Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Ячмень — основное сырье для пивоваренной промышленности 8
1.1.1. Основные критерии качества пивоваренного ячменя 10
1.1.2. Характеристика белкового комплекса зерна ячменя 14
1.2. Факторы, влияющие на качество пивоваренного ячменя 19
1.2.1. Влияние условий выращивания и питания растений на технологические показатели качества зерна ячменя 22
1.2.2. Фитогормоны, их роль в обмене веществ и влияние на белковый синтез в растениях 24
1.2.3. Регуляторы метаболизма: их роль в обмене веществ и влияние на качество зерна ячменя 30
1.3. Протеолитические ферменты зерна ячменя 35
1.3.1. Общая характеристика протеолитических ферментов 35
1.3.2. Экзопептидазы (пептидазы) ячменя 37
1.3.3. Эндопептидазы (протеиназы) ячменя 39
1.4. Основные показатели оценки качества солода 44
1.4.1. Химические показатели качества солода 45
1.4.2. Микробиологические критерии оценки качества ячменя и солода 47
2. Экспериментальная часть 51
2.1. Материалы и методы исследований 51
2.1.1. Агрохимическая характеристика почв 51
2.1.2. Характеристика и условия применения исследуемых регуляторов метаболизма 53
2.1.3. Методы исследования физических, химических и физиологических показателей зерна ячменя 54
2.1.4. Определение поверхностной и внутренней микрофлоры ячменя 55
2.1.5. Определение водорастворимого белка по методу Лоури 55
2.1.6. Определение фракционного состава белков ячменя 57
2.1.7. Определение протеолитической активности модифицированным методом Ансона 57
2.1.8. Выделение и очистка кислой и нейтральной протеиназы ячменя 58
2.1.9. Фракционирование белков методом гель-хроматографии 59
2.1.10. Проращивание зерна ячменя и получение лабораторного солода 63
2.1.11. Получение лабораторного сусла стандартным методом 64
2.1.12. Методы оценки качества лабораторного солода и сусла 65
2.2. Влияние агрофона и регуляторов метаболизма на технологические показатели пивоваренного ячменя сорта Михайловский» 69
2.2.1. Влияние агрофона на урожайность пивоваренного ячменя сорта «Михайловский» 69
2.2.2. Влияние агрофона на физические, химические и физиологические на показатели пивоваренного ячменя сорта «Михайловский» 70
2.2.3. Влияние регуляторов метаболизма на показатели качества пивоваренного ячменя сорта «Михайловский» 77
2.2.4. Влияние агрофона и регуляторов метаболизма на фракционный состав белков зерна ячменя 82
2.3. Влияние регуляторов метаболизма на морфологические изменения зерна ячменя при проращивании 84
2.4. Анализ качественных показателей лабораторного солода и сусла, полученного из зерна ячменя, выращенного с применением регуляторов метаболизма 88
2.4.1. Влияние регуляторов метаболизма на физические и химические показатели качества лабораторного солода и сусла 88
2.4.2. Влияние регуляторов метаболизма на состав азотистых соединений лабораторного солода и сусла 91
2.4.3. Фракционирование водорастворимых белков ячменя и ячменного солода методом гель-хроматографии на колонке с TSK - gel Toyopearl HW-55F 93
2.5. Влияние агрофона и регуляторов метаболизма на активность протеолитических ферментов зерна ячменя и ячменного солода 99
2.5.1. Влияние агрофона и регуляторов метаболизма на активность нейтральной и кислой протеиназы зерна ячменя 99
2.5.2. Влияние агрофона и регуляторов метаболизма на активность нейтральной и кислой протеиназы ячменного солода 106
2.5.3. Характеристика продуктов протеолиза белков ячменя под действием эндогенных протеиназ солода 111
2.6. Влияние препаратов регуляторних веществ на микробную контаминацию зерна ячменя 116
Выводы 124
Литература 127
- Основные критерии качества пивоваренного ячменя
- Регуляторы метаболизма: их роль в обмене веществ и влияние на качество зерна ячменя
- Методы оценки качества лабораторного солода и сусла
- Влияние агрофона и регуляторов метаболизма на активность нейтральной и кислой протеиназы зерна ячменя
Введение к работе
Актуальность темы
Рост производства зерновых культур в сочетании с улучшением их биохимических показателей и технологических достоинств - одна из сложных и ответственных задач растениеводства. Обеспечение устойчивого наращивания производства высококачественного продовольственного зерна, являющегося сырьем для многих отраслей промышленности и занимающего большое место в продовольственном балансе страны имеет важное значение в зонах рискованного земледелия, к числу которых относится Нечерноземье. В последние годы решение этой задачи приобрело особую значимость, поскольку в зоне рискованного земледелия оказалась значительная часть посевных площадей, отведенных под зерновые культуры.
