Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Общие сведения о строении и функциях кожи 11
1.2. Общие сведения о возрастных изменениях организма человека .20
1.3. Особенности старения кожи 25
1.4. Морфологические изменения дермы в процессе старения .28
1.5. Иммуногистохимические маркеры клеток и кровеносных сосудов дермы человека 34
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 39
2.1. Характеристика исследуемого материала .39
2.2. Забор и первичная обработка материала 41
2.3. Методы исследования .40
2.3.1. Выявление клеток, положительно окрашивающихся на PCNA в дерме 41
2.3.2. Выявление CD45 – положительных клеток в дерме 42
2.3.3. Выявление тучных клеток в дерме 43
2.3.4. Выявление эозинофилов в дерме 2.3.5. Выявление кровеносных сосудов, положительно окрашивающихся на фактор Виллебранда в дерме 44
2.3.6. Выявление кровеносных сосудов, положительно окрашивающихся на антиген CD31 в дерме 44
2.3.7. Выявление фибробластов дермы 45
2.4. Обработка результатов исследования .45
2.4.1. Количественная оценка результатов .45
2.4.2. Статистическая обработка результатов 46
ГЛАВА 3. Результаты исследований .49
3.1. Фибробласты дермы в различные возрастные периоды .49
3.2. PCNA–положительные клетки в дерме в различные возрастные
периоды 59
3.3. Тучные клетки в дерме в различные возрастные периоды .68
3.4. CD45–положительные клетки в дерме в различные возрастные периоды 77
3.5. Кровеносные сосуды с положительной окраской на CD31 в различные возрастные периоды 3.6. Кровеносные сосуды дермы с положительной окраской на фактор Виллебранда в различные возрастные периоды 94
3.7. Клетки, положительно окрашивающиеся на главный основной белок эозинофилов, в дерме человека в различные возрастные периоды 100
ГЛАВА 4. Обсуждение 102
Выводы .111
Список сокращений 112
Список литературы
- Особенности старения кожи
- Выявление клеток, положительно окрашивающихся на PCNA в дерме
- Количественная оценка результатов
- Кровеносные сосуды с положительной окраской на CD31 в различные возрастные периоды
Особенности старения кожи
Дерма, как часть кожи, представлена волокнистой соединительной тканью, имеет мезенхимальное происхождение, содержит клетки (фибробласты, тучные клетка, клетки костномозгового происхождения, макрофаги, лейкоциты, пигментные клетки) и внеклеточный матрикс (коллагеновые, эластические и ретикулярные волокна), который представлен основным веществом и погруженными в него волокнами [40, 98]. Ее разделяют на сосочковый слой, состоящий из рыхлой волокнистой соединительной ткани, который в основном содержит клетки и небольшое количество внеклеточного матрикса, и сетчатый слой, образованный плотной волокнистой тканью, содержащей небольшое количество клеток и большое количество коллагеновых волокон, выполняющих опорную функцию.
Границей между этими двумя слоями считается субпапиллярное сплетение кровеносных сосудов, расположенное в горизонтальной плоскости [1]. Однако некоторые авторы считают, что условная граница между ними проходит на уровне расположения концевых отделов сальных желез [6]. Также в дерме расположены волосяные фолликулы, потовые и сальные железы, кровеносные и лимфатические сосуды и нервные окончания [40].
Клетки дермы по признаку постоянства делятся на два вида. Резидентные клетки пребывают в дерме постоянно. К ним относят фибробласты и эндотелиоциты кровеносных и лимфатических сосудов. Блуждающие клетки мигрируют в дерму из крови. К ним относят тучные клетки, макрофаги и лейкоциты [146].
Фибробласты составляют основную массу клеток дермы и имеют мезенхимальное происхождение. Большая часть фибробластов резидентные, но другая их часть образуется в результате миграции гемопоэтических стволовых клеток из костного мозга в дерму [135]. Считается, что основная функция фибробластов – это продукция компонентов внеклеточного матрикса, включающих коллаген, эластин, фибронектин, гликозаминогликаны, протеогликаны и другие. К другим функциям фибробластов относят поддержание гомеостаза в дерме за счет выработки цитокинов, факторов роста и ферментов, в том числе ферментов, разрушающих коллаген [35]. Морфологически фибробласты представлены клетками округлой или вытянутой формы. По степени зрелости они делятся на юные, дифференцированные и фиброциты. Незрелые клетки, начиная с юных форм, последовательно дифференцируются, достигая зрелых форм. При этом фазы покоя и пролиферации фибробластов зависят от многих медиаторов и цитокинов, таких как IL-1, IL -1 и IL -8 [186]. Юные (малодифференцированные) фибробласты с небольшим количеством отростков имеют крупное ядро и равномерно распределенную по всему объему цитоплазму. В связи с небольшим размером, а также сохранением способности к пролиферации, юные фибробласты имеют способность к направленной миграции в очаг повреждения, где участвуют в репаративных процессах [122]. При этом основными факторами, привлекающими юные фибробласты, являются продукты распада коллагена [186].
