Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
1.1. Актуальность проблемы 6
1.2. Цели и задачи 8
1.3. Основные положения, выносимые на защиту 9
1.4. Научная новизна 9
1.5. Теоретическое и практическое значение работы 10
1.6. Финансовая поддержка 10
1.7. Апробация диссертации 10
1.8. Публикации ...11
1.9. Объем и структура диссертации 11
2. Обзор литературы 12
2.1. Нуклеосомная организация хроматина 12
2.2. АТФ-зависимые ремоделирующие комплексы 15
2.3. Посттрансляционные модификации гистоновых молекул, связанные с процессом транскрипции 23
2.4. Стадия элонгации транскрипции, факторы элонгации 28
2.5. Организация хроматина кодирующих областей дерепрессированных генов 35
2.6. Заключение 40
3. Материалы и методы 41
3.1. Фрагментация ДНК в составе ядер ДНКазой I, ДНКазой II и микрококковой нуклеазой (МНазой) 41
3.1.1. Выделение клеточных ядер 41
3.1.2. Обработка ядерных суспензий МНазой, ДНКазой I и ДНКазой II..41
3.1.3. Фракционирование фрагментов хроматина после
МНазной фрагментации ДНК в составе ядер 42
3.1.4. Выделение ДНК и электрофоретический анализ длины фрагментов 42
3.1.5. SDS электрофорез белков фракций хроматина печени крыс в 18%ПААГ ...43
3.2. Получение и анализ фрагментов кодирующей области генов tat и to 43
3.2.1. Получение плазмидной ДНК из клеток E.coli,
трансформированных рекомбинантными плазмидами 43
3.2.1.1. Выделение плазмидной ДНК путем щелочного лизиса и очистки в градиенте плотности CsCl 43
3.2.1.2. Выделение плазмидной ДНК методом минипреп 43
3.2.2. Получение ДНК-зондов — фрагментов кодирующей области to и tat генов препаративным электрофореом в 6% ПААГ 44
3.2.3. Перенос фрагментов ДНК с геля на нитроцеллюлозную мембрану 44
3.2.4. Гибридизация фрагментов ядерной ДНК с сегментами кодирующих областей tat и to генов 45
3.2.5. Определение 5'- иЗ'- границ фрагментов МНазного переваривания to гена в ядрах клеток печени крыс 45
3.2.6. Дот-гибридизация ДНК из фракций хроматина печени крыс с сегментом кодирующей области гена to 45
4. Результаты 47
4.1. Получение ДНК-зондов - сегментов кодирующих областей генов tat и to.Al 4. 2. Анализ нуклеазной фрагментации ДНК кодирующих областей to и tat генов в ядрах печени и мозга взрослых крыс 51
4.2.1. Фрагментация ДНК кодирующей области to и tat генов микрококковой нуклеазой в составе ядер клеток печени и мозга крыс 52
4.2.2. Фрагментация ДНК кодирующей области to и tat генов ДНКазой I и ДНКазой II в составе ядер печени и мозга крыс 62
4.2.3. Фрагментация ДНК кодирующей области гена to микрококковой нуклеазой и ДНКазой І в ядрах клеток печени и мозга новорожденных крыс 70
4.3. Условия селективной экстракции фрагментов активных генов после МНазной фрагментации хроматина .74
5. Обсуждение результатов 80
6. Выводы 85
7. Список литературы 86
- Основные положения, выносимые на защиту
- АТФ-зависимые ремоделирующие комплексы
- Фрагментация ДНК в составе ядер ДНКазой I, ДНКазой II и микрококковой нуклеазой (МНазой)
- Получение ДНК-зондов - сегментов кодирующих областей генов tat и to.Al 4. 2. Анализ нуклеазной фрагментации ДНК кодирующих областей to и tat генов в ядрах печени и мозга взрослых крыс
Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы С развитием нуклеосомной концепции стали известны основные принципы упаковки ДНК в хроматине [Hewish, Burgoyne, 1973; Komberg, 1974; Mirzabekov et.al., 1983; Arents, Moudrianakis, 1993, 1995; Romberg, Lorch, 1999; Ong et.al., 2007]. Механизмы обратных процессов - декомпактизации нуклеосомных цепей для реализации ее матричных функций, остаются до конца не выясненными. В исследовании характера преобразования (ремоделирования) нуклеосом для транскрипции перспективным подходом является анализ нуклеазной фрагментации хроматина в составе ядер, позволяющий установить изменения в ДНК-гистоновых взаимодействиях. Регулярное чередование свободных и прочно связанных с гистонами участков ДНК в структурных единицах компактного (репрессированного) хроматина (нуклеосомах) определяет 200-п.н.
