Содержание к диссертации
Введение
I. Теоретические основы и перспективы применения цитогенетического метода анализа микроядер (обзор литературы) 9
1.1. Механизмы образования и свойства микроядер 9
1.2. Микроядерный тест в обновляющихся клеточных популяциях 12
1.3. Микроядерный тест в растущих клеточных популяциях 15
1.4. Механизмы повреждения клеток при действии метилнитрозомочевины 18
II. Материал и методы исследования 22
III. Анализ клеток с микроядрами в оценке пролиферации эпителия щитовидной железы 29
III. 1. Пролиферативная активность тиреоидной паренхимы 29
III. 1.1. Регенерация после гемитироидэктомии 29
III. 1.2. Патологические митозы при введении мутагена 32
III.2. Морфологическая и морфометрическая характеристика микроядер в фолликулярных тироцитах 35
III.3. Плоидность тиреоидной паренхимы 44
III.4. Количественный анализ частоты образования клеток с микроядрами в щитовидной железе при введении метилнитрозомочевины 47
III.4.1. Однократное введение мутагена 47
III.4.2. Повторное введение мутагена 54
III.5. Продолжительность существования микронуклеированных тироцитов в популяции 63
IV. Обсуждение результатов исследования 66
V. Выводы 75
VI. Практические рекомендации 77
VII. Литература 78
- Механизмы повреждения клеток при действии метилнитрозомочевины
- Регенерация после гемитироидэктомии
- Морфологическая и морфометрическая характеристика микроядер в фолликулярных тироцитах
- Однократное введение мутагена
Механизмы повреждения клеток при действии метилнитрозомочевины
Па этане разработки и апробации новых тест-систем цитогенетического метода анализа микроядер в качестве мутагенов используют детально изученные на других клеточных линиях вещества с выраженной генотоксичностью и известным механизмом повреждающего действия на клетки. В качестве «стандартных» анеугенов обычно применяются соединения, преимущественно повреждающие митотическое веретено: винбластин, винкристин, колхицин [89, 105, 133]; повреждения хромосом наиболее часто воспроизводятся митомицином С [126, 133] или метилнитрозомочевиной [32, 165]. Последнее соединение относится к числу наиболее мощных генотоксических агентов.
Метилнитрозомочевина (MNU, N-methyl-N-nitrosourea) - высокотоксическое мутагенное, карциногенное и тератогенное вещество. Оно обладает выраженным мутагенным действием на бактерии, грибы, высшие растения и животные клетки; является карциногеном для клеток нервной системы, кишечника, почек, желудка, мочевого пузыря, мочеточника, щитовидной железы крыс, мышей и хомячков; характеризуется отчетливым тератогенным эффектом [83].
Метилнитрозомочевина обладает чрезвычайно высокой активностью в индуцировании хромосомных аберраций в клетках животных и человека. Действуя на ядерный аппарат в интерфазе и во время митоза, MNU вызывает множественные повреждения хромосом: точечные мутации, разрывы хроматид, транслокацнп, делеции, а также сестринский хроматидный обмен [55, 83, 132, 165]. При кратковременном действии препарата на хроматиды и хромосомы преобладают процессы алкилирования, вызывающие преимущественно к точковые мутации; при продолжительной экспозиции к алкилированию присоединяется карбамоилирование, что приводит к развитию более грубых повреждений генома [36].
Индуцированные MNU аберрации носят неслучайный характер: описано избирательное поражение определенных хромосом [37, 109, 112, 206] и их участков, в большей степени поражаются те нуклеосомы, в которых наиболее интенсивно идут процессы транскрипции [61].
Будучи ярко выраженным кластогеном, метилнитрозомочевина способна также вызывать повреждения митотического аппарата клетки [31]. Об этом также свидетельствует и факт закономерного обнаружения центромер-позитивных (содержащих целые хромосомы) микроядер после обработки препаратом культур фибробластов [71] и лимфоцитов, в последнем случае их доля достигала 15% [93].
Введение метилнитрозомочевнны вызывает доза-зависимый подъем концентрации микронуклеированных ПХЭ в красном костном мозге [11, 139, 174], сперматогенных клеток в семенниках [54, ПО], эпителиоцитов в выстилке тонкой и толстой кишки [82, 160]. Сходный эффект препарата отмечен в опытах in vitro: в культурах лимфоцитов [91, 93, 177], фибробластов [36, 71], а также гепатомы [194] и глиомы [114].
