Введение к работе
Актуальность проблемы. Атеросклеротические поражения магистральных сосудов человека являются причиной развития целого ряда сердечно-сосудистых заболеваний. Расшифровка клеточных механизмов формирования атеросклеротической бляшки остается актуальной нерешенной задачей современной медицинской и биологической науки.
Проводимые в Кардиологическом центре с 1985 года исследования клеток интимы агероматозной аорты человека [Chazov et al, 1986], а позднее клеток периферической крови пациентов с выраженным атеросклерозом на фоне тяжелой гиперлипидемии (ГЛП), позволили впервые получить данные, экспериментально доказывающие участие циркулирующих костномозговых стволовых клеток в атерогенезе человека [Соболева, 1989; Soboleva et al, 1994]. Сформулированная концепция роли циркулирующих полипотентных клеток-предшественников в развитии атеросклеротических поражений сосудов противоречила общепризнанной теории Р.Росса, в которой главная роль в формировании атеросклеротической бляшки отводится пролиферирующим макрофагам и гладкомышечным клеткам, мигрирующим из медии в интиму [Ross et al, 1973-1999]. Присутствие стволовых колониеобразующих единиц (КОЕ) в интиме атеромагозной аорты и появление циркулирующих КОЕ для фибробластов (КОЕ-Ф) в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом [Soboleva et al, 1994-1995] позволили предположить, что ключевым моментом в развитии атеросклероза является проникновение костномозговых циркулирующих КОЕ в субэндотелий в места скопления липидов. Активно пролиферирующие в интиме КОЕ формируют клеточные скопления/клоны из гемопоэтических клеток, поглощающих избыточные липиды и секретирующих ростовые факторы, а также стромальных клеток, синтезирующих экстрацеллюлярный матрикс для изоляции очагов воспаления. Дифференцировка КОЕ-Ф в терминальные стромальные клетки происходит в зависимости от окружения, в которое они попадают. Вышесказанное объясняет возникновение различных типов склерозирования сосудистой стенки (фиброз, оссификация, хондрогенез, формирование адипозной ткани), а также известный факт формирования кости в стенке сосуда.
До 2003 года проблемой исследования роли циркулирующих стволовых клеток в развитии атеросклеротических поражений сосудов человека занимались только в Кардиологическом центре в группе Соболевой ЭЛ. Работы в этом направлении не проводились ни зарубежными ни отечественными учеными. Долгое время к циркуляции
ЯИОТЕКА v
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СЛе* О»
стромальных стволовых клеток в периферической крови относились со скептицизмом. Первые обоснованные данные, свидетельствующие о такой возможности, начали появляться с 1997 года. Исследования не касались проблемы атеросклероза [Ргоскор, 1997, Chesney et al, 1997; Ferrari and Mavfflo, 1998], однако косвенно подтверждали результаты Соболевой ЭЛ. с соавт. в фундаментальном плане. Только в 2003 г. появилась работа зарубежных авторов [Caplice, 2003], данные которой прямо указывали на участие циркулирующих костномозговых стромальных стволовых клеток в формировании атеросклеротических бляшек человека. В этом исследовании изучение пост-мортальных тканей больных, перенесших пересадку костного мозга, позволило установить, что поражение стенки артерий в результате атеросклероза происходит за счет клеток из костного мозга пациента. Таким образом, остается актуальным продолжение изучения роли стволовых клеток разных линий дифференцировки и факторов, влияющих на их коммитирование, в формировании атеросклеротических поражений.