(пар нуклеотидов)-периодичность в распределении разрывов ДНК и достижение лимита реакции при переваривании свободных линкеров и выщеплении мононуклеосомных фрагментов [Hewish, Burgoyne, 1973; Noll, Kornberg, 1977; Drew, 1984; Wolffe, 1998].
Первым биохимическим показателем преобразования нуклеосомной структуры хроматина при дерепрессии генов явились данные о доступности внутрикоровой ДНК для ДНКазы I. При действии этого фермента не наблюдается образования мононуклеосом, вся ДНК кодирующих областей активных генов переваривается до кислоторастворимого материала [Weintraub, Groudine, 1976; Garel, Axel, 1978; Bloom, Anderson, 1978]. С использованием нового подхода для высокоточного анализа ДНК-гистоновой ассоциации in vivo, включающего иммунопреципитацию фрагментов хроматина tag-мечеными гистонами и сканирование преципитата на содержание ген-специфических сегментов [Lee et.al., 2004], было показано, что как промоторная ДНК, так и ДНК единиц транскрипции многих активных генов не связана с гистонами [Boeger et.al., 2003; Schwabish, Struhl, 2004; Lee et.al., 2004; Zhao etal., 2005]. О декомпактизации нуклеосом в участках транскрипции свидетельствуют и данные ультраструктурного анализа 70-х — 80-х годов [Hamkalo et.al., 1974; Franke et.al., 1978; Foe, 1978; McKnight et.al., 1978; Spring, Franke, 1981; Sheer, 1987].
Однако в хроматиновой оси транскрибируемых участков иммунохимическими методами выявляются все коровые гистоны [McKnight et.al., 1978]. Более того, ДНК кодирующих областей активных и компетентных к транскрипции генов, полностью расщепляемая ДНКазой I до кислоторастворимых продуктов, резистентна к действию микрококковой нуклеазы (МНазы) [Weintraub, Groudine, 1976; Bloom, Anderson, 1978; Garel, Axel, 1978].
По вопросу о том, соответствует ли характер протекции нуклеосомному типу организации хроматина, данные противоречивы [Simpson, 1991; Clark, 1995; Wolffe, 1998].
В первых исследованиях, проведённых на глобиновых и овальбуминовых [Weintraub, Groudine, 1976; Garel, Axel, 1978; Bloom, Anderson, 1978], а также p-PHK генах [Mathis, Gorovsky, 1976; Reeves, 1976; Piper et.al. 1976; Matsui, Busch, 1977] с использованием ещё техники гибридизации в растворе, не было обнаружено различий между активным и репрессированным их состояниями по скорости переваривания ДЫК МНазой и её распределению в спектре фрагментов, кратных структурной единице. В ряде работ отмечался более быстрый распад части активного хроматина до моно- и коротких олигонуклеосом [Bellard et.al., 1978; Постников и др., 1989; Nacheva et.al., 1989].
В последующих анализах при визуализации МНазных фрагментов большого числа активных генов методом блот-гибридизации были получены крайне пртиворечивые результаты [Cohen, Sheffery, 1985; Clark, 1995]. Так, существуют данные, подтверждающие как неизменность позиций нуклсосом и длины нуклеосомного повтора (по тесту МНазной чувствительности) в хроматине кодирующих областей при активации гена [Gottesfeld, Melton, 1978; Baer, Rhodes, 1983; Huang et.al., 1986; Boeger et al„ 2003], так и его удлинении или укорочении [Clark, 1995], существование нескольких фаз нуклеосомного устройства на экспрессируемой ДНК [Samal et al., 1981; Szent-Gyorgyi et.al., 1987; Simpson, 1991,]. Обнаружены нарушения нуклеосомной повторяемости МНазных разрывов [Simpson, 1991; Herrera et.al., 1997], а также продукция фрагментов монотонно убывающих по длине [Ness et.al.,1983; Widmer et.al., 1984; Rose, Garrard, 1984; Cohen, Sheffery, 1985; Stratling et.al., 1986; Conconi et.al., 1989; Perez-Ortin et al., 1987; Conconi, Ryan, 1993; Cavalli, Thoma, 1993].
