Регуляция сборки и разборки микротрубочек в клетках Гельфанд, Владимир Израилевич

Содержание к диссертации

Стр.

1. ВВЕДЕНИЕ 5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОТРУБОЧЕК 12

2. СВОЙСТВА ТУБУЛИНА 15

3. ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ ТУБУЛИНА .... 19

4. СВЯЗЫВАНИЕ ТУБУЛИНА С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ ЛЙГАН-ДАМИ 25

5. САМОСБОРКА МЙКРОТРУБОЧЕК 32

6. Общие свойства реакции и роль олигомера тубулина 32

7. Сборка микротрубочек описывается механизмом нуклеации-полимеризации 34

8. Промежуточные продукты при сборке .... 36

9. Роль ГТФ в сборке 39

10. Полярность микротрубочек 42

11. Центры сборки микротрубочек 49

12. Регуляция сборки микротрубочек ионами кальция 57

13. Влияние митостатиков на сборку микротрубочек . 61

6. БЕЛКИ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С МИКРОТРУБОЧКАМИ .... 67

7. ВОЗМОЖНЫЕ ФУНКЦИИ МИКРОТРУБОЧЕК 78

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 86

3.1. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 86

1. Препаративные методы 86

2. Аналитические методы 91

3.2. ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ .... 96

Стр.

3. Цитологические методы 96

4. Иммунологические методы 102

4. РЕЗУЛЬТАТЫ 109

4.1. ИССЛЩШАНИЕ СБОРКИ И РАЗБОРКИ МИКРОТРУБОЧЕК

ІН VITRO 109

5. Состав препарата микротрубочек и постановка задачи по выделению MAP 109

6. Термостабильность факторов и общий подход

к выделению MAP Ill

3. Выделение белка МАР2 из гомогената мозга 116

4. Выделение белка MAPI и "нативного" белка МАР2 из препарата белков микротрубочек. . 128

5. Роль высокомолекулярных МАР в сборке и

их взаимодействие с микротрубочками . . . 142

4.2. ИССЛЩОВАНИЕ СБОРКИ И РАЗБОРКИ МИКРОТРУБОЧЖ

ш vivo 174

1. Разработка метода экстракции клеток для выявления микротрубочек с помощью иммуно-фдуоресцентного окрашивания 174

2. МАР2 входит в состав микротрубочек в культивируемых клетках 193

3. Гетерогенность цитоплазматических микротрубочек по чувствительности к деполимеризации охлаждением 201

4. Связывание деполимеризованного тубулина с актином 212

5. Сравнение действия колхицина и колцемида

на микротрубочки ..... 218

6. Действие АТФ на деполимеризацию цитоплазматических микротрубочек 226

7. Роль центриолей в стабилизации цитоплазматических микротрубочек 239

Стр.

5. ОБСУЖДЕНИЕ 250

1. РОЛЬ СБОРКИ И РАЗБОРКИ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ІЩГО-ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МИКРОТРУБОЧЕК 250

2. СВОЙСТВА ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ MAP И РЕГУЛЯЦИЯ ИМИ СБОРКИ МИКРОТРУБОЧЕК 253

3. МЕХАНИЗМЫ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ СБОРКУ И РАЗБОРКУ МИКРОТРУБОЧЕК В МЕТКАХ 264

6. В Ы В О Д Ы 286

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 289

Введение к работе

Актуальность проблемы

Одним из важнейших достижений современной цитологии является открытие системы фибриллярных структур клетки, объединяющих в единое целое все компоненты клеточной цитоплазмы, и получивших название цитоскелета. Существование подобных структур было предсказано еще Кольцовым (Кольцов, 1905), но лишь исследования последних лет позволили достоверно описать эти структуры и показать, что цитоскелет или, точнее, "опорно-двигательный" аппарат играет ключевую роль в организации цитоплазмы эукариотических клеток. Цитоскелетные структуры принимают участие во всех процессах внутриклеточного транспорта, обеспечивают упорядоченное расположение органелл в цитоплазме клеток, являются теми структурами, за счет которых происходит перемещение как одноклеточных организмов, так и отдельных клеток в составе многоклеточного организма. Более того, состояние цитоскелета может регулировать многие процессы внутриклеточного обмена, например, синтез ДНК и РНК. Есть основания считать, что генетически обусловленные изменения цитоске-летных структур лежат в основе многих патологических процессов, в том числе неопластической трансформации и, в частности, таких ее проявлений, как способность к неконтролируемой пролиферации, инвазии и метасФазированию.

Среди трех известных в настоящий момент типов цитоскелет-ных структур (микрофиламенты, промежуточные филаменты, микротрубочки) особенно важное место занимает система микротрубочек. Разрушение микротрубочек с помощью специфических ингибиторов приводит к потере полярности клеток, ингибирует многие формы внутриклеточного движения (митоз, аксоплазматический транспорт,

некоторые формы секреции), нарушает нормальное распределение орган елл в цитоплазме (например, митохондрий, комплекса Гольджи, лизосом). В клетках с разрушенными микротрубочками происходит перестройка других компонентов цитоскелета, в том числе резкое перераспределение промежуточных филаментов и изменение расположения пучков микрофиламентов. Следовательно, микротрубочки определяют не только многие внутриклеточные процессы, но и нормальное функционирование других цитоскелетных структур.

Микротрубочки являются универсальным компонентом эукариоти-ческих клеток. Они формируют также специализированные двигательные структуры - реснички и жгутики, где вместе со специфической АТФазой, динеином и другими дополнительными белками обеспечивают превращение энергии АТФ в механическую энергию. Микротрубочки являются основным компонентом митотического веретена. Наконец, они являются важнейшим компонентом цитоплазмы интерфазных клеток, причем в клетках, имеющих длинные отростки, например, в нейронах, белки микротрубочек могут составлять до 20% от общего клеточного белка.

В клетках микротрубочки связаны с центрами организации -центриолями с окружающими их структурами, кинетохорами метафаз-ных хромосом и базальними телами ресничек и жгутиков.

Основным компонентом микротрубочек является белок тубулин; он формирует стенку микротрубочек и способен в подходящих условиях образовывать микротрубочки. Кроме тубулина в состав микротрубочек входят и другие белки; их содержание в микротрубочках значительно ниже. Минорные компоненты микротрубочек получили название белков, ассоциированных с микротрубочками.

