Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные концепции паренхиматозно-стромальных взаимоотношений и их роль в гистогенезе фиброза печени 11
1.1. Стереотипность реакций паренхиматозных клеток печени в условиях альтерации и регенерации 12
1.2. Современные представления о фиброгенезе печени 18
1.3. Структура и функции звездчатых клеток печени в норме и патологии 28
1.4. Рєзюме 34
Глава 2. Характеристика материала и методы исследования 35
2.1. Характеристика экспериментальной модели 35
2.2. Характеристика клинической модели 37
2.3. Методы светооптического, электронно-микроскопического и иммуногистохимического исследования 38
2.4. Методы морфометрии, стереологии и статистики 40
Глава 3. Светооптическая и ультраструктурная характеристика печени крыс с генетически детерминированными дисметаболически-инволютивными изменениями 42
3.1. Светооптическая и ультраструктурная характеристика гепатоцитов и звездчатых клеток печени крыс OXYS в возрастном аспекте 42
3.2. Стереологическое исследование и динамика численной плотности звездчатых клеток в онтогенезе 69
3.3. Резюме 78
Глава 4. Структурно-функциональные особенности клеточных популяций печени в динамике фиброза при хронической HCV- и HCV+HBV-инфекции 79
4.1. Светооптическая и ультраструктурная характеристика гепатоцитов и звездчатых клеток печени в динамике фиброза 79
4.2. Иммуногистохимическое, морфометрическое и стереологическое исследование печени в динамике фиброза 97
4.3. Резюме 102
Заключение 103
Выводы 108
Список литературы 110
- Структура и функции звездчатых клеток печени в норме и патологии
- Методы светооптического, электронно-микроскопического и иммуногистохимического исследования
- Стереологическое исследование и динамика численной плотности звездчатых клеток в онтогенезе
- Иммуногистохимическое, морфометрическое и стереологическое исследование печени в динамике фиброза
Введение к работе
Актуальность темы. Звездчатые клетки печени (жиронакапливаю-щие клетки, липоциты печени, или клетки Ито), локализующиеся в пространствах Диссе и содержащие ретиноиды, привлекают внимание исследователей - гистологов, физиологов, гепатологов на протяжении более 130 лет, но лишь в последние годы, после значительного прогресса методов структурного исследования, появились четкие доказательства их роли в фиброгенных реакциях печени (Gabele Е. et ah, 2003; Sato М. et ah, 2003; Balabaud С. et ah, 2004; Friedman S.L., 2008).
Фиброз - результат нарушения баланса между процессами синтеза и распада экстрацеллюлярного матрикса с преобладанием процессов образования внеклеточных матриксных компонентов. Это универсальная реакция клеточных популяций печени на хроническое повреждение, обусловленное различными неблагоприятными факторами, среди которых наибольший удельный вес имеют алкоголь и другие токсические воздействия, инфекционные агенты, а также наследственные нарушения обмена меди и железа (Хазанов А.И., Некрасова Н.Н., 2002; McCaughan G.W., George J., 2004; Ryder S.D., 2004).
Достижения в изучении фиброза печени привели к пониманию клеточных основ фиброгенеза при хроническом поражении печени, и в настоящее время звездчатые клетки печени идентифицированы как основной источник внутридольковых, или перисинусоидальных, компонентов внеклеточного матрикса, в частности, коллагена (Eng F.J., Friedman S.L., 2000; Sato М. et ah, 2003; Senoo H., 2004). Другими «точками роста» соединительной ткани при фиброзных изменениях печени являются портальные тракты и перицентральные зоны долек, в соответствии с этим, с участием фибробластов печени формируются портальный и центральный фиброз (Ramadori G., Saile В., 2004).
Тканевый микрорайон печени «просвет синусоида с протекающей в нем кровью - эндотелиоцит - пространство Диссе - гепатоцит» является зоной наибольшей функциональной ответственности, структура которого обеспечивает оптимизацию выполнения метаболической функции гепато-цитами, поэтому именно перисинусоидальный, или перигепатоцеллюляр-ный, фиброз относят к прогностически наиболее неблагоприятным вариантам в связи с нарушением при этом транссинусоидального обмена и метаболической функции гепатоцитов (Непомнящих Д.Л. и др., 2006).
В связи с большой значимостью вопроса реверсии фиброза в различных органах проводится множество исследований по выяснению тонких механизмов фиброгенеза и фибролизиса с поиском значимых маркеров и вероятных мишеней для разработки адекватной терапии (Desmet V.J., Ros-kams Т., 2004; Kisseleva Т., Brenner D.A., 2007; Moreira R.K., 2007). В этом плане нами выбрана экспериментальная модель - линия преждевременно стареющих крыс OXYS (первоначально зарегистрированная как W/SSM), которая создана в Институте цитологии и генетики СО РАН селекцией и инбридингом крыс Вистар, чувствительных к катарактогенному эффекту больших доз галактозы (Соловьева Н.А. и др., 1975).