Дифференцированные фибробласты по сравнению с юными имеют крупные размеры, содержат крупное овальной формы ядро и большее количество цитоплазмы. Их также характеризует наличие большого количества отростков, способность изменять свою форму и хорошая подвижность. Обратимо прикрепляясь к компонентам внеклеточного матрикса, они участвуют в продукции, перестройке и частичном разрушении межклеточного вещества. За счет сбалансированности этих процессов в дерме поддерживается химический гомеостаз и упорядоченная пространственная ориентация коллагена.
Фиброцит – это зрелая форма фибробласта, в основном функционально неактивная. Фиброцит имеет веретенообразную форму, вытянутое, расположенное вдоль клетки ядро. Роль данных клеток связана с поддержанием тканевой структуры дермы и регуляцией метаболизма за счет медленного, хотя и непрерывного, обновления внеклеточного матрикса [112]. Тучные клетки дермы происходят из полипотентной гемопоэтической клетки, но окончательную дифференцировку проходят в дерме [94]. Эта дифференцировка происходит из полипотентной стволовой клетки, экспрессирующей антигены CD34 и С-kit, которая под действием интерлейкина-3 и фактора стволовых клеток (SCF) трансформируется в предшественника тучной клетки, попадающего в системный кровоток. Из крови под действием хемоатрактантов, таких как ламинин, фактор стволовых клеток, IL-3, синтезируемых фибробластами, кератиноцитами и эндотелиальными клетками, эти клетки попадают в дерму. А уже в дерме под действием SCF, IL-3, IL-4, IL-10 и других цитокинов происходит их окончательная дифференцировка. В дальнейшем они утрачивают антиген CD34 и начинают синтезировать FcRI, который является рецептором для иммуноглобулина Е [97]. По ходу созревания тучных клеток происходит накопление гранулами нейтральных протеаз, таких как триптаза и химаза, являющихся наиболее надежными маркерами этих клеток. Общепринято, что тучные клетки имеют и пролиферативный потенциал, хотя и ограниченный [100].
В дерме наибольшая концентрация тучных клеток отмечается в сосочковом слое, а также вокруг кровеносных сосудов. Такое расположение характерно для всех соединительнотканных тучных клеток. Их развитие не зависит от факторов, которые продуцируют Т-лимфоциты, и они характеризуются большим содержанием гистамина [125]. Кроме того, они располагаются вокруг придатков кожи и нервных окончаний дермы, с которыми они формируют тесные контакты.
Выявление клеток, положительно окрашивающихся на PCNA в дерме
В возрасте 21-30 лет (группа 5) количество фибробластов в дерме несколько больше, чем в предыдущей группе (рисунок 5). Так, на 1 мм2 среза ткани дермы содержится 2606,09 ± 792,05 клеток. Клетки, в основном, расположены небольшими нечетко сформированными группами, распределены равномерно во всех слоях дермы, с большим количеством межклеточного вещества. Количество фибробластов, расположенных под эпидермисом, примерно такое же, как в сетчатом слое и окружающих потовые и сальные железы. Рисунок 5 – Кожа человека в возрасте 27 лет. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 40х.
В возрасте 51-60 лет (группа 8) анализ численности фибробластов показал, что на 1 мм2 среза ткани дермы содержится 2209,54 ± 610,98 клеток (рисунок 8). Количество и расположение фибробластов в дерме по сравнению с предыдущей возрастной группой изменяется незначительно. Однако в данной группе изменяется морфология самих фибробластов – ядро уменьшается в размерах, принимает более угловатую форму, а количество цитоплазмы существенно не изменяется. Рисунок 8 – Кожа человека в возрасте 53 года. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 40х.