Микротрубочки, как и другие компоненты цитоскелета, представляют собой весьма динамичные лабильные образования. В клетке

они постоянно подвергаются процессам сборки и разборки. Так, перед началом митоза происходит тотальная разборка цитоплазмати-ческих микротрубочек и построение из образующихся мономеров ми-тотического веретена, а по завершении митоза микротрубочки мито-тического веретена разбираются и из этого материала вновь образуются щтоплазматические микротрубочки. Более того, даже в интерфазной клетке микротрубочки находятся в состоянии динамического равновесия с пулом деполимеризованного тубулина.

Ингибирование любой из реакций, участвующих в поддержании равновесия (и сборки, и разборки), приводит к подавлению зависимых от микротрубочек функций. Таким образом, постоянная сборка и разборка микротрубочек необходима для их нормального функционирования.

Однако, до сих пор механизмы, регулирующие сборку микротрубочек в клетке, оставались изученными весьма слабо. Ряд данных указывал, что сборка микротрубочек из тубулина может проходить лишь в присутствии минорных белков, ассоциированных с микротрубочками. Тем не менее, до сих пор эти белки не были получены в индивидуальном виде и их влияние на сборку микротрубочек не изучалось. Еще меньше данных имелось относительно регуляции сборки микротрубочек в живых клетках. В частности, не было изучено, как влияют на сборку микротрубочек и их стабильность такие основные параметры жизнедеятельности клеток, как концентрация АТФ в цитоплазме. Не было ясно, представляют ли собой цитоплазматические микротрубочки гомогенную популяцию или они различаются по чувствительности к деполимеризующим воздействиям. Хотя и было известно, что сборка цитоплазматических микротрубочек в клетке начинается от центриолей, не было исследовано, необходимы ли эти структуры для стабилизации уже собранных микротрубочек. Все ска-

занное выше и определило цель и непосредственные экспериментальные задачи нашей работы.

Дель и задачи работы

Цель работы состояла в том, чтобы изучить механизмы, регулирующие сборку и разборку микротрубочек в клетках. При этом были применены два экспериментальных подхода: исследование сборки микротрубочек в бесклеточной системе и исследование механизмов, определяющих стабильность микротрубочек в культивируемых клетках.

Экспериментальные задачи работы состояли в следующем:

1. Разработать методы выделения индивидуальных белков, ассоциированных с микротрубочками MAPI и МАР2.

2. Изучить влияние белков MAPI и МАР2 на сборку микротрубочек из тубулина.

3. Выяснить, какие структуры образуют MAPI и МАР2 на стенках микротрубочек, способны ли они связываться с микротрубочками поодиночке и каково взаимоотношение мест связывания MAPI и МАР2 с микротрубочками.

4. Для исследования механизмов, определяющих стабильность микротрубочек в клетках, разработать метод удаления плазматических мембран и растворимых клеточных белков, сохраняющий питоскелетные структуры.

5. Для анализа роли центриолей в стабильности цитоплазматичес-ких микротрубочек получить фрагменты клеток, не содержащие центриолей и проанализировать поведение микротрубочек в этих фрагментах.

6. Для исследования вопроса о возможной гетерогенности цитоплаз-матических микротрубочек по стабильности изучить их разборку под действием охлаждения и митостатиков.

7) Изучить роль клеточной энергетики в регуляции состояния микротрубочек в клетках.

Научная новизна и научно-практическая ценность -работы

В результате настоящей работы впервые проведено систематическое исследование факторов, контролирующих сборку микротрубочек in vivo и in vitro . Показано, что одним из факторов, контролирующих сборку микротрубочек, является их связывание с ассоциированными белками. Найдено, что сборка микротрубочек стимулируется индивидуальными белками MAPI и МАР2, ассоциированными с микротрубочками. Как MAPI, так и МАР2 включаются в состав формирующихся в их присутствии микротрубочек, образуя на их поверхности периодически расположенные выросты ("ручки"). Для выполнения этих исследований впервые разработаны методы выделения из мозга высокомолекулярных белков, ассоциированных с микротрубоч-ками (MAPI и МАР2).

Показано, что система цитоплазматических микротрубочек является гетерогенный по стабильности. Понижение температуры инкубации до 0С вызывает деполимеризацию основной массы микротрубочек в клетках, тогда как часть микротрубочек нечувствительна даже к длительному понижению температуры.

Впервые было обнаружено, что ключевым фактором, от которого зависит состояние микротрубочек в клетках, является концентрация АТФ. Снижение концентрации АТФ в клетках с помощью различных ингибиторов энергетического обмена приводит к резкому снижению скорости деполимеризации микротрубочек в клетках. Напротив, инкубация цитоскелетных препаратов, полученных экстракцией клеток тритоном Х-100, с АТФ приводит к резкому ускорению разборки микротрубочек. Таким образом, механизм регуляции стабильности цитоплазматических микротрубочек в клетках зависит от АТФ. Возможно,

что именно зависимость от АТФ связывает состояние цитоскелета в клетках со всем клеточным обменом и энергетикой.

Для исследования роли клеточных центров в стабильности микротрубочек мы получили жизнеспособные фрагменты периферической цитоплазмы клеток, не содержащие центриолей. Впервые удалось показать, что в таких фрагментах происходит постепенное разрушение цитоплазматических микротрубочек. Такое разрушение происходит без уменьшения жизнеспособности фрагментов и не сопровождается разрушением других цитоскелетных структур - пучков микрофиламен-тов и промежуточных филаментов. Таким образом, центриоли являются не только центрами организации микротрубочек, но и структурами, от которых зависит их стабильность.

Для повышения избирательности иммунофлуоресцентного окрашивания по отношению к полимеризованному тубулину нами разработан метод экстракции культивируемых клеток детергентом тритоном Х-100. Обработка клеток по этому методу полностью удаляет из них все мембранные структуры и растворимые белки, но сохраняет микротрубочки и другие компоненты цитоскелета. Этот метод может широко применяться в цитологии для исследования цитоскелета иммуно-флуоресцентными методами и для изучения структуры цитоскелета методами сканирующей электронной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии платиновых реплик, поскольку после экстракции цитоскелетные структуры оказываются экспонированными снаружи, а не скрытыми плазматической мембраной. Кроме того, использование экстрагированных клеток дает возможность изучать действие на цитоскелет таких агентов, которые не проникают через плазматическую мембрану живых клеток.

Таким образом, в настоящей работе выявлен ряд закономерностей регуляции состояния микротрубочек в клетках. Показано, что

- II -

сборка и подцержание полимеризованного состояния тубулина в клетках регулируется тремя факторами: белками, ассоциированными с микротрубочками, клеточными центрами и АТФ. От соотношения этих трех факторов зависит скорость процессов сборки и разборки микротрубочек.