Наряду со 100%-м развитием катаракты в возрасте 6 мес, этих животных характеризуют снижение продолжительности жизни, повышение артериального давления, сенильный остеопороз, ранние инволютивные изменения внутренних органов, в том числе кардиомиопатия, миопатия, а также нарушения когнитивных функций мозга (Непомнящих Л.М. и др., 1995; Лоскутова Л.В., Колосова Н.Г., 2000; Колосова Н.Г. и др., 2003; Непомнящих Л.М., Бакарев М.А., 2005). В основе патогенеза этих проявлений - наследуемая повышенная продукция активных кислородных метаболитов, обнаруженная в печени и миокарде животных (Синицына О.И. и др., 2006; Salganik R.I. et al., 1994). Таким образом, линия крыс OXYS может быть перспективной моделью исследования структурно-функциональ- ных изменений звездчатых клеток печени в условиях генетически программированного окислительного стресса, являющегося одним из ведущих индукторов фиброгенеза.
Кроме того, в настоящее время чрезвычайно актуальны исследования, касающиеся фиброгенеза в печени, связанного с инфицированием вирусами гепатита В и С и развитием хронической HBV- и/или HCV-инфекции в связи с высокой степенью заболеваемости во всех странах (Russo M.W. et al., 2005). Следует отметить, что несмотря на предпринимаемые усилия, экспериментальной модели, воспроизводящей инфекционный процесс гепатита С с последующей трансформацией в цирроз печени, не существует. HCV-подобная инфекция у макак-резусов, возникающая спонтанно, протекает без структурных повреждений печени в течение нескольких лет (Кор-зая Л.И. и др., 2002). В связи с этим морфологическое исследование звездчатых клеток печени в динамике хронической HCV-инфекции является актуальным.
Цель работы - исследование ультраструктурных изменений звездчатых клеток печени крыс OXYS в онтогенезе, а также изучение ультраструктурных количественно-качественных характеристик популяции звездчатых клеток в динамике фиброза печени инфекционно-вирусного генеза.
Задачи исследования:
Изучить структурно-функциональные особенности звездчатых клеток печени крыс OXYS (модель генетически детерминированного окислительного стресса) в возрастном аспекте.
Изучить ультраструктурные и иммуногистохимические особенности звездчатых клеток печени при действии РНК- и ДНК-вирусов гепатита С и В в динамике фиброгенеза.
Провести количественно-качественный анализ звездчатых клеток печени в динамике онтогенеза и фиброгенеза.
Основные положения, выносимые на защиту:
У преждевременно стареющих крыс линии OXYS и при хроническим воздействии вирусов гепатита С и В ремоделированы пространства Диссе в связи с индукцией фиброгенного потенциала звездчатых клеток печени, что является неблагоприятным структурно-функциональным маркером прогрессии фиброза и цирроза печени.
С помощью морфометрического анализа установлено, что степень выраженности перигепатоцеллюлярного фиброза имеет достоверную обратную корреляцию с численной плотностью липидосодержащих звездчатых клеток.
Ведущим маркером фиброгенной активации звездчатых клеток является экспрессия гладкомышечного а-актина, выявляемая с помощью двухшагового непрямого иммунопероксидазного метода.
Научная новизна. Исследован морфогенез фиброза печени инфекци-онно-вирусного генеза (хронические HCV- и HCV+HBV-инфекции) и фиброзные изменения печени в онтогенезе преждевременно стареющих крыс линии OXYS с генетически детерминированным развитием окислительного стресса. В морфогенезе фиброза печени ведущую роль играют альтерация гепатоцитов, ремоделирование пространств Диссе и фиброген-ная активация звездчатых клеток.
Впервые показано, что в онтогенезе у крыс OXYS и при инфицировании вирусом гепатита С звездчатые клетки печени в состоянии фиброгенной активации экспрессируют переходный, или смешанный, фенотип: уменьшение числа и последующее исчезновение липидных капель с синхронной сменой звездчатой формы на фибробластоподобную полигональную и увеличением размеров клетки, индукция белоксинтезирующей функции с гиперплазией элементов гранулярной цитоплазматической сети, увеличение числа митохондрий. Структурные изменения сопровождаются экспрессией гладкомышечного а-актина - иммуногистохимического мар- кера фибробластоподобных клеток, продуцирующих компоненты экстра-целлюлярного матрикса. Синхронно перицеллюлярно формируются колла-геновые фибриллы как ведущий фактор ремоделирования пространств Диссе.
