Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Ассоциация генетических маркеров с адаптационными возможностями и мышечной деятельностью человека 15
1.2 Генетическая обусловленность состава мышечных волокон и гипертрофия мышц 22
1.3. Роль миогенного фактора 6 в процессах эмбрионального развития мышечной ткани и регенерации скелетных мышц после повреждения 26
1.4. Исследования экспрессии гена миогенного фактора 6 (MYF6) в процессе адаптации скелетных мышц к физическим нагрузкам 33
1.5. Функция структурного белка скелетных мышц а-актинина-3 у человека 36
1.6. Исследования R577X полиморфизма гена а-актинина-3 {ACTN3) с помощью подхода «случай-контроль» 41
1.7. Исследования R577X полиморфизма гена ACTN3 с помощью подхода «генотип-фенотип» 44
Глава 2. Материалы и методы исследования 47
2.1. Характеристика исследуемых групп 47
2.1.1. Контрольные группы 48
2.1.2. Группы спортсменов 49
2.1.3. Группы испытуемых 50
2.2. Молекулярно-генетические методы 57
2.2.1. Выделение ДНК из клеток эпителия ротовой полости 57
2.2.2. Выделение ДНК из крови 59
2.2.3. Выделение ДНК из мышечной ткани 60
2.2.4. Определение С964Т полиморфизма гена MYF6 61
2.2.5 Определение R577X полиморфизма гена ACTN3 64
2.3. Определение гистоморфометрических показателей мышечных волокон 67
2.4. Метод магнитно-резонансной томографии и компьютерный анализ полученных изображений отдельных мышц 70
2.5. Оценка морфофункциональных показателей 72
2.6. Статистический анализ 74
Глава 3. Результаты исследования 75
3.1. Результаты генотипирования спортсменов и контрольной группы 75
3.1.1. Частота встречаемости генотипов и аллелей по гену MYF6... 75
3.1.2. Частота встречаемости генотипов и аллелей по гену ACTN3.. 78
3.2. Ассоциация С964Т полиморфизма гена MYF6 с морфофункциональными показателями спортсменов 86
3.3. Изучение связи полиморфизмов С964Т гена MYF6 и R577X гена ACTN3 с параметрами мышечных волокон 90
3.3.1. Ассоциация С964Т полиморфизма гена MYF6 с размером и композицией мышечных волокон 90
3.3.2. Ассоциация R577X полиморфизма гена ACTN3 с размером и композицией мышечных волокон 93
3.4. Ассоциация полиморфизмов С964Т гена MYF6 и R577X гена ACTN3 с размерами т. rectus femoris 95
3.5. Ассоциация полиморфизмов С964Т гена MYF6 и R577X гена ACTN3 со степенью гипертрофии в результате систематической мышечной деятельности 99
3.5.1. Ассоциация полиморфизмов С964Т гена MYF6 и R577X гена ACTN3 со степенью гипертрофии т. rectus femoris после смешанной тренировки 99
3.5.2. Ассоциация R577X полиморфизма гена ACTN3 со степенью гипертрофии отдельных мышц и мышечных волокон после силовой тренировки 101
Глава 4. Обсуждение результатов 104
Выводы 120
Практические рекомендации 121
Список литературы 122
Благодарности 138
- Ассоциация генетических маркеров с адаптационными возможностями и мышечной деятельностью человека
- Исследования R577X полиморфизма гена ACTN3 с помощью подхода «генотип-фенотип»
- Метод магнитно-резонансной томографии и компьютерный анализ полученных изображений отдельных мышц
- Ассоциация С964Т полиморфизма гена MYF6 с морфофункциональными показателями спортсменов
Введение к работе
Одной из основных задач современной генетики человека является поиск связи между генотипом и фенотипом [Варфоломеев, 2007]. В функциональном плане геном человека расшифрован всего лишь на 1% [ENCODE, 2007], что указывает на относительность современных знаний о его структуре и функции, а также на необходимость дальнейшего увеличения объема исследований в области функциональной геномики [Ахметов и др., 2008-4].
Детальная расшифровка генома человека включает в себя детекцию полиморфных участков ДНК, влияющих на экспрессию генов и ассоциирующихся с различными фенотипами [Stranger et al., 2005], а также обнаружение новых генетических кодов, связанных с регуляцией генома, эмбриогенезом и дифференцировкой тканей [Hallikas et al., 2006]. Число проводимых в мире ассоциативных генетических исследований настолько велико, что выработаны особые правила для корректного представления их результатов [Little, 2009], а современный этап развития ДНК-технологий привел к использованию достижений молекулярной генетики во всех областях науки, включая и спортивную науку.