Поскольку агенты, разрушающие микротрубочки, широко используются в качестве лечебных препаратов (например, как цитостатики для лечения онкологических заболеваний, а также для подавления направленной миграции клеток в очаги воспаления при ряде других болезней), разработанные в нашей работе методы контролируемой разборки микротрубочек могут быть использованы для первичного отбора новых химических препаратов, обладающих избирательным действием на микротрубочки.

Полученные в работе результаты открывают новые подходы для решения вопроса о том, какую роль процессы сборки и разборки микротрубочек играют в функциях клеток, в частности, в митозе, секреции, аксонном транспорте и т.д. Разработанные в данном исследовании методы выделения белков, ассоциированных с микротрубочками, позволяют также исследовать, как и какие из ассоциированных белков связывают микротрубочки с другими клеточными орга-неллами - промежуточными филаментами, митохондриями, лизосомами, то есть каким способом микротрубочки организуют цитоплазму эука-риотических клеток.

2 . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МЖРОТРУБОЧЕК

Прежде, чем обсуждать вопросы биохимии, сборки и функций микротрубочек в клетке, нагл представляется целесообразным коротко остановиться на рассмотрении методов, которыми исследуются в настоящее время микротрубочки.

Поскольку определение микротрубочек чисто морфологическое, то до сих пор единственный способ убедиться, что исследователь имеет дело именно с микротрубочками - это электронная микроскопия. Используя метод просвечивающей электронной микроскопии можно идентифицировать микротрубочки благодаря их размерам (диаметр 25 нм) и характерной трубчатой морфологии. Таким образом, электронная микроскопия может быть использована и для исследования распределения микротрубочек в клетке и для морфологического анализа продуктов реакции полимеризации тубулина в бесклеточной системе. Между тем, этот метод весьма трудоемок и обладает принципиальным недостатком - на ультратонких срезах можно видеть лишь небольшую часть микротрубочек клетки, а, следовательно, без использования реконструкции по серийным срезам невозможно исследовать тотальное распределение микротрубочек в клетках, изменение распределения и количества микротрубочек после различных воздействий и др.

Эти трудности в значительной мере удается преодолеть, применяя для исследований цитоскелета вообще и микротрубочек, в частности, иммунофлуоресцентные методы. Эти методы и особенно метод непрямой иммунофлуоресценции, обладают высокой чувствительностью и избирательностью, что позволяет при наличии хороших препаратов антител локализовать в клетках интересующие исследо-

- ІЗ -

вателя белки.

В применении к цитоскелетным структурам такой подход был впервые предложен Лазаридесом и Вебером в 1974 году (^azarides, Weber, 1974-), когда эти авторы успешно выявили актин в культивируемых фибробластах. В 1975 году двумя группами исследователей независимо были получены моноспецифические антитела против тубу-лина и показано, что эти антитела декорируют густую сеть фибрилл в цитоплазме и волокна в митотическом аппарате клеток ( Weber et ai., 1975; Fuller et ai., 1975 ). Эта фибриллярная сеть обладала теми же свойствами, что и микротрубочки, например, разрушалась при охлаждении, при действии колхицина.

Вместе с тем, ввиду низкой разрешающей способности световой микроскопии необходимо было прямо показать, что каждая флуоресцирующая фибрилла соответствует одной микротрубочке. Это было сделано в работе ( Osborn et al.,1978 )_{> где} сравнивались иммуно-флуоресцентное и электронно-микроскопическое изображения одной и той же клетки. Оказалось, что при использовании стандартных препаратов флуоресцирующих антител и аффинно очищенных антител к тубулину, интенсивность флуоресценции настолько высока, что количество флуоресцентной метки на одной микротрубочке достаточно, чтобы выявить ее. Таким образом, иммунофлуоресцентная микроскопия представляет собой адекватный метод исследования микротрубочек в целых клетках, позволяет следить за изменением системы микротрубочек при тех или иных воздействиях на клетку и потому является предпочтительным морфологическим методом исследования во всех случаях, когда не требуется анализ тонкой морфологии самих МИКрОТрубОЧВК ( Brinkley et al.,I980 )

Остановимся коротко на методах выделения микротрубочек и исследования их сборки in vitro . Основной объект для выделения

микротрубочек нервная ткань, которая, как уже упоминалось, чрезвычайно богата тубулином. Для выделения микротрубочек из нервной ткани обычно используют метод полимеризации-деполимеризации ( Sheianski et ai.,1973 ), ранее предложенный для выделения актина ( Spudich,Watt, 1971 ) и пригодный, в принципе, для получения любого другого обратимо полимеризующегося белка. Основа метода состоит в чередовании центрифугирований в условиях полимеризации и деполимеризации. После центрифугирования в условиях полимеризации отбрасывается супернатант, а после центрифугирования в условиях деполимеризации - осадок. Такое чередование в условиях полимеризации дает возможность удалять легкие примеси (растворимые белки клетки и т.д.), а в условиях деполимеризации избавляться от тяжелых клеточных фрагментов, а также от агрегатов белка, не способных к деполимеризации. Условия полимеризации при выделении микротрубочек создаются нагреванием образца (обычно до 37С), а деполимеризация достигается его охлаждением до 4С. Два последовательных центрифугирования при 4С и 37С называют циклом полимеризации-деполимеризации. При получении микротрубочек чаще всего используют два таких цикла.

Исследование полимеризации микротрубочек, как правило, проводят методом светорассеяния ( Gaskin et ai., 1974 )» поскольку полимеры такого диаметра, как микротрубочки, хорошо рассеивают свет в ближнем ультрафиолете. Этот метод имеет крупные преимущества; в частности исследование светорассеяния можно проводить непрерывно; существенно, что этот процесс, в отличие, например, от вискозиметрии, не вносит изменений в структуру исследуемого образца. Кроме того, теоретический анализ ( Berne, 1974 ) показывает, что для цилиндрических структур с диаметром намного меньшим, чем их длина, величина светорассеяния прямо пропорциональна массе полимера. Поэтому по величине светорассеяния при сборке

микротрубочек можно непосредственно судить о количестве тубули-на в составе микротрубочек. Метод светорассеяния, как и другие физические методы, применяющиеся при исследовании сборки микро-трубочек, имеет один существенный недостаток - он не позволяет судить, какие іменно структуры образуются в результате реакции полимеризации. Поэтому, когда нет уверенности в том, что в результате полимеризации образовались именно микротрубочки, необходимо проверять чувствительность образующегося полимера к условиям, деполимеризующим микротрубочки (охлаждение или обработка колхицином). Помимо этого существенно показать прямым электронно-микроскопическим методом, что в результате полимеризации образуются микротрубочки, имеющие нормальный диаметр и морфологию.