Наряду с сортовыми особенностями, фактором, во многом определяющим химический состав зерна, его биохимические особенности и технологические показатели качества, является внешняя среда - состояние почвы, степень окультуренности, дозы вносимых удобрений. Правильное использование этих факторов приводит к увеличению урожайности зерновых культур, улучшению технологических показателей зерна и помогает решению проблемы получения экологически безопасной продукции высокого качества.
Это в полной мере относится к отечественному высококачественному пивоваренному ячменю, недостаток которого остро ощущает солодовенная и пивоваренная промышленность.
Известно, что применение минеральных удобрений влияет на плодородие почвы, приводя, как правило, к увеличению урожайности зерновых культур. При этом происходят биохимические изменения зерна, приводящие, в одних случаях, к улучшению технологических показателей качества, а в других -возможно, к их ухудшению.
Изучение комплексного влияния степени окультуренности почвы, доз вносимых удобрений и обработки препаратами регуляториых веществ, которые могут осуществлять качественные сдвиги внутренних биохимических
процессов, на технологические показатели качества пивоваренного ячменя весьма актуально и имеет большое значение для получения качественного зерна, отвечающего требованиям перерабатывающей промышленности и способного сократить дефицит отечественного солода.
Одним из эффективных и перспективных путей решения этой задачи является комплексное применение химических средств защиты и препаратов регулятори ых веществ.
Программирование урожайности зерновых культур, направленное формирование биохимических показателей и технологических достоинств зерна, возможно лишь на основе многостороннего и глубокого изучения влияния степени окультуренности почвы, доз вносимых удобрений на основные показатели качества зерна и на происходящие в зерне биохимические изменения.
В связи с изложенным выше, повышение урожайности пивоваренного ячменя в сочетании с улучшением показателей качества и технологических достоинств зерна ячменя является важной проблемой сельскохозяйственного и солодовенного производства в России.
Цель и задачи исследования
Целью работы является изучение комплексного влияния агрофона (степени окультуренности почвы, доз вносимых удобрений) и регуляторов метаболизма на белково-протеиназный комплекс и технологические показатели качества пивоваренного ячменя сорта «Михайловский», выращенного в условиях Нечерноземья.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: - изучение физических, химических и физиологических показателей качества пивоваренного ячменя сорта «Михайловский», выращенного на разном агрофоне с использованием препаратов регуляторных веществ;
характеристика биохимических и технологических показателей качества лабораторного солода и сусла, полученного из зерна ячменя, выращенного на разных агрофонах с применением регуляторов метаболизма;
изучение влияния препаратов регуляторных веществ на активность кислой и нейтральной протеиназы ячменя и ячменного солода и их влияния на процесс протеолиза эндогенных белков.
исследование влияния регуляторных препаратов на степень микробной контаминации зерна ячменя.
Научная новизна
Выявлено комплексное влияние агрофона и регуляторов метаболизма на качество пивоваренного ячменя сорта «Михайловский», выращенного в Московской области, урожая 2002 и 2003 гг.
Применение препаратов регуляторных веществ (АОБ - Су и Новосил) позволяет улучшить качество солода. Лабораторный солод, полученный из зерна ячменя, обработанного препаратами регуляторных веществ, по экстрактивности, времени осахаривания, степени растворения, в том числе и белкового, превосходит необработанные образцы.
Обработка препаратами регуляторных веществ (АОБ и Новосил) повышает термостабильность нейтральной и кислой протеиназ.
В большей степени свою активность после сушки солода сохраняет нейтральная протеиназа, что свидетельствует о том, что в процессе затирания именно им принадлежит ведущая роль в превращении белковых соединений.