Впервые установлено, что часть внутридольковой популяции звездчатых клеток печени сохраняет липидонакапливающий фенотип даже на стадии цирроза печени для депонирования ретиноидов, при этом в фиброзных септах выявлена очаговая пролиферация липоцитов, что отражает пластичность звездчатых клеток.
Впервые в динамике онтогенеза у преждевременно стареющих крыс линии OXYS в звездчатых клетках выявлены ультраструктурные стереоло-гические маркеры индукции белоксинтезирующей функции, обратно коррелирующие с выраженностью функции депонирования ретиноидов, оцениваемой по поверхностной плотности липидных капель. Прогрессирующие и более значительные по сравнению с Вистар дисфункции митохондрий гепатоцитов, ассоциированные с окислительным стрессом, и более выраженная фиброгенная активность звездчатых клеток являются ключевыми факторами фиброза печени у крыс линии OXYS.
Практическая значимость. Полученные результаты раскрывают закономерности тканевых и ультраструктурных реакций в условиях альтерации и компенсаторно-приспособительных реакций клеточных популяций печени. Важен аспект индукции фиброгенного потенциала звездчатых клеток печени, являющийся неблагоприятным структурно-функциональным маркером прогрессии фиброза и цирроза печени. Результаты исследования целесообразно внести в курс преподавания соответствующих разделов общей и частной гистологии, а также использовать для дальнейшего углубления представлений о структурной модификации печени.
Апробация работы. Материалы исследования представлены на Тринадцатой и Четырнадцатой Российской научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2005, 2006); XV-й городской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2005); Одиннадцатой Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2006); П-м съезде Российского общества патологоанатомов (Москва, 2006); 8-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2006» (Санкт-Петербург, 2006); межлабораторной конференции Научно-исследовательского института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2009).
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 12 научных работ, из них 2 в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК для опубликования результатов кандидатских диссертаций:
Айдагулова СВ., Непомнящих Г.И., Капустина В.И. Звездчатые клетки печени в динамике развития фиброза при хронической HCV-инфекции // Сиб. журн. гастроэнтерол. гепатол. - 2005. - № 19. - С. 17 - 18.
Капустина В.И., Айдагулова СВ. Светооптическая и ультраструктурная характеристика печени при действии вибрационного фактора // Сиб. журн. гастроэнтерол. гепатол. - 2005. - № 19. - С. 149 - 150.
Нохрина Ж.В., Капустина В.И., Непомнящих Д.Л., Айдагулова СВ. Клинико-патогистологическое исследование хронической HCV+HBV-инфекции при трансформации в цирроз печени // Актуальные вопросы современной медицины: Сборник материалов XV науч.-практ. конф. врачей. - Новосибирск, 2005. - С 220.
Айдагулова СВ., Непомнящих Д.Л., Капустина В.И. Ультраструктурное и иммуногистохимическое исследование звездчатых клеток печени в динамике фиброгенеза // Рос. журн. гастроэнтерол. - Приложение № 27. Материалы Одиннадцатой Российской конференции «Гепатология сегодня». - М., 2006. - С. 50. № 172.
Айдагулова СВ., Колосова Н.Г., Капустина В.И. Ультраструктура митохондрий гепатоцитов преждевременно стареющих крыс OXYS // Сиб. науч. вестник. - 2006. - Вып. IX. - С. 31 - 34.
Капустина В.И., Непомнящих Г.И., Айдагулова СВ. Клетки Ито в динамике развития цирроза печени // Сиб. науч. вестник. - 2006. - Вып. IX. - С. 52 - 54.
Непомнящих Д.Л., Виноградова Е.В., Постникова О.А., Капустина В.И. Клинические и патоморфологические особенности цирроза печени инфекционно-вирусного генеза // Сиб. журн. гастроэнтерол. - 2006. - № 20. -С. 28-31.
Айдагулова СВ., Капустина В.И., Кладова Т.И. Комплексное морфологическое исследование звездчатых клеток печени в динамике фиброза инфекционно-вирусного генеза // Труды II Съезда Рос. общества патологоанатомов. - М., 2006. - Т. 1. - С. 70.
Непомнящих Д.Л., Капустина В.И., Айдагулова СВ. Звездчатые клетки печени в динамике фиброгенеза / Материалы 8-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2006» // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2006. - № 1 - 2. - С М107.