Из всей совокупности данных следует, что значительная часть ДНК генов, программированных на экспрессию в специализированных клетках, устойчива к действию МНазы. Однако противоречивость результатов не позволяет придти к определенному заключению о характере распределения МНазочувствительных сайтов в их кодирующих областях. Кроме того, использование различных нуклеаз (ДНКазы I и МНазы) в анализе структуры активного хроматина привело к взаимоисключающим суждениям.
В качестве причин неоднозначности результатов рассматривают множественность состояний, в которых могут быть представлены индивидуальные гены и их участки в клеточной популяции [Toussaint et.al., 2005]. Одновременное присутствие в однотипных клетках репрессированной, компетентной и транскрибируемой форм показано для некоторых повторяющихся генных кластеров [Foe et.al., 1978; Conconi et.al., 1989; Dammann et.al., 1995; Fahy et.al., 2005; Toussaint et.al., 2005]. Того же можно ожидать для уникальных генов, индуцируемых к транскрипции от репрессированного состояния в интерфазе. Действие внутриядерных нуклеаз и протеаз во время инкубации ядер и потеря нативной конформации хроматина при накоплении одно- и двунитевых разрывов ДНК [Caplan et.al., 1987] создают дополнительные трудности в оценке наблюдаемых характеров его фрагментации экзогенными ферментами. Противоречивость данных по организации структурных единиц хроматина (нуклеосом) на различных ступенях активации гена не позволяет придти к определенному заключению о механизмах эукариотической транскрипции.
Удобной моделью для сравнения характера нуклеазной фрагментации в составе ядер активного и репрессированного хроматина являются гены to и tat [Schmid et al., 1982]. Эти гены представлены одной копией в геноме крыс. Их экспрессия тканеспецифична и две ступени активации разделены во времени. Состояние компетентности к транскрипции устанавливается только в предшественниках гепатоцитов на конечных стадиях эмбриогенеза и сохраняется при последующих клеточных генерациях. Транскрипция индуцируется в раннем постнатальном развитии [Schmid et al., 1982; Becker et.al., 1984; Shinomiya et.al., 1984]. Такая система регуляции to и tat генов исключает присутствие в клетках печени взрослых животных их репрессированных форм.
Основные положения, выносимые на защиту
Целью данной работы явился сравнительный анализ доступности ДНК в кодирующих областях to и tat генов для фрагментации МНазой, ДНКазой I и ДНКазой II, различающихся по механизму нуклеолитического действия, в активном, компетентном к транскрипции и репрессированном состояниях — в ядрах клеток печени и мозга новорождённых и взрослых крыс.
Для выполнения этой цели решались следующие задачи:
Получение ДНК-зондов — сегментов кодирующих областей to и tat генов из содержащих их рекомбинантных плазмид. Мечение ДНК-зондов флуоресцирующим агентом при амплификации в системе со случайными праймерами.
Сравнение длины фрагментов ДНК общего (репрессировнного) и активного {to и tat генов) хроматина, продуцируемых МНазой, ДНКазой I и ДНКазой II в ядрах клеток печени взрослых крыс при различных концентрациях ферментов.
Сравнение характера фрагментации гена to МНазой и ДНКазой І в репрессированном (в ядрах клеток мозга) и активном (ядрах клеток печени) состояниях.
Сравнение длины фрагментов гена to, продуцируемых МНазой и ДНКазой I в компетентном к транскрипции (в ядрах клеток печени новорождённых крыс) и репрессированном (в ядрах клеток мозга) состояниях. Фракционирование хроматина - разработка условий избирательной экстракции фрагментов активных генов из МНазных гидролизатов ядер клеток печени крыс.
Анализ длины ДНК и белкового состава фракций фрагментов, выходящих в солевые растворы различного состава.
Определение степени обогащения полученных фракций ДНК активных генов с использованием методов дот- и блот-гибридизации с сегментом кодирующей области гена to.
На всём протяжении кодирующих областей to и tat генов как в компетентном к транскрипции, так и в активном состояниях, не обнаруживается нуклеосомньгх устройств - цепей нуклеазорезистентных компактных частиц, разделенных сегментами свободной ДНК (межнуклеосомными линкерами).
В кодирующей области гена to в компетентном к транскрипции состоянии отсутствуют сайты ДНК, доступные для МНазной фрагментации. Включение транскрипции приводит к появлению нерегулярных МНазочувствительных участков, которые, возможно, фланкируют элонгирующие РНК полимеразы.