Практическая значимость
Результаты исследований позволяют более полно охарактеризовать возможности пивоваренного ячменя сорта «Михайловский» и существенно расширяют представления о влиянии агрофона и регуляторов метаболизма на технологические и биохимические показатели качества зерна ячменя,
выращенного в условиях Нечерноземья, что может быть использовано в селекционной работе, а также в исследованиях, связанных с разработкой новых технологических приемов в процессе приготовления ячменного солода.
Изучение основных показателей качества зерна ячменя сорта «Михайловский», полученного из него лабораторного солода и конгрессного
„ сусла, показало, что применение комплекса средств химизации и препаратов
регуляторных веществ позволяет направленно влиять на качество зерна ячменя
4 ив условиях Нечерноземья получать ячмень, в целом отвечающий требованиям
солодовенной и пивоваренной промышленности. Обработка препаратами регуляторных веществ, как в период вегетации растений, так и при замачивании зерна в процессе солодоращения позволяет снизить контаминацию зерна патогенной микрофлорой.
Апробация работы.
і*
Материалы диссертации были представлены на Международном
і Региональном семинаре Центральной и Западной Европы международной
* организации франкоязычных университетов «Управление качеством и
технологическими процессами в пищевой промышленности» (Кишинев, май, 2004г.); Международной научно-практической конференции «Технологии и продукты здорового питания» (Москва, июнь 2004г.); Всероссийской научно-технической конференции - выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства их реализации» (Москва, октябрь 2004г.); Всероссийской научно-практической конференции «Перспективы развития пищевой промышленности» (Оренбург, март 2005г.);
Публикации
v По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Основные критерии качества пивоваренного ячменя
Ячмень (Hordeum sativum) - древнейшая и одна из наиболее распространенных зерновых культур. Он является основным сырьем для пивоваренной промышленности. Благодаря своей относительно большой приспособляемости к климатическим и почвенным условиям, а также многообразию сортов, ячмень встречается в посевах всех стран мира. Более 100 сортов ячменя высеивают на территории Российской Федерации и бывших союзных республик.
Высокие технологические качества имеют ячмени определенных сортов, выращенные в благоприятных почвенно-климатических условиях. Так, например, в зонах с умеренным климатом Центральной Европы и в приморских европейских странах произрастают лучшие ячмени. К ним относится и ячмень из юго-западных областей Украины, он не уступает по качеству лучшим мировым сортам. Хорошие пивоваренные ячмени произрастают и в других областях Украины, а также в некоторых областях Центрально-Черноземного и Центрального районов России, в Белоруссии, Прибалтике, Закавказье, Киргизии, Казахстане (23).
В последние годы в связи с распадом Советского Союза, произошло нарушение ранее сложившейся территориальной специализации зернового хозяйства (17, 38). Это привело к потере лучших территорий произрастания ячменя. Проблема качественных отечественных пивоваренных ячменей является сдерживающим фактором в развитии солодовенной промышленности. Ежегодно в Россию импортируется более 40% солода (69, 136). В настоящее время потребность пивоваренной отрасли в ячмене составляет примерно 1,2 млн. тонн, что соответствует 950 тыс. тонн солода (23, 37). В стране производится около 600 тыс. тонн солода среднего качества, на что идет 750 тыс. тонн ячменя.
Все культурные ячмени с учетом их морфологических, биологических, экологических, физиологических и агрохимических особенностей подразделяются на 31 афоэкологическую фуппу, которые в свою очередь делятся на подфуппы и виды, укладывающиеся в три резко отличающихся подвида — многорядный ячмень, двухрядный и интермедиум. Лучшие сорта пивоваренного ячменя относятся к западноевропейской агроэкологическои фуппе. В современном пивоварении предпочтение отдают двухрядным ячменям, принадлежащим разновидности нутанс (74).