Хорошо известно, что атеросклеротические поражения сосудов нередко осложняются кальцификацией [Virchow,1863; Buntmg,1906; Haust and More,1965; Agatson et al, 1990], однако механизм кальцификации в стенке сосуда при атеросклерозе до конца не ясен. Существует мнение, что развитие атеросклероза, наряду с остеопорозом (уменьшение минеральной плотности костной массы), может быть связано с нарушением кальциевого гомеосгаза, поскольку отмечена позитивная корреляция между остеопорозом и интенсивной кальцификацией атероматозных сосудов. Так, у больных с остеопорозом кальцификация аорты развивается гораздо чаще, чем у лиц с нормальной минеральной плотностью костной ткани [Ouchi et al,1993; Stefenelli et al, 1993, Banks et al, 1994]. Тот факт, что стромальные остеогенные клетки, присутствующие в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом, формируют in vitro остеоидную ткань [Soboleva, 1994], позволяет предполагать наличие оссификации в стенке сосуда при атеросклерозе с участием этих клеток. Остеокласты - многоядерные клетки, производные моноцитарно/макрофагального ростка дифференцировки, являются обязательными участниками остеогенеза. Путем резорбции костной ткани они участвуют в ремоделировании, а также обеспечивают потребность организма в дополнительном кальции, которая должна возникать из-за внекостной кальцификации в сосудах при атеросклерозе. В связи с этим представляет интерес изучение пула преостеокластов у пациентов с коронарным атеросклерозом и ГЛП, поскольку такие данные могли бы способствовать пониманию причин и механизмов кальцификации сосудистой стенки.
Большинство клеточных реакций в организме в норме и патологии опосредуется биохимическими ростовыми факторами/цитокинами. Изменение концентрации таких
факторов локально или в циркуляции обязательно вносит свой вклад в процессы пролиферации и дифференцировки соответствующих типов клеток. Известно, что в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний принимают участие <№(FGF), T
Общеизвестно, что гиперлипидемия является одним из важнейших факторов риска, способствующих ускоренному развитию атеросклероза. По данным Seven Countries Study, увеличение уровня общего холестерина у мужчин в странах Северной Европы с 4,8 до 8,4 ммоль/л вызывает рост смертности от ИБС в 2,1 раза [Menotti et al, 1996; Keys, 1996]. Атерогенные модифицированные ЛПНП могут быть основным компонентом развития дисфункции эндотелия [Ross, 1993] и активатором экспрессии "скевенджер" -рецептора на макрофагальных клетках сосудистой стенки [Palinski et al, 1989]. Захват и накопление ЛПНП моноцитами/макрофагами приводит к их превращению в пенистые клетки, выделению различных факторов роста и хемоаттракгангов [Newby and Zaltsman, 1999]. Исследование в модельной системе in vitro реакции циркулирующих КОЕ на присутствие нативных и модифицированных (окисленных) ЛПНП может дополнить представления о роли ЛПНП в развитии атеросклероза через воздействие на клетки-предшественники.
Для лечения гиперхолестеринемии в клинике широкое применение нашли препараты группы сгатинов, снижающие избыточный уровень холестерина. Данные Health Protection Study, в которое было включено 20500 пациентов, подтверждают пользу применения сгатинов в различных подгруппах больных, в том числе у пациентов с сахарным диабетом, женщин в пост-менопаузе, пожилых людей. В этом исследовании длительная (более 5 лет) терапия симвасгатином (40 мг) привела к снижению общей смертности на 12%, смертности от сердечно-сосудистых заболеваний на 17% и инсульта на 27% [Collins et al, 2002]. В связи с предположением о влиянии гиперлипидемии на костномозговые стволовые клетки и агерогенез представляет интерес реакция колониеобразующих единиц (КОЕ) на снижение уровня ЛПНП в крови под действием
статинов.
Цель исследования - анализ циркулирующих костномозговых гемопоэтических и стромальных стволовых клеток, а также факторов, влияющих на их коммитирование, у пациентов с ГЛП и верифицированным атеросклерозом коронарных артерий и у здоровых добровольцев (группа сравнения). Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:
Методами иммуноморфологии и поточной цитофлуорометрии фенотипировать циркулирующие костномозговые стромальные клетки-предшественники (КОЕ-Ф) в крови пациентов с первичной гиперлипидемией (ГЛП) и коронарным атеросклерозом.
В тест-системе in vitro методами гистохимии, иммуноморфологии и электронной микроскопии выявить гемопоэтические костномозговые предшественники остеокластов. Определить их количество в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом и здоровыхдобровольцев.