ДНК единиц транскрипции активированных (компетентных к транскрипции) и активных to и tat генов чувствительна к ДНКазе I: при распаде общего хроматина под действием ДНКазы I до мононуклеосом (достижении лимита нуклеазного переваривания) to- и tat-ДНК переходит в кислоторастворимую форму.
По характеру фрагментации хроматина дерепрессированных to и tat генов ДНКаза II сходна с МНазой.
Фрагменты кодирующей области гена to, образующиеся в ядрах клеток печени при действии МНазы, осаждаются в инкубационной среде. Раствор средней ионной силы, содержащий ионы пирофосфата и Mg2+ (ПФР, [Прияткина и др., 1997]), эффективен в экстракции полноразмерных единиц транскрипции to, их сегменты удерживаются в нерастворимом ядерном осадке. Степень обогащения нуклеотидными последовательностями гена to растворимой в ПФР и осаждающейся фракциях близка к 50-кратной (в сравнении с суммарным хроматином).
Впервые показано, что преобразование (ремоделирование) нуклеосомной структуры хроматина на всём протяжении кодирующих областей to и tat генов предшествует инициации транскрипции. В in vivo ремоделированной форме повторяющиеся структурные единицы хроматина не подразделяются на "коровую" и
линкерную области, различающиеся по доступности ДНК к нуклеазам. На протяжённых участках вся внутринуклеосомная ДНК расщепляется ДНКазой I и, одновременно, не обнаруживает сайтов для МНазных разрывов, соответствующих межнуклеосомным линкерам.
Полученные данные вносят вклад в решение ряда актуальных проблем молекулярной биологии, касающихся механизмов эукариотической транскрипции, организации нуклеогистоновой матрицы, формирования активной конформации хроматина (компетентного к транскрипции состояния), как одной из стадий многоступенчатого процесса их активации. Результаты проведенньгх исследований могут оказаться полезными в таких областях практической молекулярной биологии и экспериментальной медицины как регуляция экспрессии чужеродных генов в эукариотических клетках, продукция терапевтических белковых препаратов и др., развитие которых имеет большое значение в лечении наследственных заболеваний.
Материалы диссертационной работы используются в курсе лекций по структурно-функциональной организации хроматина для магистров кафедры биохимии биолого-почвенного факультета СПбГУ. Грант Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов и молодых специалистов 2003 года, АСП 303305. Грант Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов 2005 года, АСП 305201.
Материалы диссертации были представлены на XVIII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001), на международном симпозиуме «Biological mobility: new trend in research» (Пушино, 2001), 2-ой конференции Московского Общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Москва, 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж. 2004), 8-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), XV Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005), Девятой Всероссийской Медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006), IV съезде Всероссийского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск. 2008), на научном семинаре кафедры биохимии биолого-почвенного факультета СПбГУ (Санкт-Петербург, 5.12.2008).
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 103 страницах, содержит 2 таблицы и 23 рисунка. Список литературы включает 218 источников.
АТФ-зависимые ремоделирующие комплексы
Упаковка ДНК в нуклеосомы является препятствием для осуществления матричных функций ДНК при репликации и транскрипции. Анализ изменений нуклеосомной структуры регуляторных и кодирующих областей генов на различных стадиях их активации остаётся одной из горячих точек в современных исследованиях механизмов эукариотической транскрипции. Прогресс в этой области знаний связан с успехами дрожжевой генетики, развитием систем in vitro транскрипции и анализа эффектов белковых факторов на моно- и олигонуклеосомные устройства, сконструированные на регуляторных участках различных генов, а также эффективных методов биохимического анализа ДНК-гистоновой ассоциации in vivo [Perez-Martin, 1999; Peterson, 1995].
Особенно информативным оказался генетический подход - скрининг мутаций, направленный на идентификацию генов, продукты которых требуются для активации генов, а также мутаций, супрессирующих дефекты в активации, и синтетических леталей [Peterson, 1995; Perez-Martin, 1999]. Наиболее продуктивными оказались скрины мутаций, влияющих на экспрессию двух индуцибельных ho и sue генов [Neigeborn, Carlson, 1984; Stern et.al., 1984] и мутаций, супрессирующих дефекты транскрипции lys2 и his4 [Simchen et.al., 1984], связанные с инсерцией транспозона TY в их промоторные области (SPT, SupPressors 7y) [Izban, Luse et.al., 1992].