В настоящее время в России производство пивоваренного ячменя сконцентрировано в Центрально-Черноземном районе (Липецкая, Воронежская, Тамбовская и др. области). Для производства солода внутри регионов пивоваренный ячмень стали выращивать в Новгородской, Ивановской, Рязанской, Тульской, Ярославской, Астраханской, Волгофадской и некоторых других областях. Эти районы производят около 70% ячменя, однако, климатические условия этих регионов не позволяют получить ячмень с хорошими технологическими характеристиками. Выращивание ячменя в неоптимальных условиях приводит к формированию жесткой стекловидной структуры эндосперма и повышению содержания белка. Такое зерно плохо разрыхляется при солодоращении и имеет низкую экстрактивность, обусловленную в основном недоступностью компонентов зерна для действия ферментов. Основными причинами низкого качества солода производимого в РФ наряду с недостаточной оснащенностью солодовенных предприятий, использования морально и физически устаревшего технологического оборудования, нарушения технологических режимов, называются: - слабая организация и низкая продуктивность сельского хозяйства в целом; - недостаточное внимание к селекции новых сортов ячменя с высокими р солодовенными и пивоваренными свойствами; - несоблюдение афотехники выращивания сортов пивоваренного ячменя; - неблагоприятные погодные условия при вегетации. Особенно следует отметить, что негативное влияние на рост и развитие сельскохозяйственных растений и их восприимчивость к вредителям и болезням оказывает уменьшение содержания в почве гумуса, резкое снижение вносимых в почву удобрений. Так баланс питательных веществ из положительного по фосфору и относительно благополучного по калию и азоту стал в настоящее время отрицательным по всем элементам. Нельзя забывать и об опасности связанной с применением высоких норм расхода пестицидов и нарушения технологий их применения, что вызывает негативные последствия в агросистемах и отрицательно сказывается на санитарно-гигиенических и качественных показателях сельскохозяйственной продукции (121). В связи с необходимостью преодоления негативных тенденций, сложившихся в отрасли производства пивоваренного ячменя, составляющего основу для солодовенной и пивоваренной промышленности, в феврале 2001 года Министерством сельского хозяйства РФ была принята «Целевая программа обеспечения устойчивого производства ячменя и солода в Российской Федерации на 2002 - 2005 гг. и на период до 2010 г.». Цель Программы -создание условий для устойчивого товарного производства высококачественного пивоваренного ячменя и солода в РФ. Выбор ячменя для пивоварения имеет большое значение, так как по показателям его качества можно судить о пригодности ячменя для солодоращения и режимах дальнейшей переработки (53, 74, 89, 98). Критерии оценки качества пивоваренного ячменя основываются на оценки по внешним признакам, физическим, химическим и физиологическим показателям качества (24,25,36,37,90). Для производства солода используют ячмень, удовлетворяющий требованиям действующего ГОСТа 5060-86. В таблице 1.1. приведены показатели зерна ячменя, по которым пивоваренный ячмень делят на два класса (36,74).
Регуляторы метаболизма: их роль в обмене веществ и влияние на качество зерна ячменя
Так, регуляторная роль фенольных соединений при прорастании связана с контролем уровня ауксинов, ингибирующем действием в период покоя семян, участием в механизмах защиты растений, в процессах тканевого дыхания, и биосинтеза ферментов (93). В растениях обычно содержатся определенный набор фенольных соединений. Так, растения семейства злаковых, и в частности ячмень, характеризуются наличием флавонолов, флавонов, оксикоричных кислот и оксикумаринов (40, 41,42).
В.А. Соломатиной (120) с целью совершенствования технологии солода проведены исследования влияния фенольных соединений, выделенных из зерна ячменя, на интенсивность его дыхания при прорастании. Установлено, что фенольные соединения при определенной концентрации оказывают тормозящее действие на интенсивность дыхания прорастающего ячменя, но в то же время не влияют на биосинтез и активность амилолитических ферментов солода.
Проведенные исследования были положены в основу разработки режимов солодоращения в зависимости от физиологического состояния ячменного зерна. При использовании суммарного экстракта собственных фенольных соединений на процесс прорастания зерна ячменя установлено, что в течение всего периода солодоращения фенольный экстракт оказывает стимулирующее действие в концентрации 6,5 ІОГ6 - 1,4"Ю-5 г на 100 г замачиваемых зерен по сравнению с контролем. При более высоких концентрациях фенольных соединений (3,7 10" — 8,1 - 10 5) происходит торможение роста.