В настоящее время признано аксиомой, что высоких спортивных результатов может достичь лишь талантливый человек, обладающий определенным комплексом генетических предпосылок к данной деятельности [Сергиенко, 2004]. Вариабельность в проявлении физической активности у разных людей и способность стать высококвалифицированным спортсменом имеет генетическую основу. Результаты многочисленных исследований семей и близнецов, а также ассоциативных исследований — «случай-контроль» {case-control study), одномоментных поперечных {cross-sectional study), динамических продольных {longitudinal study) — указывают на важную роль генетических факторов наряду с эпигенетическими и внешними факторами в детерминации индивидуальных различий в развитии, проявлении физических качеств и адаптационных возможностях человека
8 [Ahmetov and Rogozkin, 2009]. В 1997 году проф. Hugh Montgomery с
коллегами из Лондонского Университетского колледжа впервые показали ассоциацию I/D полиморфизма гена АСЕ с гипертрофией миокарда левого желудочка после тренировки [Montgomery et ah, 1997], а в 1998 году опубликовали в журнале «Nature» статью о связи данного полиморфизма с двигательной деятельностью, что послужило отправным пунктом для поиска ассоциаций других генов с различными «спортивными» фенотипами [Montgomery et al., 1998]. В настоящее время во многих лабораториях мира проводится поиск генетических локусов, влияющих на фенотипы, связанные с физической деятельностью человека. Последняя генетическая карта физической активности (The Human Gene Map for Performance and Health-Related Fitness Phenotypes: the 2006-2007 update), выпущенная группой американских ученых под руководством проф. Claud Bouchard, включает 239 генов и локусов количественных признаков [Bray et al., 2009]. В данной версии карты представлен 221 ядерный ген, 18 митохондриальных генов и 119 количественных локусов (QTL - quantitative trait loci), для которых показана ассоциация с физическими качествами человека, либо связи ген — физическая активность и ген — физическая тренировка.
Еще в 80-90 гг. прошлого столетия были разработаны диагностические комплексы, позволяющие определять спортивные задатки по серологическим, гормональным, морфологическим и функциональным маркерам [Ахметов и др., 2007-1]. Генетическое тестирование не заменяет традиционные методы (физиологические, гистологические, биохимические и др.), применяемые для отбора в профессиональный спорт, но может быть хорошим дополнением к ним. Данный подход является неинвазивным, менее дорогим и более точным методом, который возможно осуществлять в юном возрасте [Lippi et al., 2009]. Более того, определение генетической предрасположенности к тем или иным видам физических нагрузок может также являться решением проблемы в области физиологии и спортивной медицины на пути к рациональному и персонализированному
9 тренировочному процессу. Необходимо отметить, что все фенотипы
физической активности являются высоко полигенньтми [Williams, 2008].
Таким образом, для отбора в профессиональный спорт, а также для
оптимизации тренировочного процесса нужно использовать диагностические
комплексы, включающие анализ полиморфизмов большого числа генов.
Процесс миогенеза начинается в раннем периоде эмбрионального развития человека и приводит к формированию мышечной ткани, наличие которой является основой для любой физической активности взрослого организма. Наиболее сильно свойство пластичности скелетных мышц проявляется при систематической мышечной деятельности. Мышцы отвечают на внешние воздействия путем изменения размера, состава волокон и метаболизма. Данные адаптационные процессы в организме обеспечиваются уровнем экспрессии генов, а их полиморфизмы отвечают за разнообразие в структуре мышц и двигательной деятельности человека [Stewart et al., 2006].
В геноме человека насчитывается более 13 миллионов вариабельных участков, на долю которых главным образом приходятся однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) [IHMP, 2005], сегментальные дупликации [Sharp et al., 2005], инсерции/делеции [McCarrollet al., 2006] и инверсии [Kidd et al., 2008]. Большинство SNP являются нейтральными аллельными вариантами, но некоторые из них, несомненно, функциональны и обуславливают существование различных фенотипов. Такие SNP влияют на функцию и стабильность белков или на экспрессию отдельных генов и областей генома, ответственных за регуляцию транскрипции и сплайсинга [Варфоломеев, 2007].