В лаборатории Херковица [Peterson, Hercowitz, 1992] первоначально были идентифицированы swi\, sw il, swi3 гены как позитивные регуляторы ho, кодирующего эндонуклеазу, которая инициирует переключение (switching) типа спаривания дрожжевых клеток [Stern et.al., 1984]. Отсутствие продуктов любого из этих генов приводило к 50-100-кратному снижению внутриклеточного содержания Ио-мРНК и дефектам в переключении типа спаривания. Параллельные исследования в лаборатории доктора М. Карлсон [Neigeborn, Carlson, 1984] также привели к идентификации трех генов: snfl, snfi, snfb (Sucrose TVbnFermentors) как позитивных регуляторов гена sue, кодирующего инвертазу (инвертазная активность в дрожжах необходима для утилизации сахарозы). Эта группа генов обнаружила ряд особенностей. Их продукты были необходимыми для экспрессии определённого набора дрожжевых индуцибельных генов [Peterson, Herskowitz, 1992]. Мутации в любом из них приводили к одному и тому же дефектному фенотипу и, наконец, транскрипционные дефекты в мутантных штаммах супрессировались мутациями в генах, кодирующих структурные белки хроматина или компоненты системы транскрипции (SIN, SwiiMlependent и SSN, Suppressors of SNF mutations). Так, Sinl оказался одним из двух генов, кодирующих гистон НЗ, sin2 — аллелью гена HMG1-подобного белка. Все супрессирующие мутации в гене НЗ выражались в одной аминокислотной (АК) замене в узкой области полипептидной цепи НЗ от 104 до 120 АК-остатка. Другая серия, из 10 Sm-мутантов, имели замену в одной из двух позиций Н4 -V44 или R46 [Perez-Martin, 1999]. 2 гена spt оказались аллелями htal и ЫЫ генов, кодирующих гистоны Н2А и Н2В, соответственно; sptl5 - ген ТАТА-бокс-связывающего белка (ТВР) [Peterson, 1995].
Эти особенности и детальный генетический анализ мутантов привели к предположению, что продукты всех шести генов функционально связаны и, возможно, действуют в составе одного мультисубъединичного комплекса. Секвенирование ДНК показало, что swi2 и snf2 представляют один и тот же ген, названный swi2/snf2 [Laurent et.al., 1991]. Swil и swi3 оказались неэквивалентны snfb и sn/Б генам [Laurent et.al., 1993; Peterson, 1995; Perez-Martin; 1999].
Swi2/snf2 кодирует белок в 200 кДа, обладающий АТФазной активностью. АТФазный домен (около 600 центральных аминокислотных остатков) включает семь высоко консервативных мотивов аминокислотной последовательности, характерных для известных ядерных ДНК-стимулируемых АТФаз [Khvary et.al., 1993, Cairns et.al., 1994; Becker, Horz, 2002]. Из дрожжевых клеток, экспрессирующих tag-модифицированный для аффинной хроматографии и иммунопреципитации белок SWI2/SNF2, был изолирован
высокоочнщенный белковый комплекс с молекулярной массой около 2-х МДа, включающий 10 — 12 компонентов: продукты генов swil, swi2/snf2, swi3, snfi и snjb и ещё 5 белков, не идентифицируемых при мутантном анализе [Peterson, 1995; Perez-Martin; 1999]. АТФазная (swi2/snf2) субъединица комплекса оказалась главным действующим компонентом в процессе ремоделирования нуклеосомной структуры [Laurent е.а. 1993, Khvary et.al.,1993, Cairns et.al., 1994; Peterson, 1995, Becker, Horz, 2002].
С использованием генетических и биохимических подходов было установлено, что хроматин-ремоделирующне комплексы, содержащие АТФазу, гомологичную swi2/snf2 (принадлежит семейству DEAD/H ядерных ДНК-стимулируемых АТФаз [Eisen et.al., 1995]), представлены в клетках дрожжей и высших организмов множеством эволюционно консервативных форм, различающихся по субъединичному составу, внутриклеточному содержанию, значению для выживания [Hartzog et.al., 2002]. Наблюдаемая дивергентность белковых ансамблей одного функционального назначения, возможно, отражает многообразие путей регуляции генетической активности и процессов, требующих ремоделирования нуклеосомной структуры хроматина (репликации, транскрипции, рекомбинации или репарации ДНК). На сегодняшний день АТФ-зависимые хроматин-ремоделирующие комплексы подразделяют на 4 класса: SWI/SNF, ISWI (Imitation SWItch), CHD (Chromodomain Helicase DNA-binding) и INO80 (от Inositol). Известные характеристики комплексов и их субъединиц представлены в Таблице 1.