Непомнящих Г.И., Айдагулова СВ., Непомнящих Д.Л., Капустина В.И., Постникова О.А. Ультраструктурное и иммуногистохимическое исследование звездчатых клеток печени в динамике фиброза и цирроза печени инфекционно-вирусного генеза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 142, № 12. - С. 681 - 686. Nepomnyashchikh G.I., Aidagulova S.V., Nepomnyashchikh D.L., Ка-pustina V.L, Postnikova О.А. Ultrastructural and immunohistochemical study of hepatic stellate cells over the course of infectious viral fibrosis and cirrhosis of the liver II Bull. Exper. Biol. Med. - 2006. - Vol. 142, № 6. - P. 723 - 728.
Айдагулова СВ., Капустина В.И. Полиморфизм звездчатых клеток и их роль в фиброгенезе // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. -2008. - № 6. - С. 93 - 97.
Структура и функции звездчатых клеток печени в норме и патологии
В физиологических условиях звездчатые клетки печени играют ведущую роль в регуляции ретиноидного гомеостаза; они экспрессируют на клеточной поверхности специфические рецепторы к ретинол-связывающему белку и захватывают комплекс ретинола и ретинол-связывающего белка с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза (Senoo Н., 2004).
Ретиноиды (витамин А и его метаболиты), как известно, регулируют различные отправления клеток, такие как клеточная пролиферация, диф-ференцировка, морфогенез и канцерогенез. В физиологических условиях звездчатые клетки накапливают 80% всех ретиноидов организма в виде ре-тинил-пальмитата в липидных каплях цитоплазмы и регулируют и транспорт, и накопление ретиноидов (Sato Н., 2003).
Звездчатые клетки печени у арктических животных, таких как полярные медведи и арктические лисы, запасают в 20 - 100 раз больше ретиноидов, чем у человека или крысы. В патологических условиях, таких как фиброз печени, звездчатые клетки теряют ретиноиды и синтезируют большое количество компонентов экстрацеллюлярного матрикса, включая коллаген, протеогликаны и адгезивные гликопротеины. Морфология таких клеток также меняется от звездчатой до формы фибробластов или мио-фибробластов.
Трехмерная структура компонентов экстрацеллюлярного матрикса управляет обратимостью морфологии, пролиферации и функциями звездчатых клеток печени. Молекулярные механизмы регуляции обратимости включают интегрины клеточной поверхности, связывающие компоненты экстрацеллюлярного матрикса, с последующей сигнальной трансдукциеи и затем вариацией цитоскелета. Звездчатые клетки также существуют во внепеченочных органах, таких как поджелудочная железа, легкие, почки и кишечник; печеночные и внепеченочные звездчатые клетки формируют систему звездчатых клеток организма (Senoo Н., 2004).
В патологических условиях, в частности, при циррозе печени, звездчатые клетки печени теряют ретиноиды, начинают пролиферировать, синтезируют и секретируют большое количество компонентов экстрацеллюлярного матрикса, таких как коллаген, протеогликан и гликопротеин. Структура этих клеток также меняется от звездчатой до фибробластопо-добной или как у миофибробластов с хорошо развитой гранулярной цито-плазматической сетью и аппаратом Гольджи.
Механизмы активации звездчатых клеток печени (перпетуации) включают в себя пролиферацию, фиброгенез, контрактильность, утрату ре-тиноидов и наработку компонентов матрикса (Arthur M.J.P., 2000; Gabele Е. et al., 2003).
Увеличение числа звездчатых клеток при повреждении печени отражает активность множества митогенных факторов и родственных им тиро-зинкиназных рецепторов. Растет список других идентифицированных ми-тогенов звездчатых клеток, включающий эндотелии-1, тромбин, фактор роста эндотелия сосудов и инсулиноподобный фактор роста (Gabele Е. et al., 2003; Sato М. et al., 2003; Balabaud С. et al., 2004; Xu L. et al., 2005).
Продукция компонентов матрикса активированными звездчатыми клетками значительно возрастает под действием трансформирующего фактора роста 6eTa-l(TGF(31). Звездчатые клетки - наиболее важный источник TGFpi при фиброзе печени, но клетки Купфера и тромбоциты также сек-ретируют этот цитокин. Соединительнотканный фактор роста (CTGF) - это цитокин, который способствует фиброгенезу в коже, легких и почках. Он также экспрессируется звездчатыми клетками при фиброзе печени. Регуляция его экспрессии в звездчатых клетках не определена, но в других клеточных системах он является мишенью TGF3 (Lindquist J.N. et al., 2000).