2.2. СВОЙСТВА ТУБУЛИНА

Впервые данные о свойствах тубулина были получены при исследовании ресничек и жгутиков, поскольку в этих структурах микротрубочки стабильны и их можно выделить с помощью центрифугирования. Уже первые работы на эту тему (Gibbons, 1963; Mohri,I968 ) показали, что основной белок микротрубочек отличается от актина, и поэтому микротрубочки представляют собой, скорее всего, новый тип двигательной структуры. В дальнейшем солюбилизацией белков аксонемы жгутиков морского ежа удалось выделить относительно на-тивный тубулин и показать, что этот белок имеет молекулярную массу 120 000 дальтон, константу седиментации 6S , а тубулин из центральной пары микротрубочек обладает также способностью связывать колхицин (Shelanski, Taylor, 1967; Shelanski, Taylor,1968 ).

Способность тубулина связывать колхицин ниже будет рассмотрена подробнее (см. раздел 2.4); здесь мы лишь отметим, что реакция связывания белка с ³Н-колхицином была использована как метод

тестирования при выделении тубулина из цитоплазмы нервных клеток в классическом исследовании Вейсенберга с соавторами ( Weisenberg

et ai.,i96$ и во многих последующих работах. Цитоплазматический тубулин, как и тубулин жгутиков, представляет собой молекулу С молекулярной массой ОКОЛО 120 000 Дальтон ( Weisenberg et al., 1968). Эта молекула в присутствии денатурирующих агентов распадается на полипептидные цепи, имеющие константу седиментации 3 s и кажущуюся молекулярную массу 53 000-55 000 дальтон. Следовательно, молекула тубулина представляет собой димер. Субъединицы, входящие в состав димера, хотя и близки по молекулярной массе, но не идентичны. В частности, они легко разделяются при электрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия и мочевины, особенно после предварительной модификации (пример, ацетилирования) тубулина (Bryan, Wilson, 1971 ). Особенно хорошо субъединицы тубулина разрешаются при диск-электрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия после карбоксиметилирования белка (Luduena, Woodward, 1975 ). По стандартной номенклатуре субъединицу, имеющую большую подвижность при электрофорезе принято называть е> -субъединицей, а субъединицу с меньшей подвижностью - оС-субъединицей.

Фракционирование тубулина в неденатурирующих условиях никогда не приводит к какому-либо обогащению препарата тубулина oi-или а -субъединицами - оба полипептида присутствуют в препарате в эквимолярных количествах (Bryan, Wilson, 1971 ). Именно поэтому Брайан и Уилсон в указанной работе предположили, что молекула тубулина представляет собой гетеродимер из одной об- и одной р>-цепи, которые прочно связаны друг с другом. Это предположение позднее было прямо подтверждено в опытах по химическим сшивкам тубулина бифункциональными реагентами (Luduena et al., 1977 ). Возможно, однако, что хотя связь между субъединицами тубулина в

составе димера является прочной, все же ассоциация субъединиц в таком комплексе обратима, так как при сильном разбавлении раствора белка его кажущаяся молекулярная масса уменьшается, по-видимому, из-за диссоциации части димеров (Setrich, Williams, 1977 ). Применение различных усложнений при электрофор этическом разделении субъединиц тубулина показало, что как <- , так и р>-субъединицы тубулина имеют по нескольку различных изоформ (см. например,віbring et ai., 1976 ). Особенно большое количество изоформ субъединиц тубулина выявляется при анализе с помощью двумерного электрофореза/изоэлектрического фокусирования по 0 Фарре-лу, когда вместо двух типов полипептидных цепей ( oL- и а -тубу-линов) их обнаруживается 17, причем эти 17 типов белков достоверно отличаются друг от друга по пептидным картам (George et ai., 1981). Более того, оказывается, что количество и электрофорети-ческая подвижность различных форм тубулина достоверно меняются в онтогенезе: например, в мозге новорожденных мышей имеется 6 изотубулинов (AoL и 2/а), а у взрослых животных их количество Возрастает ДО II {6oL И 5fi> )(Denoulet et al., 1982 ). Микро-

гетерогенность тубулина не может объясняться мозаичным составом исследованных клеточных популяций, поскольку даже в единичном нейроне спектр изоформ тубулина такой же, как и в целом мозге ( gozes, Sweander, 1981).

Таким образом, тубулин представляет собой семейство близких белков, а не индивидуальный полипептид, что, впрочем, верно и для большинства других белков цитоскелета.

Тубулин является крайне нестабильным белком, быстро денатурирующим после гомогенизации клеток (Borisy, Taylor, 1967а ). В процессе денатурации происходит агрегация тубулина, а также теряется способность белка к связыванию колхицина (см. ниже) и

к образованию микротрубочек. Эффективная защита тубулина от денатурации достигается I М сахарозой ( Frigon, Lee, 1972 ) и 4 М глицерином (Solomon et ai., 1973 ). Денатурация тубулина замедляется также В присутствии ГТФ (Borisy, Taylor, I967& ).

Первичная структура тубулина была исследована двумя независимыми методами: непосредственно определена с помощью стандартных

приемов беЛКОВОЙ ХИМИИ (Kraus et al., 1981; Ponstingl et al.,

1981) и выведена из последовательности нуклеотидов в ДНК, комплементарной МРНК "С- И & -субъеДИНИЦ тубулина (Valenzuela et al., 1981). Эти исследования дали хорошо согласующиеся результаты. Прежде всего, они подтвердили данные о гетерогенности субъединиц тубулина и показали, что такая гетерогенность обусловлена не только посттрансляционными модификациями тубулина, а вызывается, прежде всего, существованием нескольких различающихся генов для каждой из субъединиц тубулина. Длина молекулы d. -тубулина - 450 аминокислотных остатков, а А -тубулина - 445 остатков. Отчетливо видно, что первичные структуры субъединиц родственны: при оптимальном совмещении свыше 40$ аминокислотных остатков в субъединицах идентичны. Гетерогенность по <*. -тубулину для белка из мозга обнаружена в 6 положениях, а по &-тубулину - в 7 положениях. Сравнение первичной структуры субъединиц тубулина из мозга свиней и кур свидетельствует о высокой эволюционной консервативности тубулина ( Ponstingl et al., 1982 ). Это подтверждается также более ранними данными по частичному анализу первичной структуры тубулина из мозга кур и хвостов сперматозоидов морского ежа ( Luduena, Woodward, 1975 ). Сравнение первичной структуры тубулина из различных источников свидетельствует о том, что скорость эволюции этого белка составляет 0,22 мутации на 100 остатков за

10 лет, что сравнимо со скоростью эволюции гистонов, являющихся

одними из наиболее консервативных белков (Little et ai., 1981). В первичной структуре как С- , так и 6 -тубулина имеется четыре участка гомологии с актином из скелетных мышц. СООН-кон-цевой участок обеих субъединиц напоминает по первичной структуре NH₂ -концевой фрагмент тропонина Т, а пептид 192-244 oi -тубулина гомологичен одному из участков глобулярной головки миозина скелетных мышц. Следует подчеркнуть, что эти гомологии (за исключением, быть может, гомологии с актином) затрагивают лишь ограниченные участки первичной структуры и пока не ясно, имеют ли они какое-бы то ни было функциональное или эволюционное значение.