Фрагментация ДНК в составе ядер ДНКазой I, ДНКазой II и микрококковой нуклеазой (МНазой)
Препараты ядер получали из клеток печени и мозга беспородных белых крыс (взрослых и новорожденных). Охлажденную во льду ткань промывали раствором 1 (0,05 М трис-HCl буфер, рН 7,5; 0,025 М КС1; 0,005 М MgCl2 и 0,25 М сахароза, ТКМ [Maggio et.al., 1963]), измельчали в ледяной суспензии ТКМ и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в десятикратном по отношению к исходной массе ткани (т) объёме (v) ТКМ. Гомогенат фильтровали через капроновый фильтр и центрифугировали при 1000 g в течение 10 минут. Осадок промывали тем же раствором (1:10 w/v) и суспендировали в двукратном по отношению к исходной массе ткани объеме раствора 1, содержащем 0.5% или 0.25% тритона Х-100 для взрослых и новорожденных животных, соответственно. Суспензию выдерживали в течение 10 минут в ледяной бане, после чего разбавляли раствором 1 в 5 раз и центрифугировали при 1000g в течение 10 минут. Плотный белый осадок ядер промывали 2 раза раствором 1 (1:10 w/v) и 1 раз раствором 2 (10 мМ трис, 3 мМ СаС12, рН 7,5). При всех промывках ядерные осадки суспендировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком и центрифугировали при 1000g 7-10 минут.
Все операции по очистке ядер проводили при температуре около 0С. Промывающие растворы предварительно охлаждали до -1С - -2С, гомогенизацию осадков начинали в разбавленной ледяной суспензии промывающего раствора. Чистоту и целостность ядер в полученных препаратах контролировали под световым микроскопом. Из полдученных при таких условиях препаратов ядер ДНК не выходит в водную фазу при стандартных условиях фенолыюй депротеинизации. Для полного выхода оказалось достаточным 10-15 мин инкубации ядер в отсутствии добавленных ферментов. Это различие в эффективности освобождения ДНК в водную фазу, вероятно, связано с её фрагментацией по ГЧ-сайтам эндогенными ферментами в процессе инкубации. Обработка ядерных суспензий МНазой, ДНКазой I и ДНКазой II
Для действия МНазы ядерные осадки суспендировали в 0,01 М трис-HCl буфере рН 7,5, содержащем 1,5 мМ СаС12. (1:2, m:v). К суспензии, охлаждённой до 0С - 2С, добавляли МНазу («Sigma», 10-360 А2бо ед. на 1 мг ДНК). Пробы помещали в водяную баню с температурой 20С на 10 - 15 мин. Обработку ДНКазой I («Sigma») и ДНКазой II («Sigma») проводили при тех же условиях в растворе ТКМ, разведённом в 2 раза (для ДНКазы I) или в 0,01 М трис-HCl буфере, рН 7,5, содержащем 0,8 мМ MgCL2 (для
ДНКазы II). Во все инкубационные растворы добавляли ингибитор протеиназ — PMSF («Sigma») до концентрации 1 мМ. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ, ЭГТА до 1 мМ и SDS до 0.5 %. Контрольные пробы инкубировали при температуре 20С 15 минут без добавления нуклеаз.
Фракционирование фрагментов хроматина после МНазной фрагментации ДНК в составе ядер
Препараты очищенных ядер из клеток печени крыс инкубировали с МНазой (40 А260 ед. на 1 мг ДНК). Гидролизат охлаждали в ледяной суспензии и центрифугировали при 3000 g в течение 20 мин для разделения фрагментов хроматина, растворимых (Si) и осаждающихся (Oi) в среде инкубации с МНазой. Осадок Oi промывали дважды раствором изотонической сахарозы, содержащим 2 мМ ЭДТА и 1 мМ ЭГТА (5:1 m:v, m -масса исходной ткани) и супернатанты объединяли (S2). Промытый осадок экстрагировали раствором ПФР (0,05М трис-HCl буфере рН 7,5, содержащий 0.04 М тетрапирофосфата натрия, 0.005 М MgCb и 0.2 М NaCl [Прияткина и др., 1997]). Экстракцию вели в течении 30 минут в ледяной бане с периодической ручной гомогенизацией (тефлон-стекло). Растворимые (S3) и осаждающиеся (Оз) в этих условиях фрагменты хроматина разделяли центрифугированием (6000g, 30 мин). Конечный осадок (Оз) суспендировали в растворе 0.25 М сахарозы с 10 мМ ЭДТА. К растворимым фракциям добавляли ЭДТА до концентрации 10 мМ и хранили при -20С.