В сыворотке крови определить концентрацию колониестимулирующих факторов (ГМ-КСФ и ФРФ-2), влияющих на коммитирование гемопоэтических и стромальных колониеобразующих единиц. Сравнить содержание этих факторов у пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом и здоровыхдобровольцев.
Получить данные о влиянии терапии статинами на состав и пролиферативные способности КОЕ разных линий дифференцировки in vitro у пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом.
Оценить влияние терапии препаратами группы статинов на количество КОЕ-Ф с остеогенными потенциями в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом.
В модельной системе in vitro исследовать влияние модифицированных (окисленных) и наивных липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) на пролиферацию КОЕ пупочной крови.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые при использовании иммуноморфологического метода и метода поточной цитофлуорометрии в крови пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом были выявлены костномозговые циркулирующие КОЕ-Ф, что подтвердило полученные ранее клональным методом данные об участии циркулирующих стволовых клеток в атерогенезе.
В лимфоцитарной фракции пациентов был определен пул клеток, в котором присутствуют стромальные остеобластные клетки-предшественники (ОїҐС045 CD34'). Среди лимфоцитоподобных клеток также выявлены стромальные клетки-предшественники, экспрессирующие коллаген I типа. Был выработан протокол
определения ON+ клеток методом поточной цитофлуорометрии. Показано, что число ON* в крови больных тесно связано с тяжестью агеросклеротических поражений, что в дальнейшем может быть использовано для разработки как прогностического теста, так и терапевтических подходов к лечению атеросклероза.
Впервые установлено, что в крови пациентов с пшерлипидемией и коронарным атеросклерозом увеличено содержание предшественников остеокластов - клеток гемопоэтической линии дифференцировки. Наряду с колониями/скоплениями остеокластов в гест-системах отмечено присутствие остеобластов. Эти данные позволяют приблизиться к объяснению процесса оссификации/кальцификации сосудистой стенки при атеросклерозе.
Впервые показано, что в сыворотке пациентов с пшерлипидемией и коронарным атеросклерозом одновременно увеличиваются уровни колониестимулирующего фактора для гранулоцитов-макрофагов (ГМ-КСФ) и фактора роста для фибробластов-2 (ФРФ-2). Эти данные могут свидетельствовать о стимулирующем влиянии повышенного содержания цигокинов в крови на активацию колониеобразуюших клеток гемопоэтической и стромальной линий дифференцировки в костном мозге.
В работе представлены оригинальные результаты о снижении содержания в крови колониеобразуюших единиц (КОЕ) различных линий дифференцировки, и в частности ON+ клеток-предшественников остеобластов под влиянием терапии сгатинами в течение трех месяцев у пациентов с ГЛП и коронарным атеросклерозом. Эти данные удачно дополнены исследованиями реакции КОЕ пупочной крови на добавление липюпротеидов низкой плотности в модельной системе in vitro. Полученные результаты свидетельствуют о непосредственном влиянии ЛПНП на пролиферацию и коммитирование костномозговых КОЕ.
В настоящем исследовании получены данные, которые позволяют внести новые представления о клеточных механизмах атерогенеза, а также выработать новые подходы к диагностике и лечению атеросклероза, что имеет большую практическую значимость.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: XII International Symposium on Drags Affecting Lipid Metabolism, Houston, 1995; 3rd Annual Scandinavian Atherosclerosis Conference, Copenhagen, 1996; 6th International Congress on Cell Biology, San Francisco, 1996; ISH-EHA Haematology congress, Amsterdam, 1998; Российский национальный конгресс кардиологов, Москва, 2000; Симпозиум по Экспериментальным и клиническим проблемам атеросклероза, Москва, 2000; 72rd Congress of the EAS, Salzburg, 2002; 74rd Congress of the EAS, Seville, 2004, a
также доложены на межлабораторном семинаре в ИЭК РКНПК МЗ РФ (Москва, 3 ноября 2004 года).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 11 тезисных сообщений, одна статья находится в печати.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, разделов: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на^_страницах и
