Введение к работе
Актуальность темы. Бешенство остается одной из важнейших проблем ветеринарии и здравоохранения во многих странах мира. Несмотря на проводимые противоэпизоотические мероприятия в Российской Федерации, ограничить распространение бешенства не удается (СВ. Грибенча, 1993; Н.А. Хисматуллина и др., 2000; В.М. Авилов и др., 2002; В.В. Макаров, А.А. Воробьев, 2004; А.Е. Метлин, 2008; В.А. Ведерников, И.В. Балдина, 2010; А.М. Гулюкин, 2011).
Противоэпизоотические мероприятия при бешенстве включают диагностику болезни и профилактическую иммунизацию домашних, диких плотоядных и сельскохозяйственных животных с последующим контролем эффективности вакцинации.
Методы диагностики бешенства, рекомендуемые Комитетом экспертов ВОЗ, требуют специального оборудования и предназначены, в основном, для постмортальных исследований (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2011).
Показана возможность индикации антигена вируса бешенства в слюне животных методом иммунохроматографии (В.К. Kang, et al., 2007), в эпителиальных клетках роговицы глаза (корнеальный тест) и биоптатах кожи методом иммунофлюоресценции (Н.А. Ковалев, 1965; L.G. Schneider, 1969; Н.А. Ковалев, А.С. Шашенько, 1970; J. Zimmerman 1971; J. Bingham, P. Mlambo, 1995; Н.П. Мишаева и др., 2008), а также вирусного генома в слюне и спинномозговой жидкости методом ПЦР (P. Crepin, et al., 1998; Я.С. Цыбанов, 2001).
Достижения биотехнологии на современном этапе позволяют совершенствовать методы иммуноанализа на основе реагентов, визуализирующих результат реакции. В связи с этим, представляет научный и практический интерес разработка тест-систем на основе точечного анализа на нитроцеллюлозной мембране с применением конъюгата специфических антител с пероксидазой (dot-ELISA) или с коллоидным золотом для выявления
антигена вируса бешенства в слюне животных, что необходимо для оценки риска заражения человека или животных.
Объективным методом оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства является определение в сыворотке крови уровня вируснейтрализующих антител (Э.Я. Сазанова и др., 1991; СВ. Кузнецова, 1991; J.S. Smith, 1996; F. Cliquet, et al., 1998; H.A. Хисматуллина и др., 2000; К.Н. Груздев, В.В. Недосеков, 2001).
В 2007 году Комитет экспертов ВОЗ рекомендовал непрямой вариант иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения поствакцинальных антирабических антител в сыворотке крови собак и кошек (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines, 2011).
В связи с вышеизложенным, исследования в области совершенствования существующих и разработки новых методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных являются актуальными и имеют научное и практическое значение.
Цель и задачи исследований. Основной целью данной работы являлось совершенствование методов диагностики и оценки эффективности вакцинопрофилактики бешенства животных.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
получить рибонуклеопротеин вируса бешенства и специфические к нему антитела, синтезировать на их основе конъюгаты с пероксидазой и коллоидным золотом;
разработать тест-системы на основе dot-ELISA и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для выявления антигена вируса бешенства в слюне животных;
получить препарат альбумина, меченного родамином, и отработать условия выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза, мазках ткани мозга животных и в культуре клеток методом контрастной иммунофлюоресценции;
5 - усовершенствовать тест-систему на основе непрямого ИФА для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных.
Научная новизна исследований. Показана принципиальная возможность выявления антигена вируса бешенства в слюне методами dot-ELISA и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера и в эпителиальных клетках роговицы глаза животных методом контрастной иммунофлюоресценции.
Разработаны тест-системы на основе dot-ELISA и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне.
Показано, что применение конъюгата альбумина с родамином повышает эффективность метода иммунофлюоресценции при выявлении антигена вируса бешенства.
Усовершенствована тест-система на основе непрямого ИФА для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и предложены:
тест-системы на основе dot-ELISA и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера для индикации антигена вируса бешенства в слюне;
набор реагентов для определения уровня специфических антител в сыворотке крови вакцинированных против бешенства животных методом непрямого ИФА;
метод контрастной иммунофлюоресценции для выявления антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза, мазках ткани мозга животных и в культуре клеток.
Результаты исследований представляют практическую ценность для оптимизации противоэпизоотических мероприятий по борьбе с бешенством.
Основные положения, выносимые на защиту
Индикация антигена вируса бешенства в слюне животных методами dot-ELISA и точечного анализа с применением иммунозолотого маркера.
Выявление антигена вируса бешенства в отпечатках роговицы глаза, мазках ткани мозга животных и в культуре клеток методом контрастной иммунофлюоресценции.
Определение уровня специфических антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против бешенства, методом непрямого ИФА.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работы проводились совместно с заведующим отделом вирусологии ВНИТИБП, доктором ветеринарных наук B.C. Ивановым (2010), ведущим научным сотрудником ВГНКИ, кандидатом биологических наук А.Л. Елаковым.
Апробация результатов работы. Основные материалы диссертационной работы доложены на заседаниях Ученого совета ВНИИТБП, на Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (Покров, 2011), на Международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты разработки, приготовления, контроля качества и использования ветеринарных иммунобиологических препаратов на основе современных биотехнологий» (Алушта, АР Крым, 2011), на научно-практической конференции, посвященной 90-летию ФГУП «Армавирская биофабрика» (Армавир, 2011), Международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты интегрированной защиты животных от болезней», посвященной 50-летию ГНУ ВНИИВЭА (Тюмень, 2011), на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (Щелково, 2011) и на межлабораторных совещаниях сотрудников отдела иммунологии, отдела молекулярной биологии и вирусологии ГНУ ВНИТИБП (2010-2011).
Публикация научных исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных работ, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, иллюстрирована 4 таблицами и 21 рисунком. Список литературы включает 270 источников, из которых 199 иностранных.