Двойственность действия характерна для всех биологически активных веществ. Это свойство лежит в основе их регулирующей деятельности. Достижение пороговой концентрации вызывает соответствующий стимулирующий или ингибирующий эффект, действуя на метаболизм клетки или выступая в роли индуктора или репрессора генной активности. Об участии биологически активных веществ в процессах жизнедеятельности судят на основании связи между их содержанием и интенсивностью метаболистичееких процессов или по их влиянию на физиологические процессы. Многие исследователи связывают действие фенольных соединений с метаболизмом фосфорных соединений и с нуклеиновым обменом (203, 213). Они могут оказывать ингибирующее воздействие на ростовые процессы при старении растений, азотной недостаточности или при водном стрессе (206). Интересно, что некоторые авторы высказывают мнение, что ингибирующим действием обладают не сами фенольные соединения, а продукты их окисления (40). Еще одна важная функция растительных фенольных соединений -защитная. Фенолы, содержащиеся в повышенных количествах в оболочках семян, играют роль защитных барьеров на пути механических, химических, термических и биологических повреждений. Очевидно, что в процессе эволюции возникла способность генов отвечать на различные неблагоприятные воздействия и обеспечивать защитные реакции клеток (205).
Генетическая регуляция осуществляется в ходе синтеза новых белков, в том числе и ферментов, на уровне транскрипции, трансляции и процессинга. Примером длительного ответа на стресс служит способность растений синтезировать стрессовые белки в ответ на различные экстремальные воздействия: анаэробиоз, окислительный стресс, повышенные или пониженные температуры, обезвоживание, высокие концентрации солей, тяжелых металлов, действие вредителей, а также при раневых поражениях и ультрафиолетовой радиации. Каждый из перечисленных стрессов вызывает синтез специфических для него белков (88,171, 188).
В устойчивости растений к действию факторов внешней среды помимо специфических, зависящих от особенностей воздействия, важную роль играют неспецифические физико-химические реакции клетки, возникающие при действии любых неблагоприятных факторов. Исследования последних лет показали, что суть неспецифических реакций в значительной степени сводится к изменениям, которые обнаруживаются в мембранных образованиях клетки (175). Среди фенолов растительного происхождения необходимо выделить группу производных, таких как фенольные липиды. Они обладают амфифильными свойствами, благодаря особенностям молекулярного строения: алкильной цепочке, присоединенной к гидроксибензольному кольцу. Фенольные липиды, иначе называемые алкилрезорцинами или алкияоксибензолами (АОБ) состоят из многочисленного ряда индивидуальных химических типов (гомологов). Алрилрезорцины обнаружены в пшеничных отрубях, в зернах ржи, ячменя, в зеленых тканях растений, во фруктах. Кроме того, была показана способность микроорганизмов синтезировать и накапливать в культуральной жидкости и внутриклеточно ауторегуляторы, контролирующие процессы цитодифференцировки (26, 64, 91, 186,187). Механизм действия АОБ при развитии покоя клеток обусловлен тем, что: Алкилоксибензолы влияют на организацию мембран (модифицируя их); Взаимодействуют с липидами мембран, за счет образования сети межмолекулярных связей между гидроксигруппами ароматического кольца АОБ и молекулами липидов. Модификация мембран приводит к подавлению энергетических, синтетических и гидролитических процессов. АОБ - обладают антиоксидантным действием; АОБ - действуют как низкомолекулярный естественный модификатор, изменяющий структуру белковых макромолекул, что приводит к неспецифическому ингибированию активности ферментов. Стабилизированный АОБ белок (за счет водородных и гидрофобных взаимодействий) приобретает повышенную устойчивость к неблагоприятным воздействиям (стресс, механические повреждения, температура). Различные ароматические соединения, входящие в состав экстрактов, полученных из растений, в определенных концентрациях обладают бактерицидными и фунгицидными свойствами, выполняют функции регуляторов метаболизма, ингибируя процессы роста и дыхания зародыша и тем самым снижают расход экстрактивных веществ на рост и развитие вегетативных органов и дыхание, вследствие чего повышается выход и экстрактивность солода (2, 8, 18, 19,44). В настоящее время предложены и защищены авторскими свидетельствами способы интенсификации процесса солодоращения путем добавления в замочную воду экстрактов, полученных из растений, например, из коры деревьев, зеленых шишек сосны, дуба и др. (4, 5, 125, 127, 148). Известно, что подобные экстракты содержат ароматические соединения терпеновой и фенол ьной природы. Таким образом, действие на растения многих физиологически активных веществ (гормоны, регуляторы роста и метаболизма и др.) происходит в результате их влияния на синтез нуклеиновых кислот и белков, как на уровне транскрипции путем изменения экспрессии генов, так и на последующих этапах синтеза белков. Большинство известных препаратов, оказывающих регуляторное воздействие на клетки и ткани растений, вызывают одновременную активацию экспрессии многих генов, что приводит к общему усилению азотного метаболизма и повышению концентрации суммарного белка, - как в вегетативных органах растений, так и в семенах.