2.3. ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ ТУБУЛИНА

Тубулин может подвергаться ряду посттрансляционных модификаций. Хотя в настоящее время функциональное значение этих модификаций не ясно, сами модификации изучены достаточно подробно. Наиболее интересной и своеобразной модификацией тубулина является реакция тирозилирования-детирозилирования СООН-конца 2+ (вагга et ai., 1974) и происходит только с участием нативного, но не денатурированного длительным хранением тубулина (Ray-bin, Flavin, 1975). Реакция тирозилирования не зависит от наличия тРНК в экстракте. Кроме тирозина по СООН-концу тубулина могут включаться также фенилала-нин и 3,4-диоксифенилаланин (Arce et ai., 1975). Тирозилирование тубулина не зависит от его синтеза, поскольку эффективно происходит И при подавлении синтеза белка В клетках (Raybin, Flavin, 1977).

Кроме лигазы, тирозилирующей тубулин, во многих тканях об-

наружена также специфическая карбоксипептидаза (Kumar, Flavin, 1981), отщепляющая от оС -тубулина СООН-концевой тирозин. Эта карбоксипептидаза связана с микротрубочками, выделенными из мозга методом полимеризации-деполимеризации (Arce, Barra, 1983 ). Как оказалось, именно детирозилирование тубулина является первичным событием, поскольку нуклеотидная последовательность гена «с-тубулина кодирует СООН-концевой тирозин ( Vaienzueia et ai., 1981), и, следовательно, вначале <к -тубулин синтезируется с С00Н-концевым тирозином. Вместе с тем, содержание тирозина на СООН-кон-ЦЄ d. -тубулина мозга не превышает 25% (Rodriguez, Borisy, 1979 )

Как уже говорилось, физиологическое значение реакции тирози-лирования неясно. Вместе с тем, имеются достаточно определенные сведения о том, что тирозилирование тубулина зависит от физиологического состояния клеток. Так, например, обработка лейкоцитов кролика хемоаттрактантом приводит к резкой стимуляции тирозили-рования, а снятие эффекта конкурентными ингибиторами хемоаттрак-танта снимает и стимуляцию (Nath et ai., I98I ).

По данным вытеснения метки скорость обмена тирозина на СООН-конце oL -тубулина в десятки раз выше, чем скорость обмена самого белка. В то же время, разрушение микротрубочек в клетках колхицином резко снижает скорость обмена тирозина ( Thompson et

al.,1979 ).

Полезным инструментом для исследования роли тирозилирования могут быть моноклональные антитела YL 1/2, полученные в лаборатории Ц.МильштеЙна (Kilmartin et al., 1982 ), специфически связывающиеся с тирозилированным СООН-концом оС -тубулина (Wehiand et ai., 1983Ъ ). С использованием этих антител показано, что тирозилированный СООН-конец оС -тубулина экспонирован на поверхности микротрубочек. Его блокирование антителами не влияет

на способность тубулина образовывать микротрубочки..m vitro и на сборку микротрубочек на клеточных центрах in vivo (wehiand et al., 1983Ъ ). Вместе с тем, введение в клетки антител YL 1/2 в высоких концентрациях (больше 12 мг/мл) приводит к агрегации

МИКротрубочек Вблизи КЛетоЧНОГО ядра (Wehiand, Willingham, 1983).

Эти данные показывают, что тирозилирование не играет роли в полимеризации тубулина, но может быть существенно для взаимодействия микротрубочек с каким-либо компонентом, ответственным за их нормальное распределение в клетках.

Весьма запутанным является вопрос о фосфорилировании тубулина. Ранние работы на эту тему (Goodman et al., 1970; Soifer, I975> отчетливо демонстрировали, что препарат тубулина, выделенный из мозга, обладал протеинкиназной активностью, причем эта активность зависела от цАМФ. Протеинкиназа препарата обладала довольно широкой субстратной специфичностью и фосфорилировала как сам тубулин, так и другие белки. Более того, она соосаддалась с тубулином, по-лимеризованным в микротрубочки, на основании чего Сойфер (Soifer, 1975) предположил, что протеинкиназной активностью обладает сам тубулин.

Вместе с тем, присутствующая в препарата микротрубочек протеинкиназа может быть отделена от тубулина с помощью центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы (Rappaport et al., 1976) и рядом других методов (Shigekawa, oisen, 1975 ). Эта протеинкиназа, как оказалось, фосфорилирует тубулин относительно слабо, значительно сильнее фосфорилируются белки, ассоциированные с микротрубочками (Coughlin et al., 1980 )(подробнее см. раздел 2.6).

Анализ пептидных карт тубулина, фосфорилированного in vitro эндогенной протеинкиназой, выявил по меньшей мере пять пептидов, содержащих ковалентно связанный фосфат, хотя общая интенсивность

фосфорилирования в этих опытах не превышала 0,1 моль фосфата на I моль тубулина (Eipper, 1974а). Наиболее вероятно, что в процессе выделения тубулина происходит нарушение субклеточного распределения протеинкиназ, в результате чего происходит неспецифическое фосфорилирование тубулина с низкой интенсивностью по такті участкам и такими киназами, которые не участвуют в этих процессах in vivo .

В связи с этим существенно рассмотреть вопрос о том, способен ли тубулин вообще фосфорилироваться в клетках. Для ответа

я? на него клетки или фрагменты тканей обычно инкубируют с Р-орто-

фосфатом, после чего из клеток выделяют тубулин и анализируют

включение метки. В первой тщательной работе такого рода (Eipper,

1974ь) показано, что при инкубации срезов мозга новорожденных

я?

