Введение к работе
Актуальность работы
Изучение патогенных стрептококков и вызываемых ими заболеваний продолжает оставаться одной из актуальных задач медицинской науки и практического здравоохранения. Это объясняется распространенностью стрептококковых инфекций во всех странах мира и тяжелыми осложнениями, часто приводящими к летальным исходам.
За последние два десятилетия значительно возрос интерес к Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В, СГВ), который ранее рассматривался лишь в качестве возбудителя мастита крупного рогатого скота (Keefe G. et al, 1997). В настоящее время установлено, что этот микроб является также одним из ведущих патогенов человека при беременности и у новорожденных (Regan J. et al., 1996). Кроме того, СГВ оказались способными вызывать заболевания взрослых людей, такие как пиелонефрит, артриты, абсцессы, мастит, эндокардит, септицемию и др. Однако в России, до недавнего времени, инфекциям, вызываемым СГВ, не придавалось должного внимания. Причиной этого была и продолжает оставаться слабая лабораторно-диагностическая база, отсутствие нормативных документов по диагностике, профилактике и лечению инфекций, вызываемых СГВ, а также слабая информированность отечественных специалистов о патогенных свойствах СГВ. Как следствие, это привело к серьезной недооценке роли СГВ инфекции в акушеро-гинекологической практике и неонаталогии, где смертность от инфекций, вызванных СГВ, является крайне высокой (Regan J. et al, 1996, Schuchat A., 1998).
Уже более 70 лет иммунологический подход продолжает оставаться основным для идентификации и классификации патогенных стрептококков группы В (ГапсейеЫ R, 1934), среди которых выявляются девять различных серологических типов (la, lb, II-VIII). Использование методов молекулярной генетики позволяет более подробно охарактеризовать стрептококки группы В и в пределах одного и того же серологического типа СГВ обнаружить различные генетические линии (Hauge М. et al., 1996). Совершенно очевидно, что реальное количество эпидемиологически значимых штаммов существенно превышает число известных серологических типов СГВ. Поэтому, использование методов молекулярной генетики с целью выявления генетических маркеров отдельных штаммов (клонов) СГВ, имеющих эпидемиологическое значение, может существенно повысить эффективность дифференцировки изолятов и изучения эпидемиологии заболеваний, вызываемых СГВ.
Несмотря на то, что молекулярно-генетические методы позволяют детально охарактеризовывать штаммы СГВ, они все еще крайне редко используются при изучении эпидемиологии заболеваний, вызванных СГВ. Одной из основных причин редкого использования молекулярных методов является то, что сам выбор метода анализа не регламентирован, полностью зависит от опыта и возможностей экспериментатора, а условия проведения
рос. национальная] библиотека i
исследований до сих пор не стандартизованы. Все это отрицательно сказывается на результатах анализов и точности диагностического заключения.
Очевидно, что изучение особенностей организации генома штаммов СГВ и разработка на этой основе комплекса стандартизованных молекулярных методов для изучения эпидемиологии стрептококковых инфекций, актуальны не только для медицинской науки, но и для практического здравоохранения. Новые знания о генетике и особенностях строения генома различных штаммов СГВ должны оказаться полезными для выявления эпидемиологически значимых клонов-возбудителей заболеваний и эпидемиологического надзора за распространением инфекций, вызванных стрептококками группы В.
Изложенное выше определило цель и задачи исследования.
Цель исследования:
Изучение геномного полиморфизма штаммов Streptococcus agalactiae и разработка на этой основе методов диагностики и дифференцировки стрептококков группы В - возбудителей заболеваний человека и животных.
Задачи работы:
Сравнительный анализ штаммов СГВ методами молекулярной генетики и определение критериев для дифференцировки штаммов, выделенных от человека и животных;
Изучение распространенности определенного набора генов вирулентности (Ъса, Ъас, scpB, Imb, cyl, hylB, cfb, scaB, glnA) и возможности существования "островов" патогенности у штаммов СГВ различных серотипов;
Изучение распространенности инсерционных последовательностей ДНК 1S1548, IS861, !SSa4, IS1381 и локализация сайтов их инсерции в хромосомную ДНК штаммов СГВ;
Определение организации фрагмента генома СГВ в области локализации гена вирулентности Ъас, кодирующего IgA связывающий белок;
Разработка и апробирование на клиническом материале методов ПЦР-диагностики стрептококков различных видов, вызывающих заболевания человека и животных.