Методы оценки качества лабораторного солода и сусла
Действие на растение многих физиологически активных веществ происходит в результате их влияния на синтез нуклеиновых кислот и белков, как на уровне транскрипции путем изменения экспрессии генов, так и на последующих этапах синтеза белка. Большинство известных препаратов, оказывающих регуляторное действие на клетки и ткани растений, вызывают одновременную активацию экспрессии многих генов. Однако в ряде случаев выявлено действие фиторегуляторов на экспрессию определенных групп белков (чаще всего ферментов), что свидетельствует о возможности целенаправленного воздействия на генетический аппарат растений с целью изменения экспрессии отдельных генов и улучшения, таким образом, состава растительных белков.
С другой стороны, определенные химические соединения могут участвовать в регуляции клеточных процессов на посттрансляционном уровне, модифицируя структуру белков, ферментов или, воздействуя на структуру мембран, что, в конечном счете, проявляется в изменении активности различных ферментных систем и защитных механизмах растения.
В связи с тем, что условия выращивания значительно влияют на биохимические показатели качества пивоваренного ячменя, проводили изучение влияния препаратов регуляторных веществ на основные показатели качества пивоваренного ячменя сорта «Михайловский», выращенного на разных агрофонах.
В работе использовался препарат «АОБ — Су», предоставленный Институтом Микробиологии РАН. АОБ (алкилоксибензол) является низкомолекулярным естественным модификатор, изменяющий структуру белковых макромолекул. Стабилизированный АОБ белок (за счет водородных и гидрофобных взаимодействий), приобретает повышенную устойчивость к неблагоприятным воздействиям (стресс, механические повреждения, температура). Другой, используемый в работе препарат, — «Новоеил» — представляет собой экстракт из зелени пихты сибирской, действующее вещество — смесь тритерпенових кислот. Предоставлен Институтом химических средств защиты растений РАСХН.
Препарат «Новосил» является стимулятором роста и индуктором иммунитета растений, обладает защитным эффектом к комплексу грибных, бактериальных и вирусных болезней, повышает защитные функции растительного организма и при воздействии неблагоприятных условий среды (засуха, морозы и т.п.). Препарат предназначен для предпосевной обработки семян или опрыскивания в период вегетации. Обработку ячменя исследуемыми препаратами регуляторных веществ проводили в стадии колошения ячменя, как описано в разделе 2.1.2. В таблицах 2.16 - 2.25 представлены данные по комплексному влиянию агрофона и регуляторов метаболизма на показатели качества пивоваренного ячменя сорта «Михайловский». Данные, представленные в таблицах 2.16 и 2.17, по комплексному влиянию агрофона и регуляторов метаболизма на натуру и массу 1000 зерен показывают, что обработка препаратами регуляторов увеличивает оба эти показателя, что в целом имеет положительное влияние на технологические показатели качества зерна. Комплексное влияние агрофона и регуляторов метаболизма на крупность зерна ячменя, по данным таблицы 2.18, неоднозначно. Наиболее позитивные изменения этого показателя выявлены для хорошо окультуренной почвы. Новосил 1,2 2,0 3,8 2,4 1,2 1,0 2,0 Стекловидность зерна ячменя, обработанного препаратами регуляторов метаболизма, возрастает по сравнению с контролем. Наиболее выражен этот эффект для слабоокультуренной почвы, а также без применения удобрений. Для средне и хорошо окультуренной почвы с рекомендованными дозами удобрений и дозами, спланированными на усвоение 3 % ФАР, увеличение не такое значительное. Т Проращивание зерна ячменя проводили при температуре 12-14 С, с предварительным замачиванием с длительными воздушными паузами (4 часа - вода, 8 часов - воздух), как описано в разделе 2.1.7. Визуально отмечали морфологические изменения при проращивании зерна ячменя исследуемых образцов. Было установлено, что зерно ячменя, выращенное без применения регуляторов метаболизма, прорастает значительно менее интенсивно, чем зерно ячменя, обработанного препаратами «АОБ-С7» и «Новосил». Наиболее сильное влияние регуляторных веществ на процесс прорастания зерна отмечено для зерна ячменя, выращенного на хорошо окультуренной почве. В связи с высокой интенсивностью прорастания зерна, обработанного препаратами регуляторных веществ, температура была снижена до 10 С, с целью снижения потерь сухих веществ и обеспечения лучшего растворения солода. Продолжительность проращивания исследуемых образцов зерна ячменя составила 5 дней. Следует отметить, что, несмотря на то, что зерно ячменя не обработанное препаратами регуляторных веществ имело темную окраску (визуальная оценка), что свидетельствует о поражении грибной инфекцией, развитие плесени при проращивании ячменя не наблюдалось ни в одном из исследуемых образцов.