крыс с Р-фосфатом происходит включение около I моля фосфата на

I моль тубулина. Электрофоретический анализ и авторадиография показали, что вся метка локализована в j2> -субъединице, а с помощью метода пептидных карт установлено, что фосфорилированию подвергается лишь один остаток серина на молекулу белка. Фракционирование с помощью двумерного электрофореза/изоэлектрического фокусирования свидетельствует о том, что фосфорилированию способна подвергаться лишь одна из нескольких изоформ р -тубулина (Forgue, Dahl, 1979). Фосфорилирование тубулина по остаткам серина in vivo обнаружено также в скелетных мышцах кур и в культивируемых клетках HeLa ( Piras, Piras, 1974). Более того, в клетках HeLa обнаружено закономерное увеличение фосфорилирования тубулина в s -фазе клеточного цикла (Piras, Piras, 1975 ). В тромбоцитах человека, в отличие от других объектов, обнаруживается фосфорилирование тубулина как по <к- , так и по ft -субъединице (ikeda, steiner, 1979). В максимально фосфорилированном виде тубулин тромбоцитов

содержит около 5 молей фосфата на I моль димеров тубулина, причем в А -субъединице фосфат обнаружен в 6 различных пептидах трипсинового перевара, тогда как в А -субъединице фосфорилирует-ся 7 участков.

Существует, однако, целый ряд объектов, в которых не удается обнаружить включение фосфата в тубулин. Примером могут служить, в частности, клетки нейробластомы, тубулин которых не содержит ковалентно связанного фосфата ни в случае активно проли-ферирующей, ни в случае морфологически дифференцированной культуры (Solomon et al., 1976 ). В одной ИЗ работ (Rappaport et al., 1976) было показано, что тубулин, выделенный из мозга взрослых крыс ме-тодом полимеризации-деполимеризации после инкубации ткани с Р-фосфатом, не содержит метки. Не включает метку также тубулин из щитовидной железы (Rappaport et al., 1972 ). Более того, при выделении методом полимеризации-деполимеризации тубулин из перечисленных выше источников вообще оказывается неспособным к фосфори-лированию эндогенной протеинкиназой. Такая способность появляется у белка лишь после дополнительной очистки с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Возможно, это связано с тем, что ионообменная хроматография, удаляющая из препарата белки, ассоциированные с микротрубочками, диссоциирует олиго-меры тубулина (Weingarten et al., 1975 ), фосфорилированию же может подвергаться лишь нативный белок, а не его олигомеры.

Заканчивая рассмотрение вопроса о посттрансляционных модификациях тубулина, укажем дополнительно, что даже в различных частях одной и той же клетки тубулин может быть модифицирован по-разному. В подтверждения этого сошлемся на тот факт, что электрофор етическая подвижность (спектр изоформ) оС -субъединицы тубулина в различных участках аксонов мыши заметно различается

(Brown et ai., 1982 ). Поскольку синтез тубулина, как показано в этой работе, осуществляется лишь в теле нейрона, все изменения злектрофоретической подвижности тубулина, переносимого с аксо-плазматическим током по нейрону, происходят лишь за счет серии посттрансляционных модификаций, каждая из которых происходит лишь в своем определенном участке нейрона. Хотя природа описанных модификаций в работе (Brown et ai., 1982 ) не анализировалась, строгая региональная специфичность может рассматриваться как указание на их важную роль в сборке и/или функционировании микротрубочек в нейронах.

На функциональное значение посттрансляционных модификаций тубулина может также указывать работа ( Brunke et ai., 1982 ), в которой показано, что на ранних фазах регенерация жгутика у Chiamydomonas reinhardi происходит из цитоплазматического тубулина, причем этот тубулин, входя в состав аксонем, подвергается посттрансляционной модификации. Зависимая от состояния клеток посттрансляционная модификация отмечена также для клеток ней-робластомы, в которых при индукции дифференцировки появляется новая форма Ь -субъединицы тубулина ( Edde et ai., I98i ). Интересно, что такая модификация является одним из ранних изменений, происходящих при дифференцировке и предшествует росту аксонов ( Portier et al., 1982).

Таким образом ясно, что тубулин может подвергаться посттрансляционным модификациям: фосфорилированию и тирозилированию. Скорость модификаций зависит от физиологического состояния клеток и степени полимеризации тубулина. Модификации тубулина могут меняться при клеточной дифференцировке, а также различаются в различных частях одной и той же клетки. Все это свидетельствует о том, что посттрансляционные модификации тубулина имеют важное

физиологическое значение, хотя в настоящее время еще нельзя сказать, в чем оно заключается.

2.4. СВЯЗЫВАНИЕ ТУБУЛИНА С НИЗК0М0ЛЕК7ЛЯРНЫМИ ЖГАВДАМИ

Важным свойством тубулина является его способность связывать низкомолекулярные лиганды. Так, например, он связывает гуаниловые нуклеотиды, ионы двухвалентных металлов и растительные алкалоиды (колхицин, винбластин и др.), ингибиругащие полимеризацию тубулина в микротрубочки.

Сведения о том, что с микротрубочками могут быть связаны гуаниловые нуклеотиды, впервые получил Стефенс с соавторами (Stephens et ai., 1967 ), которые нашли эти нуклеотиды в надоса-дочной жидкости после осаждения частично очищенных микротрубочек аксонем хлорной кислотой. Уже в первой работе по выделению чистого тубулина из мозга (Weisenberg et ai., 1968 ) удалось показать, что одна молекула тубулина имеет два центра связывания нук-леотидов. В одном из них нуклеотид связан прочно и не обменивается на ГТФ или ГДФ в растворе, в то время, как в другом центре происходит быстрый обмен (время полудиссоциации ГТФ от этого центра составляет при комнатной температуре примерно 15 минут). Центр прочного связывания получил название N -центра, центр, по которому возможен обмен - Е-центра (от английских слов nonexchan-geabie и exchangeable _; соответственно). Все связанные с белком нуклеотиды освобождаются при преципитации белка НСЮ^, что свидетельствует о том, что они связаны с тубулином не ковалентно. Константа диссоциации, как ГТФ, так и ГДФ от Е-участка тубулина составляет примерно 10"'м (Jackobs, Caplow, 1976 ). Прямые измерения свидетельствуют о том, что связывание ГТФ с тубулином высокоспецифично и белок не обладает высоким сродством к АТФ,

УТФ и ЦТФ ( Arai et al., 1975 ) Если тубулин и связывает АТФ,

о -Т то константа ассоциации этого процесса не превышает 5 х 10 М

( Weisenberg et al., 1968 ). В то же время, высокие концентрации АТФ вызывают агрегацию олигомеров тубулина.Это может показывать, что на молекуле белка присутствуют центры связывания АТФ. Поскольку ГТФ не обладает подобным действием, ясно, что эти участки отличны от Е- и її -участков связывания ГТФ (zabrecky, Cole, 1980 ). Слабое связывание АТФ с <*. -субъединицей тубулина показано также с помощью фотоаффинного аналога АТФ ( Zabrecky, Cole, 1983 ). Тубулин способен связывать ряд аналогов ГТФ ( Penningrowth, Kirschner, 1978 ), в том числе и нерасщепляемые аналоги, однако, из-за того, что константа связывания этих аналогов намного меньше, чем константа связывания ГТФ или ГДФ, для обнаружения связывания необходимо предварительно удалить из Е-центра связанные там гуаниловые нуклеотиды ( Purich, McNeal, 1978; Penningrowth,

Kirschner, 1978 ).