О генотоксическом влиянии метилнитрозомочевины на тиреоидную паренхиму свидетельствуют экспериментальные работы по индукции опухолей щитовидной железы. Однократное введение препарата крысам в сочетании с продолжительной стимуляцией гиперпластических процессов тиреоидного эпителия низкойодной диетой или зобогенными препаратами (метилтиоурацил, пропилтиоурацил) приводит к развитию диффузной и очаговой гиперплазии паренхимы и появлению множественных опухолевых узелков, морфологически идентифицируемых как фолликулярная аденома или карцинома, папиллярная или смешанная карцинома [95, 138, 141, 149, 179, 187]. Однократная инъекция MNU в сочетании с хронической гиперкальциемией приводит к развитию в ЩЖ крыс опухолей из С-клеток [46, 47]. Карциногенный эффект метилнитрозомочевины передается трансплацентарио, о чем свидетельствуют эксперименты по индукции тиреоидных неоплазий у потомства крыс, получавших препарат во время беременности [2, 30]. Однако исследования по детальному изучению генотоксического действия данного мутагена на морфологию интерфазных и делящихся тироцитов (включая и феномен микронуклеации) в литературе отсутствуют.
Таким образом, микроядерный тест на клетках млекопитающих и человека в опытах in vitro и in vivo широко используется для выявления мутагенных и антимутагенных свойств различных классов химических соединений, изучения влияния факторов окружающей среды на геном, молекулярной эпидемиологии и оценки факторов риска развития опухолевого роста [19, 49, 76, 152, 175, 193, 196]. Кроме решения прикладных задач, микроядра - прекрасная модель для изучения ряда фундаментальных вопросов клеточной биологии: образование и роль ядрышка в метаболизме, репродукция отдельных хромосом и их фрагментов, условия слияния ядер [4], а также механизмов подержания стабильности генома и генетического контроля клеточного цикла в нормальных и опухолевых клетках [164,170, 181].
Анализ литературы свидетельствует о необходимости и своевременности углубленного исследования клеток с микроядрами в популяции фолликулярных тироцитов и проведения на этой основе оценки информативности микроядерного теста для биоиндикации генотксических повреждений щитовидной железы в опытах in vivo.
Регенерация после гемитироидэктомии
Поскольку количество образующихся микроядер в популяции зависит не только от силы генотоксичного эффекта повреждающих факторов на тиреодный эпителий, но и от пролиферативных свойств используемой клеточной тест-системы (количество мишеней для кластогенного и анеугешюго влияния мутагенов), проведено количественное изучение динамики митотической активности фолликулярных тироцптов в ЩЖ в течение 15 сут. после левостронней гемитироидэктомии.
При изучении гистологических препаратов на протяжении первой недели эксперимента в паренхиме ЩЖ отмечаются достаточно многочисленные митотически делящиеся тиреоидпые клетки (рис.3). При подсчете на гистологических срезах отмечена однократная волна подъема МИ тироцптов в интервале 2-7 сут. (рис. 4а) с максимумом на 4 и 5 сут. (соответственно 4,1 + 0,7 %о и 4,2 + 0,8 %о; в контроле - 0,2 + 0,1 %о; р 0,05). Через 9 сут. концентрация митотически делящихся эпителиоцитов статистически достоверно не отличается от уровня интактных крыс (0,42 + 0,15 %о; р 0,05), на этом уровне митотическая активность стабилизируется вплоть до 15 сут.
Одновременно, к 3 сут. отмечен выраженный рост концентрации двуядерных тироцптов с 0,2 + 0,1% в контроле до 1,4 + 0,3% на 3 сут. и 1,7 + 0,4% на 7 сут. после операции (р 0,01); на все последующие сроки данный показатель также стабилизируется (рис.4,6).
Таким образом, 9-10 сутки после 50% резекции ЩЖ (время завершения подъема пролиферативной активности основной массы стимулированных к делению тироцптов) является оптимальным сроком регистрации ге-нотоксического эффекта в микроядерном тесте.
Морфологическая и морфометрическая характеристика микроядер в фолликулярных тироцитах
а) Микроскопическая структура
Морфология микроядер в тироцитах существенно варьирует: более крупные из них по структуре хроматина близки к основным ядрам (рис. 7 а,б,в). Более мелкие микроядра чаще содержат преимущественно тонкодисперсный эухроматин и поэтому выглядят оптически более светлыми (рис.7 г,д).
Основные ядра в аберрантных клетках сходны по микроскопическому строению с ядрами одноядерных тироцитов, по сравнению с последними они достаточно часто содержат многочисленные глыбки гетерохроматина и поэтому выглядят гиперхромными (рис.7 а„ б рис.8 а).
В среднем 94% микронуклеированных клеток содержали 1 (рис.7) и не более 6% - 2 микроядра (рис.8 а, б, в), лишь в единичных.случаях обнаруживались тироциты с 3 микроядрами (рис.8 г).
б) Морфометрия
Количественные результаты измерения размеров и оптической плотности микроядер, образовавшихся при введении малых и больших доз мутагена, не выявили значимых различий изученных показателей (таблица 2). Это послужило основанием в дальнейшем проводить углубленный количественный анализ ядерных структур в расчете на всю популяцию микронуклеированных тироцитов (независимо от дозы мутагена). Результаты проведенных количественных измерений обобщены в таблице 3 и на рисунках 9, 10 и 11.
Средняя площадь микроядер, измеренная на изолированных тироцитах, составила около 20% от общей площади ядерного аппарата аберрантных клеток. Этот показатель варьировал в диапазоне от 3 до 35 мкм2 (рис.9, 26).