Анализ результатов исследований в области молекулярной генетики спорта, а также понимание важной роли регулятороного фактора 6 и саркомерного белка а-актинина-3 в развитии скелетных мышц и поддержании целостности мышечного аппарата у взрослого человека позволили высказать предположение, что SNP в гене миогенного
10 регулятороного фактора 6 (MYF6) может являться функциональным,
аналогично тому, что было показано ранее для R577X полиморфизма гена а-
актинина-3 (ACTN3). Исследования R577X полиморфизма гена ACTN3 были
проведены в некоторых популяциях и в группах спортсменов, но полученные
результаты противоречивы. Утверждение о том, что обнаруженные
ассоциации вариации генов со спортивными фенотипами в одной популяции
будут существовать в другой популяции, требует экспериментального
подтверждения [Lippi et al., 2009]. Для этого нами было проведено изучение
R577X полиморфизма ACTN3 у жителей России и российских спортсменов.
Исследование С964Т полиморфизма гена MYF6 в российской популяции
также не проводилось. В ходе крупного международного проекта The
International НарМар Project () с целью
создания базы данных SNP генома человека, определяли частоту
встречаемости генотипов и аллелей по С964Т гена MYF6 в различных
популяциях методом геномного секвенирования, однако литературных
данных об ассоциативных исследованиях данного полиморфизма нами
обнаружено не было.
Определение ассоциаций между генетическими полиморфизмами и
функционированием мышц, а также мышечной адаптацией в ответ на
внешние стимулы является актуальным не только для практики спорта, но и
для общего понимания физиологических возможностей человека
осуществлять физическую деятельность.
11 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель данной научной работы заключалась в изучении ассоциации полиморфизмов генов MYF6 и ACTN3 со структурой и функцией скелетных мышц человека.
Задачи исследования:
Разработать методику определения полиморфизма С964Т гена MYF6.
Провести анализ полиморфизмов С964Т гена MYF6 и R577X гена ACTN3 и распределения частот генотипов и аллелей у жителей России (контрольная группа) и в группах спортсменов различных специализаций и квалификаций.
Определить ассоциацию полиморфизмов С964Т гена MYF6 и R577X гена ACTN3 с морфофункциональными показателями человека и морфометрическими параметрами скелетных мышц у спортсменов и в группах физически активных здоровых людей.
Проверить гипотезу о возможной ассоциации полиморфизмов С964Т гена MYF6 и R577X гена ACTN3 со степенью гипертрофии мышечных волокон и отдельных мышц в результате длительных тренировок смешанной и силовой направленности.
12 ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Полиморфизмы С964Т гена MYF6 и R577X гена ACTN3 ассоциируются с физической активностью человека. Частота 964ТТ генотипа (статистически значимо) и 964Т аллеля (статистически незначимо) гена MYF6 выше в группе спортсменов, занимающихся видами спорта с преимущественным проявлением выносливости по сравнению с контрольной группой; частота 577RR генотипа и 577R аллеля гена ACTN3 превалирует в группе спортсменов, занимающихся скоростно-силовыми видами спорта и видами спорта на выносливость. На этом основании MYF6 ТТ генотип можно рассматривать как маркер предрасположенности к развитию и проявлению выносливости, а ACTN3 R аллель и RR генотип - к физической деятельности любой направленности.
С964Т полиморфизм гена MYF6 ассоциирован с размером мышц и мышечных волокон. Носители 964ТТ генотипа и 964Т аллеля обладают большей площадью поперечного сечения (ППС) мышц и мышечных волокон за счет преобладания медленных волокон. R577X полиморфизм гена ACTN3 не связан с исходным размером мышц, ППС и составом мышечных волокон.
В результате силовой тренировки у носителей генотипа 577RR по ACTN3 имелась тенденция к большему приросту максимальной произвольной силы (МПС) и более высокой степени гипертрофии отдельных мышц и быстрых мышечных волокон. После тренировки смешанной направленности ассоциация полиморфизмов генов MYF6 и ACTN3 со степенью мышечной гипертрофии не выявлена.