В опытах по фотоаффинному мечению с помощью 8-азидо-ГТФ показано ( Geahlen, Haley, 1977 ), ЧТО Е-центр связывания ГТФ находится на р-субъединице тубулина. Поскольку d- и -субъединицы гомологичны по первичной структуре (Ponstingl et al., 1982), можно полагать, что и на << -субъединице также находится нуклео-тид-связывающий участок. Следовательно, N -центр связывания нуклеотидов, скорее всего, находится на <*. -субъединице тубулина.

Если с N -центром белка микротрубочек связан ГДФ, то он может принимать участие в качестве акцептора в реакции трансфос-форилирования - переноса ^-фосфата нуклеозидтрифосфата, находящегося в растворе, на нуклеотид, связанный с белком ( Berry,

Sheianski, 1972 ). Донором фосфата в реакции трансфосфорилиро-вания способен служить не только ГТФ, но и АТФ ( Jackobs et al.,

1974). Реакция трансфосфорилирования осуществляется не самим тубулином, а одной из нуклеозиддифосфокиназ, которая может быть отделена от тубулина методом полимеризации-деполимеризации (Jackobs, Huitorel, 1979).

Как мы покажем ниже, гидролиз ГТФ, происходящий при полимеризации тубулина, играет существенную роль в регуляции процесса сборки микротрубочек.

р. 2+

В составе тубулина обнаруживаются связанные Са и Mg ( Olmsted, Borisy, 1975 ). Связывание Са белком зависит от ионных условий раствора, оно максимально в присутствии 5-7 мМ MgCi^ в буфере и достигает в этом случае 0,72 моля на I моль тубулина ( Rosenfeld et ai., 1976 ), Кинетический анализ показал, что на молекуле тубулина имеется один участок высокоаффинного связывания Са и несколько участков относительно слабого связы-

2+

вания (Solomon, 1977 ). С участком связывания ^Ms намоле-куле тубулина связывается ташке и Mn ⁺ ( Buttlaire et al., 1980 ). Удаление нуклеотидов, связанных с Е-участком тубулина, иммобилизованной на агарозе щелочной фосфатазой приводит также к удалению связанного Mg ⁺ и Мп ⁺ , а связывание нуклеотида - к появлению сродства к этим металлам, ( Jemiolo, Grisham, 1982 ). Таким образом, вероятно, что ГТФ связанный на Е-участке принима-ет участие в образовании Ш - связывающего центра.

Характерным свойством тубулина, отличающим его от всех других клеточных белков, является способность к высокоаффинному связыванию колхицина и других растительных алкалоидов, обладающих митостатическим действием. Формулы некоторых митостатиков приведены на рис. I. Реакция связывания колхицина была использована как метод тестирования при выделении цитоплазматического тубулина. Колхицин связывается с тубулином нековалентно и может

_,J>V~\

Ok о

R=NMCOCH₃ колхщин R=NHCH3 колцемид

0-CH₃

подофиллотоксин

_о

-NH-C-0-СНз

нокодазол

0-С-СН₃

r = сн₅ винбластин R=CON винкристин

Рис. I. Структурные формулы некоторых митостатиков

быть извлечен из комплекса с белком при денатурации последнего мочевиной, органическими растворителями и др. (Wilson, Friedkin, 1967). При связывании с тубулином колхицин не претерпевает химических изменений (Borisy, Taylor, 1967а ). Связывание колхицина с тубулином сильно зависит от температуры - оно практически полностью подавляется при 0-4С и оптимально при 37С ( Wilson, 1975). Существенно (и это используется при анализе колхицин-связывающей активности тубулина), что образовавшийся при 37С комплекс не распадается при понижении температуры.

Подчеркнем, что способностью связывать колхицин обладает лишь нативный тубулин - денатурация белка и даже его продолжительное хранение в водных растворах, не приводящее к заметному изменению вторичной структуры, полностью подавляют колхицин-свя-

ЗЫВающую активность ( Weisenberg et al., 1968; Ventilla et al., 1972). Такая нестабильность колхицин-связывающей активности приводит обычно к-значительному разбросу при определении стехиометрии связывания. Для корректного определения требуется либо стабилизировать тубулин (Bryan, 1972 ), либо экстраполировать связывание к нулевому моменту времени (Bamburg et al., 1973 ). При этих условиях для связывания получают значения, близкие к I молю колхицина на I моль тубулина.

Кинетика связывания колхицина с тубулином исследовалась в целом ряде работ, однако из-за низкой стабильности тубулина получаемые данные сильно варьировали. Наиболее корректной, на наш взгляд, является работа (Sherline et al., 1975 ), авторы которой вводили поправки на денатурацию белка в процессе инкубации его с колхицином, причем учитывали, что свободный и связанный с колхицином тубулин денатурируют с разной скоростью. Оказалось, что кинетические константы реакций ассоциации и диссоциации кол-

_{- зо -}

хицина с тубулином составляют соответственно 0,36x10 М «час

и 0,008-0,012 час , a K_d , вычисленная как отношение кинети-

—7

ческих констант составляет 0,3x10 М. Хотя абсолютные значения

констант, полученные в других работах, отличаются от приведенных выше (см., например, Bhattacharyya, Wolff, 1976а ), существенны следующие два обстоятельства: а) тубулин характеризуется чрезвычайно высоким сродством к колхицину; б) скорости связывания этого митостатика с белком микротрубочек и диссоциации его из комплекса с белком очень малы.