Углубленный анализ гистограммы распределения микроядер по классам площади с шагом 1 мкм показал (рис.10), что среди микроядер можно выделить 3 основных размерных класса: А - мелкие (площадь 3-9 мкм2), В - средние (площадь 10-20 мкм2) и С- крупные (площадь 21-35 мкм ). Доли клеток каждого класса среди всех измеренных микроядер составили соответственно 39,4; 42,3 и 18,3%
Результаты измерения интегральных оптических характеристик ядерных структур свидетельствуют, что удельная оптическая плотность и средний уровень оттенка серого цвета ядер одноядерных тироцитов и основных ядер микронуклеированных клеток значимо не отличаются (р 0,05); гистограммы распределения данных структур по классам удельной оптической плотности имеют сходный характер. В то же время, средние значения данных показателей, рассчитанные для микроядер, отличались в среднем на 10% от соответствующих параметров одноядерных тироцитов (р 0,05), что однозначно свидетельствует об их более низкой оптической плотности и объективно подтверждает результаты визуального микроскопического анализа. На гистограммах оптической плотности микроядер также отчетливо виден сдвиг влево по сравнению с основными ядрами (рис. 11, 26).
Анализ зависимости удельной оптической плотности микроядер (у) от их средней площади (х) показал наличие умеренной по силе прямой связи (коэффициент корреляции Пирсона г = +0,30; р 0,05), зависимость между этими параметрами может быть описана уравнением линейной регрессии: у =115,9 + 0,76 X
Необходимо отметить, что внутри каждого класса площади микроядер, вариабельность их удельной оптической плотности оказалась достаточно выраженной (рис.12).
Однократное введение мутагена
В данной серии опытов проведен сравнительный анализ чувствительности микроядерного теста, выполненного на клетках тиреоидного эпителия и эритроидных клетках красного костного мозга (рис.15) через 4 сут. после однократного введения метилнитрозомочевины в диапазоне доз 0,1 - 12,8 мг/кг массы животного.
Динамика содержания клеток с микроядрами представлена в таблице 5. Для обеих изученных популяций доза 0,1 мг/кг явилась субпороговой (различия с контролем статистически не достоверны, р 0,05). Отмечен отчетливый доза-зависимый эффект образования клеток с микроядрами от количества введенного мутагена в диапазоне 0,2-3,2 мг/кг для тироцитов и 0,2-0,8 мг/кг - для полихроматофильных эритробластов (ПХЭб). Концентрация микронуклеированных клеток в ЩЖ стабилизируется при дозе мутагена 6,4 мг/кг, в красном костном мозгу - начиная с дозы 1,6 мг/кг; данный феномен может быть объяснен наблюдаемым при введении избыточных доз мутагена возрастанием частоты летальных мутаций клеток и их элиминацией из популяций.
Мазок клеток красного костного мозга. Фикс. 96% этанолом, окр. галлоцианин-хромовыми квасцами и эозином. О6.90, ок.7.
В диапазоне невысоких доз (0,1-0,8 мг/кг) зависимость частоты микронуклеированных клеток (Y) от дозы мутагена (X) аппроксимируется сходными (р 0,05) уравнениями линейной регрессии (рис.16, Б ) :
Y = 0,165 + 0,955 X - для тироцитов и
Y = 0,488 + 0,955 X - для ПХЭб.
В ЩЖ увеличение дозы MNU приводит к возрастанию среднего числа микроядер в 1 микронуклеированной клетке, что свидетельствует о большей частоте хромосомных повреждений; в красном костном мозгу подобной отчетливой зависимости зарегистрировать не удалось (рис. 17).
Результаты однофакторного дисперсионного анализа (таблица 6) также свидетельствуют о высокой степени влияния контролируемого фактора А (доза мутагена) на содержание микронуклеированных клеток в популяциях тироцитов (р 0,001) и ПХЭб (р 0,02), обусловившего соответственно 92% и 39% общего уровня вариации изученных показателей. Доза мутагена также оказалась значимым фактором, влияющим на среднее число микроядер в аберрантной клетке (р 0,001) и обусловившим 67% общего уровня вариации данного параметра, для красного костного мозга влияние фактора на этот показатель оказалось недостоверным (р 0,05).
В целом, микроядерный тест на модели предварительно стимулированных к размножению фолликулярных тироцитов в опытах in vivo при однократном введении метилнитрозомочевины оказался по чувствительности сопоставим с таковым на эритроидных клетках костного мозга (о чем говорит сходный характер линейной зависимости «доза-эффект» в диапазоне невысоких доз MNU для обеих клеточных тест-систем), однако, по сравнению с последним, позволяет регистрировать действие мутагена в более широком диапазоне доз и отличается большей воспроизводимостью (о последнем свидетельствует существенно более выраженная сила влияния фактора А [доза мутагена] на изученные показатели в популяции тироцитов по сравнению с ПХЭб).