ДНК из ядер, нуклеазных гидролизатов и фракций фрагментов хроматина выделяли
с помощью фенольной депротеинизации (в смеси фенола и хлороформа в соотношении 4:1) в стандартных условиях [Маниатис и др., 1984] с использованием обработки протеиназой К («Sigma») и РНКазой (по 200-400 мкг/мл) [Salus, 1990] в 0,05 М tris-HCl буфере, рН 8,0, содержащем 0,5% SDS, 0,2 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 2 мМ ЭГТА при 37С в течение двух часов. ДНК осаждали этанолом при -20оС и растворяли в буфере ТЕ [Маниатис и др., 1984].
Фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в горизонтальном 1 % агарозном геле (7 см/8 см/0.4 см) в буфере ТАЕ (0.04 М трис-ацетат, 0.002 М ЭДТА). Для выявления ДНК в агарозный гель вводили бромистый этидий до конечной концентрации 0.4 мкг/мл. В карманы геля вносили раствор, содержащий 3 — 10 мкг ДНК, краситель бромфеноловый синий и утяжелитель (20% глицерин). В качестве стандартов использовали 1 kb Ladder, ДНК фага X, рестрицированную Hindlll и Hindlll/EcoRI. Электрофорез проводили при 50 W в течение 2.5 часов. Электрофорез прекращали, когда бромфеноловый синий проходил 2/3 длины геля. Полосы визуализировали в ультрафиолетовом свете на приборе "ФЛУСКОП -2" при длине волны 310 нм. Гель фотографировали на фотопленку «Микрат - 300» или цифровой фотоаппарат. Для анализа фрагментов ДНК в денатурирующих условиях образцы ДНК денатурировали кипячением, охлаждали выдерживанием в ледяной суспензии и разделяли в 6% ПААГ (соотношение акриламид: бисакриламид 30:1) в буфере ТВЕ. В гелевый и электродный буфер добавляли мочевину до конечной концентрации 7 М. 3.1.5. SDS электрофорез белков фракций хроматина печени крыс в 18% ПААГ Фрагменты хроматина осаждали ацетоном (3:1, v.w), растворяли в лизирующем буфере (0,35 М сахароза, 10% РМЭ, 5% SDS 0,063 М трис-HCl буфер с рН 6,8) и выдерживали 5-Ю мин в кипящей водной бане. Белки разделяли SDS-диск электрофорезом в 18% ПААГ в пластинах размером 120x120x1,5 мм по методу Томаса и Корнберга [Thomas, Kornberg, 1975] при напряжении 50 V в течение 18-20 часов. Гели фотографировали в проходящем свете на фотопленку «Микрат-200».
Получение ДНК-зондов - сегментов кодирующих областей генов tat и to.Al 4. 2. Анализ нуклеазной фрагментации ДНК кодирующих областей to и tat генов в ядрах печени и мозга взрослых крыс
Если в кодирующих областях компетентных или экспрессируемых to и tat генов сохраняется нуклеосомная организация хроматина, то конечными продуктами его нуклеазной фрагментации будут мононуклеосомы или их модифицированные формы -лексосомы [Allfrey et.al., 1964; Simpson, 1991, Genealogy, 2007]. Для определения длины нуклеазорезистентных участков (всех вариантов распределения в кодирующих областях доступных к нуклеазному перевариванию сайтов) ядра инкубировали при насыщающей концентрации ферментов. Для выявления нуклеазочувствительных зон использовали широкий диапазон их концентраций.
Мы установили значение насыщения, когда дальнейшее повышение концентрации нуклеазы в ядерной суспензии не приводило к заметным изменениям в спектре продуцируемых фрагментов общей ДНК. Такой лимит в переваривании общей ДНК в составе ядер достигался при 120 - 150 А260 ед.Лмг ДНК МНазы (Агбо ед.), 120 - 160 и 1200 Kunits/Імг ДНК (KU) для ДНКазы I и ДНКазы II, соответственно. Количество образующихся кислоторастворимых продуктов при достижении этого лимита оказалось крайне низким (от 1 до 3%) для всех трёх нуклеаз.