С964Т полиморфизм гена MYF6 не имеет статистически значимого
эффекта на антропометрические, композиционные, силовые и функциональные показатели профессиональных спортсменов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ
Впервые определены частоты генотипов и аллелей по гену MYF6 (С964Т полиморфизм) и ACTN3 (R577X полиморфизм) у жителей России, Великобритании и у российских спортсменов. Обнаружена ассоциация С964Т полиморфизма гена MYF6 (964ТТ генотип) со спортивной деятельностью, направленной на развитие выносливости. Результаты одномоментных и динамических исследований по поиску ассоциации С964Т полиморфизма гена MYF6 с составом мышечных волокон и размером отдельных мышц позволяют отнести генотип 964ТТ по MYF6 к генетическим маркерам мышечной работоспособности. При проведении исследования «случай-контроль» впервые показано, что 577RR генотип по гену ACTN3 дает преимущество не только для развития и проявления скорости и силы, но и для качества выносливости. Результаты сравнительного анализа R577X полиморфизма гена ACTN3 с морфофункциональными параметрами мышечной деятельности в результате систематической мышечной деятельности подтверждают благоприятное влияние 577R аллеля на развитие и проявление физических качеств человека.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
Результаты данной работы вносят вклад в развитие геномики физической активности, а также биохимии и физиологии мышечной деятельности. В комплексе с другими генами-маркерами мышечной деятельности генотипирование по генам ACTN3 и MYF6 может быть использовано для определения индивидуальной предрасположенности к развитию и проявлению физических качеств человека. Проведение такого генетического теста спортсменам и лицам, занимающимся фитнесом, позволит индивидуализировать тренировочный процесс для оптимального развития двигательных качеств и повышения мышечной массы, а также поможет сохранить здоровье на протяжении спортивной карьеры. Предложенный комплексный подход исследования полиморфизмов — от ассоциации со спортивной деятельностью до анализа мышечных волокон — может быть применен для проведения молекулярно-генетических исследований по поиску взаимосвязи «генотип-фенотип». Более того, знания о генетических маркерах мышечной деятельности могут помочь в правильной организации экспериментов, в которых необходимо учитывать принцип генетической однородности выборок (одинаковое число аллелей, ассоциированных с определенным мышечным фенотипом). Таким образом, при сравнении изменений мышечных параметров между группами спортсменов, тренируемыми по разным схемам, интерпретация результатов для определения более эффективного типа тренировки приобретает более объективный и качественный характер.
Ассоциация генетических маркеров с адаптационными возможностями и мышечной деятельностью человека
Успех спортсмена определяется широким разнообразием генетических, эпигенетических и внешних средовых (тренировка, питание, мотивация, техническое обеспечение и др.) факторов. Генетические факторы имеют значительное влияние на все компоненты спортивной деятельности, включая силу, быстроту, выносливость, размер и состав мышечных волокон, гибкость, нейромышечную координацию, темперамент и другие фенотипы. По данным De Moor вариабельность спортивных качеств определяется генетическими факторами на 66% [De Moor et ah, 2007].
После анализа полученных ассоциаций генотипов и гаплотипов с конечными фенотипическими признаками, полиморфизмы генов могут быть идентифицированы как генетические маркеры, ассоциированные либо с выносливостью, либо со скоростно-силовыми качествами [Ahmetov and Rogozkin, 2009]. Такая классификация ассоциаций со спортивной деятельностью была продемонстрирована для 36 генетических маркеров, локализованных в 20 аутосомных генах, митохондриальной ДНК и Y-хромосоме (Табл. 1.1.).
Несмотря на очевидную роль генетики в спортивной деятельности человека, влияние полиморфизма отдельного гена на релевантные фенотипы часто не выявляется. Данный факт может объясняться возможной ошибкой исследователей, которые не учитывают полный спектр факторов внешней среды в равной мере влияющей на конечный фенотип, а также малочисленностью выборок при проведении генотипирования [Brutsaert and Parra, 2006]. Однако основное объяснение связано с тем, что в процесс мышечной деятельности вовлечено множество полиморфных генов, каждый из которых в отдельности вносит лишь небольшой вклад (от 0.1 до 1%) в общее развитие физических качеств человека [Ахметов и др., 2008-3]. Таким образом, для выявления ассоциаций генотип — конечный фенотип требуются значительные размеры однородных выборок обследуемых, а также проведение генотипирования большого числа полиморфных участков генома, выбранных с помощью подхода «ген-кандидат». Необходимо использовать новые статистические комбинационные подходы для анализа суммарного вклада независимо действующих и взаимодействующих генов и выявления вклада различных сочетаний генотипов в развитие определенного фенотипического признака.