Научная новизна:
Научная новизна работы заключается в комплексном сравнительном молекулярно-генетическом анализе СГВ, выделенных от человека и животных, и выявлении генетических маркеров для эффективной дифференцировки штаммов:
впервые научно обосновано положение о существовании у стрептококков группы В "острова" патогенности, содержащего гены вирулентности scpB и Imb, кодирующие С5а пептидазу и белок, связывающий ламинин, соответственно;
- впервые установлена точная локализация гена вирулентности Ъас на хромосоме и обнаружен "остров" патогенности, содержащий ген Ъас и гены новой двухкомпонентной регуляторной системы, предположительно
позволяющей стрептококкам группы В адаптироваться и выживать в неблагоприятных условиях;
- впервые показано, что штаммы СГВ, выделенные от человека,
отличаются от штаммов, выделенных от животных, наборами генов
вирулентности и IS элементов;
- установлено, что "горячими точками" для инсерции в геном СГВ
являются участки ДНК с высоким содержанием аденина и тимина, а число
копий IS элементов и их взаимное расположение в геноме СГВ может быть
использовано в качестве эпидемиологического маркера штаммов;
- выявлены значительные различия в размерах геномов различных
штаммов СГВ, при этом минимальный размер генома составил 2029 т.н.п., а
максимальный - 2465 т.н.п., и впервые установлено значение Smal
рестрикционных фрагментов генома СГВ размерами от 42 т.н.п. до 100 т.н.п.
для дифференцировки штаммов;
- обнаружена область геномной ДНК, содержащая варьирующее
количество прямых повторов размерами 44 н.п. и спейсерных участков
размерами 16 н.п. у различных штаммов СГВ;
обнаружен новый ген alpS, кодирующий белок семейства поверхностных а-подобных белков, участвующих в формировании вирулентности СГВ;
- обоснована целесообразность использования особенностей структуры
генов scpB и српбО для ГЩР-дифференцировки штаммов различных видов
стрептококков, вызывающих заболевания человека и животных.
Практическая значимость исследования:
В целом, исследование носит теоретический характер. Тем не менее, многие из полученных данных являются перспективными для дифференцировки штаммов СГВ с целью характеристики клона-возбудителя заболевания и для мониторинга инфекций, в частности, внутрибольничных инфекций, вызванных СГВ. В настоящее время метод ПНР-диагностики СГВ в биологических жидкостях человека апробирован на клиническом материале и используется в Научно-исследовательской лаборатории "Диагностика" (Санкт-Петербург) и Пекинском детском госпитале (Китай), а на основании предложенного подхода разрабатываются методические рекомендации МЗ и СР РФ по диагностике СГВ (Центр по молекулярной медицине МЗ и СР РФ, Санкт-Петербург). Предложенный экспресс-метод дифференцировки стрептококков различных видов, вызывающих мастит у крупного рогатого скота, используется в ветеринарной практике в Университете ветеринарной медицины (Кошице, Словакия).
Фрагменты ДНК, секвенированные в настоящем исследовании, были депонированы в базе данных GenBank под следующими номерами: AY445916, AY449757, AY449758, AY449759, AY455996, AY455997, AY459524, AY461799, AY461800, AY461801, AY487423, AY487424, AY464086, AY464087, AY464088, AY508648, AY496926, AY598359, AY587557, AY587556, AY587555, AY691895, AY691897, AY691898, AY707990, AY707991, AY707993.