Фрагменты генов to и tat в суммарной ДНК нуклеазных гидролизатов выявляли с помощью блот-гибридизации. В качестве зондов использовали сегменты их кодирующих областей - зонд ТАТ1 с координатами (+800/+3700 п.н.) и ТОЇ (+5000/+8300 п.н.). Высокая чувствительность используемого метода детекции ДНК в гибридах (около 50 fg флуоресцентно меченой ДНК) позволяет визуализировать все зоны гибридизации одиокопийного гена при электрофоретическом разделении 5-10 мкг общей ДНК. Мы проводили прямое сравнение длины фрагментов в одном и том же геле общего (отражающего репрессированное состояние) и активного (to и tat генов в ядрах печени) хроматина, а также фрагментов гена to в репрессированном (в ядрах мозга) состоянии, образующихся под действием МНазы, ДНКазы I и ДНКазы II.
Фрагментация ДНК кодирующей области to tat генов микрококковой нуклеазой в составе ядер печени и мозга крыс.
Рис. 4. демонстрирует типичную картину расщепления ДНК хроматина печени и мозга крыс при концентрации МНазы 120 Агбо ед. При этих условиях большая часть общего хроматина переваривается преимущественно до моно- и динуклеосом (А, дор. 3 и 4). При этом в спектре фрагментов отчетливо выявляется пик высокополимерной ДНК (А, дор. 3 и 4, верх). Это указывает на существование фракции, устойчивой к действию МНазы. Результаты гибридизации фрагментов с зондом ТОЇ (рис 4, Б) оказались неожиданными. При условиях, когда в репрессированном хроматине МНазные разрывы ДНК реализуются в каждом или, реже, в каждом втором межнуклеосомном линкере, в гидролизатах ядер печени сохраняются протяжённые (от 1500 до 20000 п.н.) фрагменты гена to (рис. 4, Б, дор. 3), часть из которых сопоставима с величиной его единицы транскрипции (около 20000 п.н.). В ядрах мозга (в репрессированном состоянии) (Б, дор. 4) тот же ген расщепляется на моно- и динуклеосомные фрагменты, как и общий хроматин (А, дор. 4; В, дор. 3 и 4).
Чтобы определить 5 - и 3 - границы МНазоустойчивых зон на нуклеотидной последовательности гена to в ядрах печени, мы использовали метод непрямого мечения концов ДНК [Nedospasov, Georgiev, 1980]. Единица транскрипции to, длиной 19000 п.н., содержит одиночный Xhol сайт рестрикции на расстоянии +7800 п.н. [Shmid et.al., 1982] и делит зонд ТОЇ (встроен по EcoRI сайтам) на 2 сегмента (EcoRI/ Xhol, длиной 2800 п.н. и Xhol/ EcoRI, длиной 500 п.н. (рис. 5, А). Выделенные ДНК ядер печени (инкубированных без МНазы) и МНазных гидролизатов рестрицировали Xhol и образующиеся фрагменты гибридизовали последовательно с зондами ТО-1,2800 и ТО-1,500 (рис. 5, А). Как видно из рис. 5, В, Г, дор. 1), в ядрах, необработанных МНазой, длина фрагментов to превышает размеры его единиц транскрипции. Фрагменты Xhol рестрикции, гибридизующиеся с зондом ТО-1,2800, имеют длину около 10000 п.н. (В, дор. 2). Сходные по длине фрагменты сохраняются и в лимите МНазного переваривания ядерной ДНК (В, дор. 4). Длина фрагментов гена to от Xhol сайта рестрикции в 3 -направлении составляет около 20000 п.н. (Г, дор. 2). Такие длины не выявляются после интенсивного МНазного переваривания ядер, видимые фрагменты имеют длину от 10000 до 6000 п.н. (Г, дор. 4). Хотя используемая система электрофореза не является оптимальной для анализа фрагментов такой величины, представленные данные указывают на то, что разрывы под действием эндогенных ядерных ферментов при выделении ядер, вероятно, происходят в проксимальной части 5 -фланга, содержащей 3 сильных сайта нуклеазной гиперчувствительности [Becker etal., 1984], и в дистальных частях З -фланга. Наблюдаемая максимальная длина фрагментов в 5 - и 3 - направлении от Xhol сайта рестрикции (около 10000 п.н.) (В и Г, дор. 4) показывает, что в МНазных гидролизатах ядер клеток печнени сохраняются полноразмерные единицы транскрипции гена to.