Однако до настоящего момента было проведено лишь незначительное количество исследований с целью оценки влияния множественных комбинаций генов на проявление тех или иных физических качеств человека [Ахметов и др., 2008-3; Ahmetov et al., 2008; Gomez-Gallego et al., 2008; Williams and Folland, 2008; Ahmetov et al., 2007; Saunders et al., 2006; Williams et al., 2004]. В мышечной деятельности человека, то есть в проявлении силы мышц и в их морфологии, определяющее значение имеют молекулярная регуляция мышечных процессов (транскрипционные факторы), а также структурная организация и ферментативные свойства сократительных белков, которые влияют на скоростно-силовую подготовленность спортсмена [Сологуб и Таймазов, 2000]. В настоящее время известны следующие генетические маркеры мышечной деятельности и различных признаков, характеризующих работоспособность мышц (мышечная сила и масса, анаэробные фенотипы): UCP2, PGC1A, PPARD, AR, AMPDJ, DIOl, GDF8, ACVR2B, MYLK, NR3CJ, TNF, CFTR, CNTF, CNTFR, IGF2, ACTN3, VDR, IGFJ, BDKRB2, COL1A1, АСЕ, RETN, PPARA, FS, PPP3R1 [Bray et al., 2009]. Помимо вопросов, связанных с самим поиском генетических маркеров мышечной силы и массы, существует проблема классификации аллелей в отношении их эффекта на какой-либо фенотип мышц [Ахметов и др., 2007-2]. Возникает необходимость выделения аллелей, ассоциирующихся с проявлением и развитием максимальной произвольной статической / динамической силы, взрывной силы и силовой выносливости, а также аллелей, предрасполагающих к выраженной саркоплазматической / миофибриллярной гипертрофии мышечных волокон. Вполне вероятно, что одни аллели генов могут иметь единичный эффект на какой-либо один из этих фенотипов, а другие — обладать множественным эффектом. Несомненно, важную роль играет генетический потенциал и в процессе адаптации к физическим нагрузкам. В таблице 1.2. представлены генетические маркеры, для которых была показана ассоциация с различиями в ответе на тренировку, развивающую выносливость либо скоростно-силовые качества.
Исследования R577X полиморфизма гена ACTN3 с помощью подхода «генотип-фенотип»
Для окончательного утверждения о наличии ассоциации между R577X полиморфизмом гена ACTN3 и мышечной деятельностью человека, необходимо выявить молекулярные механизмы, с помощью которых потеря а-актинина-3 влияет на функцию скелетных мышц [MacArthur and North, 2004]. Несколько возможных гипотез могут быть выдвинуты на основании известных функций саркомерных а-актининов:
Изменения сократительных свойств саркомеров мышечных волокон быстрого типа; 2. Влияние на детерминацию типа мышечных волокон или их гипертрофию за счет непрямых взаимодействий между а-актинином-3 и сигнальными белками, такими как кальциневрин; 3. Различия в степени устойчивости к мышечным повреждениям, вызванным тренировкой и в восстановлении после таких повреждений; 4. Изменение метаболических свойств мышечных волокон вследствие изменений во взаимодействии с ферментами метаболизма, такими как фруктозо-1,6-бифосфатаза или фосфорилаза. Все эти гипотезы не исключают одна другую, и возможно, действительный механизм - это комбинация нескольких таких процессов. Их эмпирическое подтверждение должно проводиться при помощи биохимических, физиологических и других методов, а также моделирования культур мышечной ткани in vitro [MacArthur and North, 2004]. Несколько одномоментных и динамических исследований, использующих подход «генотип-фенотип», подтверждают ассоциации R577X полиморфизма гена ACTN3 с мышечной деятельностью. Clarkson и соавторы показали, что женщины с гомозиготным генотипом 577ХХ имеют меньшую изометрическую силу по сравнению с гетерозиготами (Р 0.05), но демонстрируют большие абсолютный и относительный прирост динамической силы в сравнении с гомозиготами по 577R аллелю после 12- недельной тренировки (Р 0.05) [Clarkson and Devaney, 2005]. При этом обнаружена тенденция к дозовому эффекту: прирост силы был больше у носителей XX генотипа и наименьший у носителей RR генотипа. Анализ изменений, опосредованных генетическим влиянием, показал, что приблизительно 2% увеличения изометрической и динамической силы после тренировки связаны с R577X полиморфизмом гена ACTN3 (Р = 0.01) [Clarkson and Devaney, 2005]. Имеются данные об ассоциации R577X полиморфизма с силой