтированного в пульт управления сублиматора «SMJ» «USIFROID» и датчика удельного сопротивления. [44]. Основу данного метода, разработанного Л.Рэем, составлял параллельный замер величины удельного сопротивления и температуры образца (при его замораживании-оттаивании).
. Оценку длительности этапа сублимации в зависимости от темпера-туры материалов, расфасованных в пенициллиновые флаконы емкостью 20см , проводили с использованием датчика дифференцированных тепловых потоков (ДДТП). Сигнал ДДТП, пропорциональный интенсивности удаления влаги из замороженного образца, усиленный вторичным прибором (усилитель Ф116/1) регистрировался в «mV» самописцем КСП -4 в течение процесса сушки. Момент снижения величины сигнала, равного 4 mV , соответствовал удалению почти 90% всей влаги из образца.
Оценку длительности этапа сублимации в зависимости от температуры материалов, расфасованных в пеиициллиновые флаконы емкостью 10см3 и ампулы ШП-5 и ШПВ - 6 , проводили, фиксируя количество удаленной влаги из материалов через каждый час процесса сублимации в интервале т = ±3часа, где: т - длительность этапа сублимации, рассчитанная по зависимостям (15-18) данной работы.
Анализ промышленных режимов и НТД по сублимационной сушке биопрепаратов
В инструкциях по изготовлению и контролю сухих биопрепаратов раздел по консервированию препаратов методом сублимационного высушивания не имеет общей системы и порядка описания.
Раздел, в котором должны описываться режимы замораживания и высушивания, в одних I ГГД называется «Расфасовка, сушка, запайка ампул», в других случаях - «Высушивание вакцины», в третьих - «Замораживание и высушивание».
Основным недостатком большинства описаний раздела является отсутствие конкретности представляемых режимов сублимационного высушивания, недостаточное определение критериев контроля поступающего на консервирование полуфабриката - т.е. жидкого материала. Следствием является то, что биопрепараты, зачастую, производятся нестандартные, нередко ведется выбраковка продукта по качественным показателям.
В настоящее время определены основные этапы метода сублимационного консервирования (44). На рис.1 графически показаны этапы консервирования биопрепаратов, а также схематически представлены критерии и параметры поэтапного контроля.
Оценить качество проведения всего процесса консервирования биопрепарата методом сублимационной сушки, можно только определив корректность проведения каждой стадии.
При разработке новых видов биопрепаратов и совершенствовании существующей технологии производства для обеспечения единого уровня качества продукции важным является выявление значимых параметров технологических операций и определение их влияния на качество готового продукта, а также «разброс» величин параметров, который реально возможен при промышленном производстве биопрепаратов.
Основным критерием качественного проведения этапа замораживания является отсутствие в замороженном материале жидких переохлажденных фракций, что достигается охлаждением материала до температуры полного замораживания (затвердевания) - Тпз. (рис.1).
В НТД, в большинстве случаев, Т„3. не указывается. Описание типа : «...расфасованную жидкую вакцину помещают в низкотемпературный холодильник (-40 :- -50 С)...» не является корректным. При недостаточном охлаждении материала, даже на 5 -10С при последующей сублимации могут происходить локальные вскипания жидких переохлажденных фракций в материале, что приведет к ухудшению макровида готового сухого биопрепарата - таблетка с зонами контракций-сжатий, неровная с краев, а также может произойти снижение биологической активности. Охлаждение материала ниже Т„..) не оправдано с точки зрения экономических затрат.
Описания процесса сублимационного высушивания в НТД не имеют, как правило, привязки к конкретной фасовке в определенную посуду.
Использование различных видов посуды требует конкретных темпе-ратурно-временных режимов сублимации и досушивания, отсутствие описания которых в НТД вынуждает технологов определять длительности этапов сушки опытным путем.
Процесс сублимации тем длительнее, чем выше высота столба наливаемой жидкости. Длительность высушивания материала расфасованного в различную посуду (в ампулы, пенициллиновые флаконы емкостью 20 см или 10см ) значительно различается при прочих равных условиях. Зачастую в ІІТД нет указаний на конкретное время проведение сублимации. Например, в «Инструкции по изготовлению и контролю сухой живой вакцины против листериоза сельскохозяйственных животных из шт. «АУФ» указано, что жидкую вакцину «...расфасовывают по 4 см3 или 10 см3в стерильные флаконы вместимостью 20 см или по 4 см в стерильные ампулы...». Режим высушивания при этом рекомендуется один и тот же, в инструкции не конкретизированы температурно-временные параметры для каждой из указанных фасовок, в результате чего неизбежна нестандартность готового биопрепарата по физическим и биологическим показателям.
В «Инструкции по изготовлению и контролю сухой живой вакцины против сальмонеллеза водоплавающей птицы» регламентировано расфасовывание жидкой вакцины «при непрерывном перемешивании в стерильные ампулы типа БЦЖ по 2 или 4 см ». Нет рекомендаций по фасованию во флаконы. Надо отметить, что розлив в ампулы по 4 мл не является технологичным, поскольку соотношение высоты столба наливаемой жидкости к диаметру посуды не соответствует оптимальному значению. Использование завышенных фасовок может привести к значительному увеличению длительности сушки из-за ухудшения условий тепло-массообмена в высушиваемом материале.
Похожие диссертации на Оценка температурно-временных параметров сублимационной сушки и их влияния на показатели качества биопрепаратов : На моделях живых противобактерийных вакцин