В возрасте 61-70 лет (группа 9) подсчет численности фибробластов показал, что на 1 мм2 среза ткани дермы содержится 2067,05 ± 428,48 клеток. Практически все клетки располагаются компактно под эпидермисом и вокруг сосудов дермы. По мере приближения к гиподерме их количество значительно уменьшается, а в непосредственной близости к гиподерме фибробласты практически отсутствуют (рисунок 9). Количество межклеточного вещества значительно увеличивается по мере приближения к гиподерме. Морфология фибробластов также изменяется по сравнению с более ранними сроками. Визуально ядра меньшего размера и имеют более угловатую форму по сравнению с характеристиками 8-й группы (51-60 лет). Рисунок 9 – Кожа человека в возрасте 65 лет. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 40х.
Рисунок 10 – Кожа человека в возрасте 78 лет. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 40х. В возрасте 71-85 лет (группа 10) в дерме располагается небольшое количество фибробластов и большое количество межклеточного вещества (рисунок 10). Подсчет численности фибробластов показал, что на 1 мм2 среза ткани дермы содержится 2126,71±533,24 клеток. Так же, как и в предыдущей группе, практически все клетки локализуются в непосредственно под эпидермисом, а остальная часть дермы выглядит практически лишенной фибробластов. Морфология клеток по сравнению с предыдущей группой не изменяется.
Данные по численности фибробластов в дерме людей различного возраста (М±m). n – количество случаев. p 0,001 – однофакторный дисперсионный анализ. Можно отметить, что в двух возрастных группах их количество уменьшается резко. Так у плодов человека на сроке 30-40 недель беременности (группа 2) количество фибробластов в 1,5 раза меньше по сравнению с первой возрастной группой. А в возрасте 11-20 лет (группа 4) количество фибробластов в два раза меньше по сравнению с 3-й возрастной группой и почти в три раза меньше по сравнению с первой. Также изменяется расположение фибробластов в дерме. Наибольшее количество клеток располагается под эпидермисом, и с возрастом в этой области их количество снижается менее интенсивно, чем в остальной части дермы. Так, в более поздних возрастных группах по мере отдаления от эпидермиса количество межклеточного вещества значительно увеличивается, а дерма выглядит практически лишенной клеточных элементов. Также изменяется морфология самих фибробластов. Начиная с возраста 51-60 лет (группа 8) их ядра становятся более компактными, меньшего размера, имеют более угловатую форму.
Корреляционный анализ между изменениями возраста и количества фибробластов в дерме человека показал наличие достоверной высокой отрицательной взаимосвязи (r=-0,61; p 0,05). Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния возраста на численность фибробластов в дерме (p 0,001).
В исследовании использованы кусочки кожи, полученные от плодов мужского и женского пола, мужчин и женщин. Значение половой принадлежности в возрастных изменениях численности фибробластов в дерме было выполнено с помощью однофакторного дисперсионного анализа, где в качестве фактора использована половая принадлежность. Результаты этого анализа не выявили достоверного (р 0,05) влияния пола на изменения общего числа фибробластов в дерме.
Количественная оценка результатов
В возрасте 41-50 лет (группа 7) подсчет тучных клеток показал, что их количество становится меньше по сравнению с предыдущей группой (рисунок 30). Так, на 1 мм2 среза ткани дермы содержится 277,02 ± 88,89 тучных клеток. Размеры тучных клеток также становятся большими по сравнению с кожей человека более молодого возраста. Процентное соотношение тучных клеток к общему количеству фибробластов составляет 13,9%.
В возрасте 51-60 лет (группа 8) тучные клетки имеют также достаточно большой размер, расположены во всех слоях дермы, образуют большие скопления около сосудов (рисунок 31). Тучные клетки также располагаются изолированными группами в дерме вне видимой связи с сосудами. Клетки имеют различную форму (округлую, овальную, веретенообразную). Цитоплазма тучных клеток окрашена в почти черный цвет. Контур тучных клеток нечеткий. При подсчете на 1 мм2 среза ткани дермы содержится 316,01 ± 78,02 тучных клеток. Процентное соотношение тучных клеток к общему количеству фибробластов составляет 14,2%.
При исследовании препаратов возрастной группы людей от 61 до 70 лет (группа 9) отмечается большое количество тучных клеток в дерме (рисунок 32). Подсчеты показали, что на 1 мм2 среза ткани дермы содержится 372,08 ± 128,51 тучных клеток. Процентное соотношение тучных клеток по отношению к количеству фибробластов составляет 14,5%.
В возрасте 71-85 лет (группа 10) тучные имеют большие размеры, образуют скопления около сосудов дермы. Клетки имеют различную форму (округлую, овальную, веретенообразную), цитоплазма окрашена в почти черный цвет. Контуры цитоплазмы нечеткие (рисунок 33). При подсчете на 1 мм2 среза ткани дермы содержится 447,76 ± 9,41 тучных клеток. Процентное соотношение тучных клеток к общему количеству фибробластов составляет 18,3%.