мышц у пожилых людей [Roth et al., 2004]. Динамическая сила скелетных мышц ноги у носителей гомозиготного генотипа XX была достоверно меньше, чем у носителей R аллеля (Р 0.05). Более того, все показатели изокинетических измерений силы были значительно ниже в XX группе по сравнению с R носителями среди мужчин, но не среди женщин. Результаты других исследований также указывают на связь R577X полиморфизма с силой мышц и положительное влияние R аллеля на мышечные фенотипы [Delmonico et al., 2007; Moran et al., 2007; Walsh et al., 2008]. Однако есть и противоречивые результаты некоторых исследований, не обнаруживших какой-либо связи полиморфизма R577X с силой, ППС мышц и другими мышечными фенотипами [Delmonico et al., 2008; McCauley et al., 2009; San Juan et al., 2006]. Vincent и соавторы показали, что процентное содержание быстрых волокон типа Их было больше у носителей RR генотипа по сравнению с носителями XX генотипа в группе молодых здоровых мужчин [Vincent et al., 2007]. В последнем комплексном исследовании ассоциации R577X полиморфизма ACTN3 с составом мышечных волокон, силой мышц и экспрессией мРНК а-актинина-3 и а-актинина-2 у тренированных мужчин и женщин, не было выявлено какой-либо связи полиморфизма с силовыми характеристиками мышц и композицией их волокон [Norman et al., 2009]. Однако прирост пикового момента силы после силовой (изокинетической) тренировки наблюдался у носителей RR генотипа, но не у носителей XX генотипа, что может говорить о связи полиморфизма R557X с тренируемостью. В том же исследовании было выявлено, что уровень экспрессии гена ACTN2 зависел от содержания а-актинина-3 в быстрых мышечных волокнах, и это свидетельствует о компенсации отсутствия а актинина-3 и нейтрализации фенотипических последствий наличием белка а актинина-2. Обнаруженная ассоциация R577X полиморфизма ACTN3 у людей в определенной популяции может не наблюдаться в российской популяции и у российских спортсменов, что необходимо было проверить. Более того, понимание важной роли а-актинина-3 в поддержании целостности мышечного аппарата, а также противоречивые результаты исследований полиморфизма гена ACTN3 на немногочисленных выборках спортсменов определили одну из задач предстоящих исследований. Представленный обзор литературы показывает, что выбранные нами для изучения гены MYF6 и ACTN3 активно участвуют в регуляции процессов формирования скелетных мышц на эмбриональной стадии и адаптации мышечной ткани к физической активности у взрослого человека. В какой степени полиморфизмы этих генов отражаются на развитии и проявлении различных физических качеств во время мышечной деятельности различной метаболической направленности (анаэробной и аэробной) и влияют на фенотип скелетных мышц? Настоящее исследование было проведено для получения ответов на эти вопросы.
Метод магнитно-резонансной томографии и компьютерный анализ полученных изображений отдельных мышц
Исследования по изучению наследуемости физических качеств человека свидетельствуют о вкладе в мышечную деятельность факторов внешней среды и генетических факторов в различном соотношении. Расшифровка структуры генома человека и широкое использование методов молекулярной генетики открыли возможность выявления генетических маркеров, ассоциируемых с предрасположенностью к развитию и проявлению различных физических качеств (выносливость, быстрота, сила), а также к наращиванию мышечной массы в процессе многолетней тренировки. Такие знания необходимы для успешной спортивной деятельности и индивидуального подхода тренера к каждому спортсмену. Однако, по многочисленным причинам (см. гл. 1.1) обнаружение факторов генетической предрасположенности к мышечной деятельности все еще остается трудноразрешимой проблемой спортивной генетики.
Настоящее исследование базировалось на выборках из спортсменов разных специализаций и квалификаций и контрольной группы на предмет выявления между ними статистически значимых различий в частоте тех или иных генотипов и аллелей генов. Предполагалось, что значимо более высокая частота определенного генотипа/аллеля в группе спортсменов с характерным типом физической нагрузки и энергообеспечения мышечной деятельности по сравнению с контрольной группой, является свидетельством спортивного отбора на основе генетической предрасположенности.