Контракти л ьность звездчатых клеток значительно возрастает при активации, что приводит к повышению портального сопротивления. Активированные звездчатые клетки препятствуют портальному кровотоку как путем сокращения отдельных синусоидов. Эндотелии-1 - ведущий контрак-тильный стимул в отношении звездчатых клеток. Звездчатые клетки (а также клетки Купфера и эндотелиоциты) продуцируют окись азота (NO), физиологический антагонист эндотелина-1. Контрактильная активность звездчатых клеток in vivo отражает относительную силу этих оппозиционных факторов, с дисбалансом, смещенным в сторону эндотелина при про-грессировании заболеваний печени, так как кроме увеличения эндотелина наблюдается снижение окиси азота (Balabaud С. et al., 2004).
В регуляции активации звездчатых клеток играют жизненно важную роль многие аутокринные цитокины, в том числе TGF(31, тромбоцит-активирующий фактор и т.д. Звездчатые клетки также высвобождают хе-моаттрактанты для нейтрофилов и моноцитов - колониестимулирующий фактор, моноцитарный хемотактный протеин-1 и цитокин-индуцируемый нейтрофильный хемоаттрактант. Также идентифицированы противовоспалительные цитокины, продуцируемые звездчатыми клетками, в частности IL-10. Возрастание IL-10 возникает на ранних стадиях активации звездчатых клеток. Интерлейкин-10-блокированные мыши (т.е., животные с генетически детерминированным дефицитом этого протеина) демонстрируют более выраженный фиброз печени после введения СС14.
Активация звездчатых клеток сопровождается потерей характерных для них капель ретиноидов (витамина А). В культуре этот процесс имеет сывороточную зависимость и приводит к высвобождению ретинола в экст-рацеллюлярное пространство. Неизвестно, является ли утрата ретиноидов необходимым условием для активации звездчатых клеток, и может ли предотвращение потери ретиноидов нарушить каскад активации. Этот вопрос остается в области повышенного интереса, отчасти из-за накопления знаний о биологии ретиноидов и их рецепторов в других тканях (Geerts А., 2004).
В дополнение к локальной пролиферации звездчатые клетки аккумулируются в месте повреждения путем хемотаксиса или прямой миграции. В процесс вовлечены несколько хемоаттрактантов, например, тромбоци-тарный фактор роста, являющийся хемоаттрактантом для активированных, но не покоящихся, звездчатых клеток (Hammel P. et al., 2001).
Во время выздоровления от острого заболевания или экспериментального повреждения печени число активированных звездчатых клеток снижается с восстановлением тканевой структуры. Как минимум две возможности рассматриваются в этом аспекте: реверсия активации звездчатых клеток или селективное удаление активированных звездчатых клеток путем апоптоза (Balabaud С. et al., 2004).
Методы светооптического, электронно-микроскопического и иммуногистохимического исследования
Важно отметить, что в образцах печени человека и экспериментальных животных обнаруживается достаточно большое количество звездчатых клеток, но они хорошо видны лишь на полутонких и ультратонких срезах и дифференцируются в пространствах Диссе по наличию в цитоплазме крупных липидных капель. Трансформация звездчатых клеток из «пассивных», накапливающих липидосодержащий материал, в фиброген-ные, продуцирующие компоненты экстрацеллюлярного матрикса, сопровождается исчезновением этого основного морфологического маркера. В связи с этим истинное количество гетерогенной популяции звездчатых клеток печени можно определить, используя комплексное ультраструктурное и иммуногистохимическое исследование.
Методы световой микроскопии. Ткань печени фиксировали в охлажденном до 4С 4%-м растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,2 - 7,4); парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином в комбинации с реакцией Перлса, по ван Гизону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили ШИК-реакцию (Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996). Исследование парафиновых и полутонких срезов проводили в универсальном микроскопе Leica DM 4000В (Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры Leica DFC 320 (Германия) и компьютерной программы Leica QWin.
Методы электронной микроскопии. Образцы, предназначенные для заливки в эпоксидные смолы, дофиксировали в 1% растворе Os04, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, проводили через ацетон и помещали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие срезы (1 мкм) готовили на микротоме Tesla, окрашивали реактивом Шиффа и азуром II.
Ультратонкие срезы (300 - 500 нм) получали на ультрамикротоме LKB III, контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилаце-тата и цитратом свинца в парах щелочи натрия по Рейнольдсу (Уикли Б., 1975) и исследовали в электронном микроскопе «JEM 1010» при ускоряющем напряжении 80 кВт.