Таким образом, результаты исследования показывают, что количество тучных клеток, а также их соотношение с количеством фибробластов дермы увеличивается с возрастом (рисунки 34,35).
При анализе содержания тучных клеток в дерме отмечается равномерное нарастание их количества с увеличением возраста. Однако в процентном соотношении к количеству фибробластов имеется резкий скачок в возрасте 21-30 лет (группа 4). Количество тучных клеток возрастает в два раза по сравнению с фибробластами. Также обращается на себя внимание, что изменяется не только количество, но и форма тучных клеток. С возрастом их форма из овальной становится или округлой, или веретенообразной. На ранних этапах онтогенеза контур цитоплазмы тучных клеток четкий. С возрастом контуры цитоплазмы становятся размытыми. Также изменяется расположение тучных клеток в дерме. На более ранних периодах онтогенеза они располагаются в основном под эпидермисом без четкой ассоциации с кровеносными сосудами, а также другими клетками дермы. Однако с возрастом их расположение становится более равномерным как в поверхностных, так и в глубоких отделах дермы. Тучные клетки нередко группируются и образуют скопления возле сосудов дермы.
Корреляционный анализ между изменениями возраста и количеством тучных клеток в дерме человека показал наличие высокой положительной достоверной взаимосвязи (r=0,37; p 0,05). Корреляционный анализ между изменениями численности тучных клеток и фибробластов в дерме также показал наличие высокой положительной достоверной взаимосвязи (r=0,69; p 0,05). Однофакторный дисперсионный анализ выявил наличие достоверного влияния (р 0,001) возраста на изменения численности тучных клеток в дерме.
В исследовании использованы кусочки кожи, полученные от плодов мужского и женского пола, мужчин и женщин. Значение половой принадлежности в возрастных изменениях численности тучных клеток в дерме было выполнено с помощью однофакторного дисперсионного анализа, где в качестве фактора использована половая принадлежность. Результаты этого анализа не выявили достоверного (р 0,05) влияния пола на изменения числа тучных клеток в дерме.
Результаты исследования показали, что у плодов человека на сроке 20-30 недель беременности (группа 1) в дерме выявляются немногочисленные CD45– положительные клетки (рисунок 36). По подсчетам на 1 мм2 среза ткани дермы приходится 356,71 ± 70,47 клеток. При подсчете процентного соотношения CD45–положительных клеток по отношению к фибробластам дермы выявлено, что их доля составляет 8,1%.
Кожа плода человека на 25 неделе беременности. Непрямая иммуногистохимическая реакция на CD45. Увеличение 40х. Иммуногистохимически положительные клетки встречаются во всех слоях дермы. Ядра имеют овальную форму, контур нечеткий. Размер CD45– положительных клеток равен или несколько превышает таковой фибробластов дермы.
У плодов человека на сроке 30-40 недель беременности (группа 2) количество CD45-положительных клеток также незначительно по отношению с количеством фибробластов. Эти клетки имеют овальную или округлую форму. Однако визуально размер большинства CD45–положительных клеток больше окружающих их фибробластов (рисунок 37). По подсчетам на 1 мм2 среза ткани дермы содержится 305,43 ± 61,83 CD45–положительных клеток, что по отношению к общему количеству фибробластов дермы составляет 8,8 %.
Кровеносные сосуды с положительной окраской на CD31 в различные возрастные периоды
Результаты нашего исследования показывают накопление клеток костномозговой природы в дерме с течением возраста, что свидетельствует о повышении провоспалительного потенциала дермы у пожилых людей. Следовательно, полученные в настоящей работе данные вполне согласуются с провоспалительной концепцией старения. Более того, полученные нами результаты позволяют рассматривать повышенное количество клеток костномозговой природы в дерме в качестве одного из триггеров не только возрастных изменений, но, возможно, и некоторых связанных с возрастом заболеваний кожи, например, злокачественные новообразования.
В настоящей работе выявление сосудов в дерме проведено с применением двух маркеров эндотелиальных клеток – фактора Виллебранда и CD31.
Фактор Виллебранда обеспечивает связь тромбоцитарного рецептора GPIb-IX-V к молекулам коллагена, располагающимся под эндотелием [117]. Фактор Виллебранда также стабилизирует структуру VIII фактора свертывания крови [117]. Кроме того, фактор Виллебранда участвует в регуляции воспаления, ангиогенеза, регенерации тканей [117, 123]. Фактор Виллебранда синтезируется в эндотелиальных клетках и мегакариоцитах [117]. Поэтому его выявление широко используется в идентификации кровеносных сосудов.