В формировании конечных «спортивных» фенотипов (напримерa статус элитного стайера) могут участвовать тысячи различных генотипов в сочетании с определенными условиями среды, которые образуют промежуточные фенотипы [Ахметов, 2008-5]. Связь между генотипом и фенотипом более предсказуема и обоснована при изучении фенотипов ядерного (уровень экспрессии гена, метилированные участки ДНК и др.) и клеточного (концентрация белка в клетке, количество митохондрий и др.) уровней. Поиск ассоциации полиморфизмов исследуемых генов с рядом связанных друг с другом промежуточных фенотипов, а также с их изменениями в ходе систематической мышечной деятельности осуществляли на примере больших и малых выборок. Таким образом, выявление ассоциации полиморфизмов генов MYF6 и ACTN3 проводили с применением различных подходов — «случай-контроль», одномоментное поперечное исследование, динамическое продольное исследование при условии согласованности предлагаемой гипотезы с данными литературных источников. Выбор гена-кандидата MYF6 был обусловлен тем, что его белковый продукт, состоящий из 242 а.к., регулирует экспрессию множества генов, вовлеченных в формирование и функционирование скелетных мышц, а возможное обнаружение значимой вариации гена-регулятора по влиянию сопоставимо с суммирующим эффектом подчиненных ему белоксинтезирующих генов. Кроме того, результаты исследования экспрессии MYF6 указывают на его роль в гипертрофии мышц. Основой выбора исследования полиморфизма С964Т гена MYF6 послужила высокая частота встречаемости редкого С аллеля в популяциях мира. Данный SNP находится в З -нетранслируемой области гена. Известно, что фенотипические проявления SNP варьируют в зависимости от их локализации. SNP в регулятори ых областях генов (промоторе, 5 -UTR, З -UTR) не затрагивают структуры соответствующего продукта, т.е. не приводят к замене аминокислоты, и не изменяют его функциональную активность. Однако такие SNP могут влиять на экспрессию гена, что сопровождается количественными изменениями белка. Проявления данных мутаций определяются пороговым уровнем концентрации белка, при котором его функция еще сохраняется. Эффект на фенотип при нарушениях в регуляторных областях гена варьирует от низкого до высокого [Roth, 2007]. Методика определения С964Т полиморфизма гена MYF6 была разработана с использованием информационной генной базы данных NCBI, приложения «SNP» для идентификации мутации и программы «BLAST» для подбора праймеров. Для анализа использовали двухпраймерную систему: прямой праймер 5 - -3 и обратный праймер 5 - -3 . Экспериментально подобраны условия ПНР, позволившей амплифицировать фрагменты ДНК длиной 223 п.о. Для рестрикционного анализа применяли спецефическую эндонуклеазу рестрикции Sphl. Нами впервые получено распределение частот встречаемости генотипов и аллелей гена MYF6 у жителей России и Великобритании. Сравнение полученных результатов со значениями базы данных НарМар Project (NCBI) показало отсутствие различий в частоте встречаемости генотипов и аллелей гена MYF6 у жителей Санкт-Петербурга по сравнению с данными для европейской популяции. У жителей Великобритании частота встречаемости генотипа ТТ была на 8% выше, чем у жителей Санкт-Петербурга (статистически значимые отличия).
При анализе распределения частот генотипов и аллелей у российских спортсменов 13 видов спорта различных квалификаций и в контрольной группе статистически значимых различий между данными группами не обнаружено. Однако при анализе распределения в подгруппах спортсменов, выяснилось, что частота ТТ генотипа статистически значимо выше у спортсменов-стайеров (п = 135), основным физическим качеством которых для выполнения физических нагрузок является выносливость с проявлением умеренной мощности. Частота Т аллеля возрастала с ростом квалификации в данной подгруппе, что подтверждает благоприятствующее воздействие Т аллеля для развития физического качества выносливости (на уровне тенденции). В то же время частота встречаемости Т аллеля была ниже у конькобежцев и понижалась с ростом квалификации у спринтеров.
Ассоциация С964Т полиморфизма гена MYF6 с морфофункциональными показателями спортсменов
Естественно, необходимы повторные исследования для подтверждения связи R577X полиморфизма ACTN3 с выносливостью на больших объемах выборок и в разных этнических группах. Несмотря на то, что наши результаты указывают на негативное влияние отсутствия а-актинина-3 в видах спорта на выносливость, не исключено, что стайеры, имеющие данный белок в скелетных мышцах достигают высокого развития и проявления качества выносливости не только благодаря преимуществу в генерации сильных сокращений на высокой скорости, но и за счет аддитивного эффекта других генетических полиморфизмов, ассоциированных с выносливостью.
Исследование полиморфизма гена ACTN3 с помощью подхода «генотип-фенотип» позволило обнаружить некоторое подтверждение полученным данным исследования «случай-контроль».
При обследовании размера т. rectus femoris в большой гомогенной группе рекрутов Великобритании до и после смешанной тренировки не было выявлено статистически значимых отличий в исходном значении ППС мышцы, а также степени гипертрофии с учетом полиморфизма ACTN3. Отсутствие корреляции генотипа по ACTN3 с размером мышц у человека можно объяснить предполагаемой ролью а-актинина-3 в генерации силы мышечных сокращений. Мышцы могут не обладать большим размером, но быть сильными и мощными. К сожалению, силовые показатели рекрутов не регистрировались во время проведения эксперимента. Смешанный характер тренировки с низкой степенью гипертрофии (12%) не являлся эффективным для развития силы и мощности мышц. Возможно поэтому мы не обнаружили ассоциацию прироста т. rectus femoris с наличием или отсутствием а-актинина-3 в мышечных волокнах испытуемых. Результаты зарубежных исследований также не демонстрируют связь полиморфизма ACTN3 с размером мышц, а только с их силой [Clarkson et al., 2005; Roth et al., 2004; Delmonico et al., 2007; Moran et al., 2007; Walsh et al., 2008].
