Введение к работе
Актуальность темы.
Изучение механизмов регуляции экспрессии генов в разных тканях многоклеточного организма является одной из наиболее актуальных задач современной молекулярной биологии. Важное значение для понимания этих механизмов имеет информация о структуре и эволюции некодирующих белок областей геномов, и прежде всего областей, содержащих участки связывания факторов регуляции транскрипции (в частности, 5'-фланкирующих областей генов, а также, по некоторым данным, интронов генов). Определение и сравнительный анализ нуклео-тидных последовательностей генов и прилежащих к ним районов геномов является основным способом получения такой информации.
Одной из наиболее привлекательных моделей для такого сравнительного анализа являются гены "минорных" белков, экспрессия которых является, как правило, тканеспецифической и находится под контролем различных факторов регуляции транскрішции. Тирозшшминотрансфераза (Ь-тирозшг2-оксоглутарат-аминотрансфераза, К.Ф. 2.6.1.5; далее ТАТ) - пиридоксальфосфат зависимый фермент, катализирующий переаминирование тирозина, является одним из таких белков, механизмы регуляции экспрессии гена которого в организме крысы детально изучены (Boshart et al, 1993; Мертвецов, 1990). Экспрессия гена этого белка является тканеспецифической и происходит в основном в печени, а именно в гепатоцитах. Уровень экспрессии регулируется посредством нескольких путей передачи межклеточных сигналов, в частности глюкокортикоидами и цАМФ. В 5'-фланкирующей области (до -6000 п.н.) гена ТАТ крысы были локализованы три ткапеспецифических энхансера транскрипции, два из которых взаимодействуют с комплексом глюкокортикоид-рецептор и фактором тканевой специфичности печени HNF3, а третий - с белком, активирующим цАМФ-зависимые сайты (CREB), и фактором тканевой специфичности печени HNF4, т.е. является цАМФ-зависимым (Shinomiya et al, 1984; Jantzen et al, 1987; Danesh et al, 1987; Grange et al, 1991; Boshart et al, 1993; Espinas et al, 1994). В то время как механизмы регуляции экспрессии гена ТАТ крысы изучены в деталях, для гена ТАТ человека в литературе нет данных о выявлении функциоїщрующих энхансеров, контролирующих экспрессию этого гена. Известны лишь небольшие фрагменты нуклео-тидной последовательности 5'-фланкирующей области гена ТАТ человека (Ret-tenmeier et al, 1990). Знаїше мехаїшзмов регуляции экспрессии гена ТАТ человека имеет, наряду с фундаментальным, важное медицинское значение, поскольку может позволить предотвращать или корректировать нарушения регуляции экспрессии гена ТАТ в процессе онтогенеза, приводящие к тяжелому заболеванию -тирозинемии.
Цели и задачи работы.
Целью настоящей работы являлось выявление функционально значимых участков и эволюциошю изменчивых районов гена тирозинаминотрансферазы путем сравнительного шгализа нуклеотидных последовательностей генов человека и крысы, включающих все экзоны и интроны гена, а также значительные по длине районы 5'- и 3'-фланкирующих областей. Ранее были определены нуклео-тидные последовательности фрагмента 5'-фланкирующей области от -3500 до -1900 п.н. (Rettenmeier et al, 1990), последовательности экзонов (Rettenmeier et al, 1990) и нитронов (Зелеівщ, Мертвецов, 1994) гена ТАТ человека; а также нуклео-тидная последовательность кДНК, экзон-шггронная структура.и карта сайтов эндонуклеаз рестрикции гена ТАТ крысы (Shinomiya et al, 1984; Grange et al, 1985; Hargrove et al, 1989). Таким образом в настоящей работе необходимо было решить следующие задачи:
определить неизвестную ранее ігуклеотидную последовательность геїи ТАТ крысы;
определить неизвестную ранее ігуклеотцщгую последовательность района от -1900 до -700 п.н. 5'-фланкирующей области гена ТАТ человека;
провести сравнительный анализ полученных ггуклеотидных последовательностей с использованием современных средств компьютерного анализа.
Научная новизна работы.
Определена неизвестная ранее нуклеотидная последовательность гена ТАТ крысы (более 12 000 п.н.). Установлены точные границы экзонов этого гена, в интронах выявлены повторяющиеся элементы. Определена неизвестная ранее ігуклеотидная последовательность 5'-фланкирующей области гена ТАТ человека от -1900 до -700 П.Н. В ней выявлены возможные сайты связывания факторов регуляции транскрипции и повторяющиеся элементы (в частности, повторы семейства Alu). Сравнительным анализом последовательностей генов ТАТ человека и крысы определена степень консервативности различных районов гена. Научно-практическая ценность работы.
Для определения ігуклеотидньгх последовательностей протяжешсьгх районов разработана схема субклонирования и секвенирования фрагментов гидролиза продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) эндонуклеазами рестрикции, позволяющая выявить и исключить ошибки, вносимые в процессе ПЦР ДНК-полимеразой. Для получения протяженных (более 5000 п.н.) продуктов ПЦР с высоким выходом предложено проведение реакции в присутствии высоких концентраций глицерина. Для очистки и контроля качества олигонуклеотидов-праймеров разработан оригинальный метод электрофореза с непрерывной элюци-ей и спектрофотометрической детекцией.
В процессе работы создан набор молекулярных зондов (клонированных в бактериальных векторах фрагментов генов, продуктов ПНР и олигонуклеотдов-праймеров для ПЦР) для различных областей генов ТАТ человека. Такие молекулярные зонды могут служить инструментом для дальнейших исследований, в частности анализа полиморфизма гена ТАТ в популяциях людей и выявления молекулярных основ тирозинемии. Публикации и апробация работы.
Результаты работы были представлены в виде докладов на Ш Всесоюзном съезде эндокринологов (Ташкент, 1989 г.), первой всесоюзной конференции "Геном человека" (Москва, 1989 г.), 7-м международном конгрессе по изофермен-там (Новосибирск, 7-12 сентября 1992 г.), 5-ой конференции "Геном человека-96" (п. Черноголовка, 15-18 января 1996 г.), 8-ой конференции "Геном человека-98" (п. Черноголовка, 12-15 января 1998 г.) и в виде стендовых сообщений па 10-м двустороннем Советско-французском симпозиуме "Физико-химические основы жизни" (Киев, 4-8 июня 1990 г.) и международной конференции HGM-98 (Турин (Италия), 28-30 марта 1998 г.). По материалам диссертации опубликовано 7 статей, из них 2 в зарубежных изданиях. Структура и объем работы.
Диссертация изложена на ІЬЬ страницах, содержит ZO рисунков, 2 таблицу список цитируемой литературы включает 132 ссыл№н Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, обсуждения результатов и выводов.