Положения, выносимые на защиту:
Анализ Smal рестрикционных фрагментов хромосомной ДНК от 42 т.н.п. до 100 т.н.п. и анализ длин рестрикционных фрагментов, содержащих гены вирулентности и IS элементы стрептококков группы В, необходим для оценки степени генетического родства штаммов и является эффективным средством генетической дифференцировки штаммов;
Стрептококки группы В, содержащие ген вирулентности Ъас, кодирующий IgA связывающий белок, являются близкородственными и составляют отдельную генетическую линию. Ген вирулентности Ъас и гены двухкомпонентной регуляторной системы входят в состав "острова" патогенности СГВ;
Ген вирулентности scpB, кодирующий С5а пептидазу, и ген Imb, кодирующий белок, связывающий ламинин, входят в состав "острова" патогенности СГВ;
Штаммы СГВ, выделенные от человека, значительно отличаются от штаммов СГВ, выделенных от животных, распространенностью генов вирулентности scpB, Imb, bac и сочетаниями IS элементов IS1548, IS861, IS1381 и Ша4;
Полиморфизм нуклеотидных последовательностей и различия в количестве прямых повторов размерами 44 н.п. и спейсерных областей размерами 16 н.п. являются критерием для дифференцировки штаммов;
Белок, кодируемый геном alp5, относится к семейству а-подобных поверхностных белков СГВ, которые участвуют в формировании вирулентного фенотипа микроба;
7. ПЦР анализ с использованием праймеров на специфические
области генов scpB и српбО является перспективным подходом для
дифференцировки патогенных стрептококков различных видов.
Достоверность полученных результатов подтверждается следующим:
Высокой чувствительностью и специфичностью использованных молекулярно-генетических методов исследования (ПЦР, секвенирование, Southern гибридизация, рестрикционный анализ и др.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные;
Использованием современных компьютерных программ ("SEQAID", "ОГЮО", "BEAST, "Multalin" и др.), электронных баз данных PubMed и Medline, а также базы данных СепВапкдля анализа ДНК.
Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 49
научных работах (из них 24 статьи и 25 тезисов) и доложены на 20 симпозиумах и конференциях: 5-ой Международной Конференции по стрептококковой генетике, Виши (Франция) в 1998 г.; 1-ом Центрально-Европейском Конгрессе по ветеринарии, Будапешт (Венгрия) в 1999 г.; XTV Международном Симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Окленд (Новая Зеландия), в 1999 г.; Международной
Конференции Чехословацкого Микробиологического общества "Актуальные проблемы микробиологии и иммунологии", Кошице (Словакия) в 1999 г.; 9-ом и Съезде Чешского и Словацкого Иммунологических обществ, Либерец (Чехия) в 2000 г.; Научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины», Санкт-Петербург (Россия) в 2000 г.; 3-ем Международном Симпозиуме по антимикробным препаратам, Сеул (Южная Корея) в 2001 г.; 4-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург (Россия) в 2001 г.; 22-ом Конгрессе Чехословацкого Микробиологического Общества, Кошице (Словакия) в 2001 г.; 23-ем Международном Педиатрическом Когрессе, Пекин (Китай) в 2001 г.; VIII Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва (Россия) в 2002 г.; 6-ой Международной Конференции по стрептококковой генетике, Эшвилл (США) в 2002 г.; Российско-Американском семинаре "Экология инфекционных заболеваний", Новосибирск (Россия) в 2002 г.; XV Международном Симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям, Гоа (Индия) в 2002 г.; Международной конференции по функциональной геномике грамположительных микроорганизмов, Бавено (Италия) в 2003 г.; 13-ом Европейском Конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Глазго (Шотландия) в 2003 г.; 10-ом Съезде Чешского и Словацкого Иммунологических обществ, Банска Быстрица (Словакия) в 2003 г.; Научно-практическом семинаре "Особенности идентификации, выделения и определения чувствительности пиогенных стрептококков", Санкт-Петербург (Россия) в 2004; 14-ом Европейском Конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Прага (Чехия) в 2004 г.; 23-ем Конгрессе Чехословацкого Микробиологического Общества, Брно (Чехия) в 2004 г.
Материалы работы докладывались на заседаниях отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (1998, 1999, 2000, 2002, 2003, 2004 гг.), лаборатории микробиологии и иммунологии Пекинского детского госпиталя (1998, 2000, 2001, 2002, 2004), кафедре микробиологии и иммунологии Университета ветеринарной медицины, Кошице (1999,2003).
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на
293 страницах машинописного текста, включающего в себя введение, 4 главы обзора литературы, описание материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 28 таблицами и 32 рисунками, указатель литературы содержит 319 источников, в том числе 9 отечественных и 310 иностранных.