Влияние агрофона и регуляторов метаболизма на активность нейтральной и кислой протеиназы зерна ячменя
Частично очищенные препараты нейтральной и кислой протеиназ получали из лабораторного солода, полученного из ячменя, выращенного на хорошо окультуренной почве с рекомендованными дозами удобрений, без применения препаратов регуляторных веществ (Вариант 8 — контроль) и обработанного препаратами «АОБ — С7» и «Новосил», как описано в разделе 2.1.8. При этом на конечном этапе перерастворения проводили концентрирование препарата в 2 раза. Степень очистки препарата нейтральной протеиназы - 60 раз; кислой протеиназы - 10 раз.
Для приготовления субстрата использовали размолотое зерно ячменя соответствующих образцов, которое выдерживали в течение трех суток в тонком слое в эксикаторе над водой и затем прогревали при 100С в течение 1,5 часов. Таким образом, получали, так называемую, инактивированную муку (как это принято в пивоваренной отрасли), для того, чтобы исключить автолитические процессы. Для удаления низкомолекулярных белков предварительно проводили отмывание размолотого зерна водой (90).
Инкубационная смесь состояла из субстрата - инактивированной муки и соответствующего буфера (для кислой протеиназы использовали 0,1М фосфатно-цитратный буфер с рН 3,8; для нейтральной протеиназы - с рН 6,1). В вариантах с использованием кислой протеиназы в инкубационную смесь добавляли цистеин из расчета конечной концентрации в инкубационной смеси 0,25%. Преды нкубацию субстрата и фермента проводили при 40С в течение 10 минут, затем частично очищенный фермент вносили в субстрат в соотношении 10 : 1. Протеолиз вели в течение 120 минут, после чего отбирали пробы объемом 10 см3, которые сразу охлаждали при 4С (ранее было показано, что при такой температуре процесс протеолиза прекращается) и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 минут. Полученный супернатант фракционировали на колоне с TSK — gel Toyopearl HW — 55F в холодильной камере «Colora» при 4С. Объем наносимый на колонку составил 5 см , объем собираемых фракций - 4 см . Регистрацию оптической плотности элюата во фракциях осуществляли при длине волны 280 нм на спектрофотометре.