CD31, или адгезионная молекула-1 тромбоцитов и эндотелия (PECAM-1), является структурным компонентом межклеточных адгезионных контактов эндотелиальных клеток [144]. CD31 содержится в больших количествах в эндотелиальных клетках. Лишь небольшие уровни CD31 были выявлены в тромбоцитах, моноцитах, нейтрофилах и лимфоцитах [144]. В связи с этим, CD31 широко используется в качестве маркера эндотелиальных клеток [28, 144].
В литературе отсутствуют сведения о возрастных особенностях синтеза и экспрессии фактора Виллебранда и CD31 эндотелиальными клетками. В случае отсутствия синтеза или незначительный синтез одного их этих протеинов в каком-либо возрасте может привести к погрешностям в определении сосудов. Поэтому для надежности результатов в настоящей работе были использованы два эндотелиальных маркера.
Результаты показали, что фактор Виллебранда и CD31 выявляются в материале кожи всех возрастных групп. Интенсивность окрашивания эндотелия на CD31 не имела возрастных особенностей, а степень окрашивания эндотелия на фактор Виллебранда несколько возрастала с прогрессированием возраста. Можно предположить, что существует возрастная регуляция синтеза и секреции фактора Виллебранда. Механизмы этой регуляционной системы к настоящему времени абсолютно не ясны.
Подсчет количества сосудов в дерме показал, что численность сосудов, выявляемых как с помощью антител к фактору Виллебранда, так и с применением антител к CD31, планомерно уменьшается с возрастом. Максимальное количество сосудов содержится в дерме плодов человека, а минимальное – у людей в возрасте 61-85 лет. Следует отметить, что оба примененных метода дают практически одинаковые результаты по численности сосудов.
Какие же возможные механизмы лежат в основе возрастного уменьшения численности кровеносных сосудов в дерме человека? Ответ на этот вопрос частично могут предоставить результаты исследований по фотостарению кожи. Установлено, что в коже, подвергающейся хронической солнечной инсоляции или экспериментальному ультрафиолетовому облучению, содержится значительно меньше сосудов, чем в коже, защищенной от воздействия солнечного света или без применения ультрафиолетового облучения [53]. В связи с этим можно предположить, что воспалительный процесс, индуцируемый ультрафиолетовыми лучами, приводит к постепенному уменьшению численности сосудов в дерме. Выделяемые в процессе воспалительной реакции токсичные цитокины, вероятно, приводят к гибели имеющихся сосудистых клеток и тормозят их регенерацию. Одним из веществ, выделяемых при воспалении и приводящих к апоптозу эндотелиальных клеток, является трансформирующий фактор роста бета [53, 174], концентрация которого возрастает в очаге воспаления, что тормозит синтез ангиогенных факторов роста и в итоге также приводит к угнетению пролиферативного потенциала сосудов [174].
В настоящей работе установлено, что интенсивность окрашивания эндотелия на фактор Виллебранда увеличивается с возрастом. В настоящее время известен эффект фактора Виллебранда по торможению ангиогенеза [123]. Поэтому возможно, что возрастание уровня фактора Виллебранда способствует уменьшению интенсивности ангиогенеза в коже с возрастом. Кроме того, фактор Виллебранда поддерживает воспалительную реакцию, цитотоксические продукты которой оказывают негативное влияние на ангиогенез [35]. Однако детальные механизмы выявленных изменений требуют дальнейшего изучения.
Корреляционный анализ показал наличие тесной корреляционной положительной взаимосвязи между численностью фибробластов и количеством кровеносных сосудов дермы. Следовательно, одним из заключений, которые можно сделать на основании результатов этого анализа, является то, что возрастное ухудшение кровоснабжения дермы вносит весомый вклад в снижение общей численности фибробластов в дерме и пролиферативного пула этих клеток. Таким образом, настоящая работа раскрывает новый механизм, который приводит к возрастному уменьшению численности фибробластов в дерме. Возможно, что этот факт должен быть ключевым в клинических подходах к профилактике и терапии возрастных изменений кожи, так как без адекватного кровоснабжения невозможно добиться нормального регенераторного потенциала ткани.
![Цилиарное тело глаза человека в онтогенезе [Электронный ресурс]](/i/i/4606/206977.png "Цилиарное тело глаза человека в онтогенезе [Электронный ресурс] Николаенко Галина Анатольевна")