Иммуногистохимическое исследование. Звездчатые клетки и другие матрикс-продуцирующие клеточные популяции печени выявляли в динамике развития фиброза по экспрессии гладкомышечного а-актина. Имму-нодетекцию проводили на тонких парафиновых срезах по адаптированной методике иммуногистохимических реакций с использованием монокло-нальных антител (Петров СВ., Райхлин Н.Т., 2000). Для тестирования экспрессии гладкомышечного а-актина в популяциях матрикс-продуцирую-щих клеток печени использовали двухшаговый непрямой иммуноперокси-дазный метод со стрептавидин-биотиновой системой визуализации продуктов реакции.
Образцы печени фиксировали не более 24 ч в охлажденном до 4С 4% параформальдегиде, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига, что способствовало максимальному сохранению тканевых структур и предотвращало разрушение антигенов. Далее материал проводили по стандартной методике приготовления парафиновых блоков со строгим соблюдением температурного режима (не выше 60С в термостатах гистологического автомата АТ-4), чтобы избежать разрушения белковых структур. Парафиновые срезы толщиной 4 - 5 мкм помещали на предметные стекла, предварительно обработанные полилизином (адгезивом) (NCL-BOND, No-voCastra Laboratories Ltd.), и высушивали в термостате при 37С в течение суток.
В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональ-ные антитела к гладкомышечному а-актину (NovoCastra Laboratories Ltd, Великобритания) в разведении 1 : 25; в качестве вторичных антител - универсальные биотинилированные антитела. Инкубацию с первичными и вторичными антителами и реакцию со стрептавидин-пероксидазным комплексом проводили в термостате 37С. Демаскировку антигенов осуществляли кипячением в рабочем растворе ретривагена А (рН 6,5); эндогенную пероксидазную активность гепатоцитов ингибировали 0,3%-ным раствором Н2От в фосфатно-солевом буфере.
После визуализации продуктов иммунной реакции хромогеном (диа-минобензидином) срезы докрашивали в течение 20 мин гематоксилином Майера и оставляли в водопроводной воде на 10 - 15 мин до посинения срезов. Негативным контролем служили препараты без инкубирования с первичными антителами.
Морфометрические и стереологические исследования были проведены на полутонких срезах. На ультратонких срезах имеется возможность еще более глубокого исследования паренхимы и стромы с использованием количественных методов исследования. Морфометрическое и стереологи-ческое исследование биоптатов печени было ориентировано на тесты, характеризующие прогрессию фиброза печени. Они касались паренхиматоз-но-стромальных, в том числе паренхиматозно-васкулярных взаимоотношений, а также оценки количественно-качественного состава популяции гепатоцитов и звездчатых клеток печени.
Стереологический анализ образцов печени проводили на двух уровнях структурной организации - тканевом (на полутонких срезах) и ультраструктурном (на электронограммах) с использованием хорошо разработанных методов, основанных на подсчете числа точек тестовой системы, попавших на профиль исследуемой структуры, и числа пересечений тестовой линии с ее границами (Непомнящих Л.М. и др., 1984; Непомнящих Л.М., Бакарев М.А., 2005).
Стереологический анализ печени крыс проводили с применением окулярной многоцелевой тестовой системы коротких отрезков, в которой отрезок тестовой линии является стороной ромба (п = 36, Р = 72, L = 190 мкм) при конечном увеличении в 1320 раз на полутонких срезах в динамике фиброза органа. При проведении исследования осуществляли по 20 наложений тестовой системы в каждом случае при анализе 5-7 животных в каждой возрастной группе. При исследовании биоптатов печени в динамике фиброза на полутонких срезах оценивали центролобулярные зоны, применяли тестовую решетку (п = 36, Р = 72, L = 650 мкм) при конечном увеличении в 450 раз.
Относительный объем, или объемную плотность, вычисляли как соотношение числа точек, попавших на изучаемые структуры, и общего числа точек в тестовой системе. Относительную площадь поверхности, или поверхностную плотность, вычисляли как удвоенное число пересечений тестовой линии с границами изучаемой структуры, отнесенное к общей длине тестовой линии с учетом конечного увеличения.
Стереологическое исследование и динамика численной плотности звездчатых клеток в онтогенезе
В гепатоцитах отмечены увеличение содержания гликогена и очаговое резкое уплотнение цитоплазматического матрикса; в эндотелиоцитах выявлено резкое колебание уровня пиноцитозной активности. Кроме того, центролобулярные синусоиды значительно сужены; популяция эндотели-альных клеток гетерогенна - большинство содержали крупное овальное эухромное ядро и светлую цитоплазму, меньшая часть клеток имела вид гиперхромной полоски.
При электронно-микроскопическом исследовании установлено нарастание дегенеративно-дистрофических процессов в паренхиматозных клетках печени крыс OXYS, значительно опережающее аналогичные явления у крыс Вистар. В цитоплазме гепатоцитов обнаружены многочисленные гранулы липофусцина (маркер гипоксии и/или старения клеток), полиморфные резидуальные тельца, единичные липидные капли.