Профили элюции продуктов протеолиза белков ячменя под действием нейтральной протеиназы солода представлены на рисунке 2.13. Полученные результаты показывают, что все анализируемые образцы характеризуются большим разнообразием белков и пептидов различной молекулярной массы, варьируемой от 700000 до 1000 Да. Так, в контрольном варианте выявлено 7 хроматографических пиков с молекулярными массами: 700 кДа (11 фракция - свободный объем колонки); 820 кДа (13 фракция); 100 кДа (18 фракция); 9000 Да (25 фракция); 3500 Да (28 фракция); 1500 Да (33 фракция) и 1000 Да (35 фракция - общий объем колонки). нейтральной протеиназой солода Анализ продуктов расщепления белков ячменя, обработанного препаратами «АОБ - С7» и «Новосил», под действием эндогенной нейтральной протеи назо й солода показывает, что картина элюции сильно изменяется. Во-первых, увеличивается количество высокомолекулярной фракции, выходящей со свободным объемом колонки, что свидетельствует о том, что в этих вариантах большая часть белков переходит из нерастворимого состояния в растворимое по сравнению с контрольным вариантом. Кроме того, возрастает и количество средне- и низкомолекулярных продуктов протеолиза, причем особенно в варианте с ячменем, обработанным АОБ, при этом наблюдается и значительное изменение фракционного состава образующихся продуктов. Так, для варианта, в котором использовалось зерно ячменя, обработанного препаратом «Новосил», характерно уменьшение доли белков с молекулярной массой 820000 Да и практическое отсутствие фракции с молекулярной массой 9000 Да. Для варианта, в котором использовалось зерно ячменя, обработанное препаратом «АОБ-С7» отличительной особенностью является появление белковой фракции с молекулярной массой 35000 Да (22 фракция). Также для обоих вариантов с использованием зерна ячменя, обработанного препаратами регуляторных веществ, отмечен высокий прирост пептидов с молекулярной массой от 3500 Да и менее, что соответствует в среднем 28 - 30 аминокислотным остаткам. Аналогично были проведены эксперименты по исследованию продуктов протеолиза белков ячменя кислой протеиназой, выделенной из солода (рис. 2.14). Как видно из рисунка 2.14, картина фракционирования продуктов расщепления белков кислой протеиназой во всех вариантах кардинально отличается от аналогичного исследования действия нейтральной протеазы (рис. 2.13). Действие кислой протеиназы характеризуется накоплением большого количества низкомолекулярных продуктов протеолиза, начиная с пептидов с молекулярной массой от 1500 Да и менее, что в среднем соответствует 10 -12 аминокислотным остаткам. Действие исследуемых препаратов регуляторных веществ выражается, как и в вариантах с нейтральной протеиназои, в увеличении количества высокомолекулярных белков, выходящих с общим объемом колонки, а также в более интенсивном приросте доли низкомолекулярных фракций (45% -АОБ; 50% - Новосил против 32% - контроль). Таким образом, можно констатировать, что нейтральная и кислая протеиназы активно гидролизуют эндогенные белки переводя их в растворимое состояние. Нейтральная протеаза гидролизует белки, образуя промежуточные продукты различной молекулярной массы, что говорит о достаточно узкой специфичности этого фермента; кислая протеиназа образует большое количество низкомолекулярных продуктов протеолиза, что подтверждает ее широкую специфичность и способность гидролизовать пептидные связи, образованные разными аминокислотами.
Обработка препаратами регуляторных веществ приводит к интенсификации процесса протеолиза. Изменение картины фракционирования особенно очевидно для продуктов распада белков зерна ячменя, обработанного препаратом «АОБ — С7», под действие нейтральной протеиназы. Это подтверждает высказанное ранее предположение о неоднозначном влиянии регуляторних веществ на протеазы ячменя и ячменного солода. Действие АОБ в большей мере проявляется по отношению к нейтральной протеиназе.
Поскольку действующим веществом регуляторного препарата «Но вое ил» является сумма тритерпеновых кислот, с определенной долей вероятности можно предположить, что они способны выступать в роли конкурентных ингибиторов абсцизовой кислоты, например, на стадии образование гормонрецепторного комплекса, и, тем самым, снимать известный, описанный в литературе, ингибирующий эффект АБК по отношению к протеолитическим ферментам и в определенных ситуациях повышать активность протеиназ и, как следствие, увеличивать степень протеолиза эндогенных белков.
Состав микроорганизмов, обсеменяющих свежеубранное зерно, весьма разнообразен и представлен в основном бактериями - до 90+98%; очень небольшим количеством мицелиальных грибов — менее 1+4%; а также вирусами, дрожжами, акти ном ицетами. Общее количество микроорганизмов на одном грамме свежесобранного ячменя составляет в среднем 106 клеток. И хотя, удельная доля мицелиальных грибов очень мала, они причиняют значительный ущерб, вызывая порчу зерна и зерно продуктов. Взаимоотношения грибов с растением ячменя разнообразны: они могут вести себя как облигатные фитопаразиты, факультативные паразиты или сапрофиты. Отмечено, что субэпидермальные микроорганизмы вызывают более существенные изменения зерна, чем эпифитные микроорганизмы, так как они развиваются во внутренних оболочках зерна и в зародыше (119).
Похожие диссертации на Влияние агрофона и регуляторов метаболизма на биохимические показатели качества пивоваренного ячменя