В другой экспериментальной выборке физически активных мужчин (55 человек) проводили исследование ассоциации размера и состава мышечных волокон в т. vastus lateralis. Размер быстрых и медленных волокон, а также их процентное соотношение не ассоциировались с носительством различных генотипов по ACTN3. Результаты одной из работ по исследованию R577X полиморфизма гена ACTN3 выявили ассоциацию R аллеля с более высоким содержанием быстрых гликолитических волокон типа Их [Clarkson et al., 2005]. В нашем исследовании иммуногистохимический анализ был проведен только для выявления медленных и быстрых волокон, без разделения быстрых волокон на подтипы.
Влияние полиморфизма гена ACTN3 на степень гипертрофии отдельных мышц бедра и мышечных волокон т. vastus lateralis в результате 8-недельной силовой тренировки разных типов проводили в группе физически активных здоровых мужчин. Экспериментальная группа была немногочисленной, поэтому носителя редкого XX генотипа в ней не было. Классическая силовая тренировка, приводящая к увеличению мышечной массы, МПС и скорости развития максимального усилия (взрывная сила), незначительно изменила состав мышечных волокон, при этом корреляции изменений композиции мышечных волокон после тренировки с генотипом по ACTN3 обнаружено не было. Тенденция к большему гипертрофическому эффекту, происходящему за счет увеличения объема быстрых мышечных волокон, наблюдалась у носителей RR генотипа, что можно объяснить локализацией в них полноценного белка а-актинина-3. Прирост МПС в ходе классической силовой тренировки наблюдался также в большей степени у носителей RR гомозиготного генотипа по ACTN3, что объясняется большей степенью гипертрофии быстрых мышечных волокон у носителей данного генотипа. Обнаружена ассоциация R577X полиморфизма со степенью гипертрофии отдельных мышц (на уровне тенденции). Значения увеличения объема т. quadriceps femoris при тренировке по классической схеме и т. gluteus max при статодинамической тренировке были выше у носителей RR генотипа по ACTN3 по сравнению с носителями гетерозиготного генотипа.
Таким образом, присутствие полноценного белка а-актинина-3 создает условия к повышенной степени гипертрофии мышц и мышечных волокон, что приводит к увеличению силовых показателей мышц. Обнаруженная ассоциация с тренируемостью согласуется с данными зарубежных исследований [Norman et al., 2009] и поддерживает полученные нами данные о связи полиморфизма гена ACTN3 со скоростно-силовым статусом у российских спортсменов, а также гипотезу о том, что присутствие в мышцах а-актинина-3 имеет благоприятный эффект на функционирование мышц при генерации сильных сокращений на большой скорости.
В нашей работе существуют ограничения, которые должны быть учтены в дальнейших исследованиях полиморфизмов генов и при практических рекомендациях. В качестве первого ограничения отметим выбор всего двух генов-кандидатов для выявления ассоциации с предрасположенностью к физической активности, что обусловлено стремлением изучить полиморфизмы генов на многочисленных выборках, обосновать полученные результаты с помощью подхода «генотип-фенотип» на разных уровнях, а также материально-техническими сложностями лаборатории. Однако в процесс физической деятельности вовлечено множество генов (полигения), каждый из которых в отдельности вносит лишь незначительный вклад в общее развитие физических качеств человека. Согласно математической модели, предложенной Yang и соавторами, на 50% какой-либо комплексный признак может зависеть от 10-20 полиморфизмов генов с умеренным эффектом и частотой редких генотипов 30% [Yang et al., 2005].
Во всех видах спорта одни лишь физические качества (быстрота, сила и выносливость) не являются определяющими конечный успех спортсмена. Одним из ограничений нашей работы, является также отсутствие учета психологических факторов. Психологические факторы, участвующие в высоких достижениях спортсмена, включают в себя психическую устойчивость, мотивацию, знание игры, тактическую проницательность, командную слаженность, статус зрелости, время принятия решения, степень выдерживания боли на тренировках и соревнованиях, стремление к победе [Lippi et al., 2008]. Все эти факторы являются генетически детерминированными и различаются у индивидов, внося до 62% вариабельности в спортивном поведении на тренировках и до 83% при участии на соревнованиях [Bryan et al., 2007].