У крыс OXYS отмечалась гетерогенность гепатоцитов по наличию фокусов внутриклеточной регенерации (скоплений параллельных профилей гранулярной цитоплазматической сети в ассоциации с митохондриями); в целом, они менее многочисленны по сравнению с крысами Вистар аналогичного возраста. Митохондрии были также многочисленны, но приобретали более крупные размеры и полиморфизм; матрикс митохондрий более гомогенен и менее осмиофилен; кристы редкие, очень тонкие, хаотично ориентированные (рис. 10).
У крыс OXYS в возрасте 12 мес приблизительно четверть центроло-булярной популяции звездчатых клеток печени приобретала переходный фенотип с одновременным присутствием в цитоплазме и крупных липид-ных включений, и более развитого белоксинтезирующего компартмента (рис. 11). Перинуклеарно локализовались канальцы гранулярной цито-плазматической сети и приуроченные к ним мелкие митохондрии, в ядрах формировались крупные ядрышки. Это свидетельствовало об индукции синтеза компонентов экстрацеллюлярного матрикса, способных ремодели-ровать пространства Диссе.
Наряду с липидосодержащими и переходными звездчатыми клетками внутри долек локализовались фибробластоподобные звездчатые клетки, утратившие липидные капли и активизировавшие белоксинтетическую функцию (рис. 12). Среди многочисленных цитоплазматических органелл -свободные рибосомы и полисомы, профили гранулярной цитоплазматиче-ской сети, элементы аппарата Гольджи, мелкие и среднего размера митохондрии с плотным матриксом.
У крыс OXYS в возрасте 24 мес при светооптическом исследовании образцов печени обнаружены в различной степени выраженные гемодина-мические расстройства, проявляющиеся спазмом артерий портальных трактов и расширением просветов вен и синусоидов. Отмечена очаговая дискомплексация печеночных трабекул с хаотичным расположением гепа-тоцитов и расширением интергепатоцеллюлярных пространств.
Популяция паренхиматозных клеток печени характеризовалась моно-морфностью, более мелкими, чем у контрольных животных, размерами клеток. Ядра гепатоцитов имели округлую форму, гладкие контуры, иногда 1-2 ядрышка; двуядерные клетки немногочисленны. Интрацеллюляр-но нередко обнаруживали единичные мелкие липидные включения; содержание гликогена в большинстве гепатоцитов было минимальным.
Обращали на себя внимание изменения микрососудов. На фоне сужения синусоидов обнаружено расширение пространств Диссе и гипертрофия большинства эндотелиальных клеток. Эндотелиоциты содержали крупные бобовидные ядра и часто широкие периферические отростки цитоплазмы. Меньшая часть эндотелиоцитов имела гиперхромные ядра с глубокими инвагинациями нуклеолеммы, эндотелиальная выстилка выглядела резко суженной и деформированной.
Отмечены значительный перицентральный фиброз и умеренное расширение портальной стромы с небольшой пролиферацией эпителия желчных протоков; вторичный парез центральных вен и артерий портальных трактов, сопровождающийся значительной атрофией эндотелиоцитов. Клеточная инфильтрация стромы имела исключительно мононуклеарный характер с преобладанием фибробластов; достаточно часто среди клеточных элементов в портальных трактах локализовались макрофаги и тучные клетки с гетерогенными гранулами (рис. 13).
В целом, печень крыс OXYS в возрасте 24 мес характеризовалась умеренно выраженной дискомплексацией печеночных трабекул и более выраженным по сравнению с Вистар полиморфизмом паренхиматозных клеток: неравномерным включением гликогена в пределах долек, ацидофильной и липидной дегенерацией перипортальных и перицентральных гепатоцитов, опустошенностью цитоплазмы части гепатоцитов (рис. 14, 15, 16, 17).
В портальных трактах отмечена умеренная пролиферация эпителия желчных протоков и очаговая выраженная мононуклеарная инфильтрация; встречались также лимфоидные агрегаты. Наблюдались в различной степени выраженный фиброз центральных вен и неравномерное расширение преимущественно перицентральных синусоидов. Отмечены единичные пе-риваскулярные сидерофаги.
Иммуногистохимическое, морфометрическое и стереологическое исследование печени в динамике фиброза
Изучены количественно-качественные характеристики популяций гепатоцитов и звездчатых клеток в динамике фиброза печени при хронических гепатитах С и С+В.
При хроническом гепатите С обнаружена значительная гетерогенность гепатоцитов: от фокальной редукции внутриклеточных органелл и отложений гликогена до почти тотальной «опустошенности» цитоплазма-тического матрикса и/или наличия мелковезикулярной липидной инфильтрации (рис. 25).
Дегенерирующие мембранные органеллы объединялись с лизосомами, формируя вторичные лизосомы с последующим превращением их в гетерогенные резидуальные тельца. В качестве компенсаторной реакции в части преимущественно перипортальных гепатоцитов перинуклеарно локализованы «островки» внутриклеточной регенерации, содержащие элементы гранулярной цитоплазматической сети и мелкие митохондрии с плотным матриксом.
При хронической микст-инфекции HCV+HBV, т.е. при дополнительном воздействии ДНК-вируса гепатита В, наибольшую роль играла ацидофильная дегенерация перипортальных гепатоцитов с развитием некробио-тических изменений. В центролобулярных и перицентральных гепатоцитах часто локализовались полиморфные липидные включения; встречались клетки с признаками ацидофильной дегенерации - с гомогенной, резко эо-зинофильной цитоплазмой и пикнотичными ядрами.
В большинстве биоптатов наблюдали заметное расширение и деформацию портальных трактов за счет клеточной инфильтрации и склероза, обычно с сохранением четких паренхиматозно-стромальных границ.
Важно отметить, что во многих гепатоцитах митохондрии имели разрушенные кристы и электронно-светлый матрикс (рис. 26); часть органелл подвергалась деструкции с формированием аутофагосом. Дегенеративные изменения митохондрий можно интерпретировать как проявления оксида-тивного стресса, ведущие к снижению энергообеспечения паренхиматозных клеток печени и, следовательно, их функциональной активности.
При исследовании парафиновых срезов, окрашенных по ван Гизону, стадии фиброза были распределены следующим образом: в большинстве наблюдений фиброз носил минимальный или слабо выраженный характер и локализовался в пределах портальной стромы (стадия F0 - 1) - в 54 случаях, у 20 пациентов в биоптатах печени выявлены единичные порто-портальные септы (стадия F2), у 15 - выраженный фиброз с множественными септами (стадия F3) и у 15 - трансформация в цирроз печени, в том числе с формированием ложных долек (рис. 27).
Фиброзные изменения печени значительно варьировали, стадии фиброза II и III и трансформация в цирроз печени ассоциировались с микст-гепатитом или значительными токсическими воздействиями. В этих случаях ремоделированы пространства Диссе с многочисленными коллагеновы-ми фибриллами (рис. 28, 29).
Популяция эндотелиальных клеток синусоидов характеризовалась полиморфизмом ультраструктурной организации с варьированием электронной плотности цитоплазмы и в разной степени выраженными альтерацией и редукцией органелл биосинтеза и пиноцитозных везикул. Клетки Купфе-ра имели ультраструктурные признаки повышенной функциональной активности: хорошо развитую цитоплазматическую сеть и обилие полиморфных лизосом.
На начальных стадиях фиброза (О, I) при хронической HCV-инфекции и микст-инфекции HCV+HBV на полутонких срезах популяция звездчатых клеток печени отличалась выраженным полиморфизмом по размерам, форме, количеству липидных капель и их тинкториальным свойствам (различия в осмиофильности липидосодержащего материала в разных клетках) (рис. 30).
При электронно-микроскопическом исследовании популяция звездчатых клеток еще более гетерогенна - отмечены неравномерность в электронной плотности липидных капель не только в пределах одной клетки, но и между разными липоцитами. Иногда на фоне светлого липидного субстрата формировался более осмиофильный маргинальный ободок; кроме того, резко полиморфны ядра, варьировала длина цитоплазматических отростков (рис. 31, 32).
Характерной ультраструктурной особенностью липидосодержащих звездчатых клеток, наряду с присутствием липидных капель, можно считать очень малое количество цитоплазматического матрикса, бедного мембранными органеллами, в том числе митохондриями, в связи с чем, по-видимому, данный фенотип липоцитов называют «покоящимся», или «пассивным».
При прогрессировании фиброза печени (стадии II и III) ультраструктура большинства звездчатых клеток приобретала так называемый смешанный, или переходный, фенотип - одновременное присутствие морфологических признаков и липидосодержащей, и фибробластоподобной клетки (рис. 33). В таких липоцитах ядра имели глубокие инвагинации нуклеолеммы, более крупное ядрышко, увеличенный объем цитоплазмы, сохраняющей липидные капли. Одновременно резко возрастало количество митохондрий, свободных рибосом, полисом и канальцев гранулярной цитоплазматической сети.