Отметим, что с участком связывания колхицина на молекуле тубулина способны связываться и некоторые другие митостатики (рис. I). Из них наибольшее употребление получили колцемид ( Zweig, Chingell, 1973), ПОдофиллоТОКСИН (Wilson, 1970 ) и синтетический препарат нокодазол, ранее называвшийся онкодазолом (De Brabander et ai., 1976 )(См. рис. І). Не все митостатики, действующие на тубулин, связываются с ним по тому же участку, что и колхицин. Среди митостатиков, не конкурирующих с колхицином за связывание с тубулином, наиболее известны алкалоиды барвинка - винбластин и винкристин. Эти вещества также связываются с тубулином нековалентно и не изменяясь химически ( Lee et al., 1975; Wilson et al., 1975 ). Характерной особенностью их действия является ИНДУКЦИЯ образования как в клетках (Bensch, Malawista., 1968), так и in vitro (Bensch et al,, 1969 ) паракристаллов

тубулина. Такие паракристаллы представляют собой гексагонально

о упакованные спиральные структуры диаметром около 400 А. Эти спирали образованы двумя закручивающимися друг относительно друга

о протофиламентами, имеющими диаметр порядка 50 А, каждый из которых является, по-видимому, линейным агрегатом молекул тубулина

(Marantz, Shelanski, 1970; Pujiwara, Tilney, 1975).

- ЗІ -

Образование паракристаллов тубулина может быть использовано (и реально использовалось в прошлом) для выделения тубулина из ряда объектов (см. обзор этих методов в статье Sheianski, 1974). Впрочем, поскольку высокие концентрации винбластина способны осаждать НЄ ТОЛЬКО ТубуЛИН, НО И Другие КИСЛЫе беЛКИ ( Wilson et al.,

1970) такой метод не позволяет получить абсолютно чистый препарат тубулина.

На молекуле белка микротрубочек имеются два участка связывания винбластина ( Weisenberg, Timasheff, 1970 ), причем ЭТИ два участка различаются по сродству к митостатику ( K_d для

—7

участка с высоким сродством 1,6 х 10 М, а для участка с низким сродством - 1,25 х 10 М). Из концентрационной зависимости образования паракристаллов тубулина следует, что лишь при связывании винбластина с участком белка, имеющим низкое сродство к митостатику наблюдается его осаждение ( Bhattacharyya, Wolff, 1976Ъ ).

Имеются указания на то, что осаждение тубулина винбластином приводит к освобождению из комплекса с белком прочно связанного ГТФ ( Berry, Sheianski, 1972 ), не влияя на нуклеотид, связанный на Е-участке. Для осаждения тубулина винбластином необходимо, чтобы на ж -участке белка находился ГТФ, а не ГДФ (Lee et al., 1975), причем в паракристаллах винбластин вытесняет связанный нуклеотид (Berry, Sheianski, 1972).

2.5. САМОСБОРКА. МЖРОТРУБОЧЕК

2.5.1. Общие свойства реакции и тюль олигометза тубулина

Со времени появления первых работ по выделению тубулина начались попытки сборки микротрубочек in vitro . Впервые о сборке морфологически нормальных микротрубочек из тубулина жгутиков сообщил Стефенс ( Stephens, 1968 ). Однако, в отличие от микротрубочек в клетках,такие микротрубочки оказались нечувствительными к холоду, сборка их не ингибировалась колхицином, а в состав микротрубочек входило лишь незначительное количество тубулина, первоначально присутствовавшего в инкубационной смеси.

Успешная попытка сборки микротрубочек из цитоплазматического тубулина осуществлена Вейсенбергом ( Weisenberg, 1972 ) в экстрактах мозга и в препарате тубулина, частично очищенного осаждением сульфатом аммония. Тремя непременными условиями сборки являлись полное удаление свободного Са избытком ЭГТА, добавление нуклео-тидов (ГТФ или АТФ) и нагревание инкубационной смеси до 37С. Сборка микротрубочек ингибировалась колхицином; собранные микротрубочки деполимеризовались при охлаждении. Эти результаты были подтверждены работой (Borisy, Olmsted, 1972 ), в которой дополнительно было показано, что высокоскоростное осветление экстракта подавляет способность его к сборке, хотя при этом общее количество тубулина в пробе падает лишь незначительно. Эти данные позволили предположить, что для сборки микротрубочек необходимы высокомолекулярные затравки, удаляемые при центрифугировании. В пользу такого предположения говорили также и данные электронной микроскопии, которое свидетельствовали о том, что в результате центрифугирования из препарата удалялись структуры, имеющие форму дисков. Если к осветленному тубулину добавляли удаленные центрифугированием диски, то

в таком препарате тубулин вновь становился способным к сборке. Природа описанных в этой работе дисков позднее была исследована на препаратах белков микротрубочек, очищенных сборкой-разборкой.

Оказалось, что в таких препаратах имеется примерно равное количество димерных молекул тубулина с константой седиментации 6 s и компонента с константой седиментации в районе 30s (Kirsch-

ner et ai., 1974). Поскольку в препарате, полученном сборкой-разборкой тубулин составляет около 80-90$ (Murphy et al., 1977 ) ясно, что 30S -компонент представляет собой олигомер тубулина. Добавление к препарату І М Касі приводит к разрушению 30 s -компонента и появлению всего материала в зоне с константой седиментации 6 ^s , что также свидетельствует о том, что 30 S -компонент представляет собой олигомер тубулина (weingarten et al., 1970). В случае, когда для выделения препарата тубулина используется метод сборки-разборки в присутствии глицерина, олигомер имеет вид двойных колец или спиралей из тубулиновых протофиламен-

тов и диаметр 420 А.В такой олигомер входит около 25 молекул тубулина (KirschHer et al., 1975а ). В полученных полимеризацией-деполимеризацией препаратах наблюдаются иногда и олигомеры с константой седиментации примерно 20s (Doenges et al., 1976 ), причем 20^s -олигомер может образовываться из 30S -олигомера при Повышении рН (Bayley et al., 1982 ).

Факт сосуществования в препарате двух агрегационных форм тубулина (30 s и 6S ) позволили Киршнеру с соавторами предположить, что входящие в их состав тубулины различаются по своим свойствам (Kirschner et al., 1974). Вместе с тем, как было показано в наших опытах, доля олигомера тубулина в препарате зависит от общей концентрации белка - разбавление препарата приводит к диссоциации олигомера, а его концентрирование к увеличению коли-

чества олигомера (Гелъфанд, Розенблат, 1976). Это показывает, что олигомер и димер тубулина находятся в состоянии динамического равновесия. В то же время, понижение рН до 6,4 стабилизирует олигомер, в результате чего он может быть отделен от димера гель-фильтрацией, например, на сефарозе 4В. Электрофоретический анализ показал, что в состав олигомера, полученного гель-фильтрацией, входит не только тубулин, но и минорные белки, ассоциированные с микротрубочками (Keates, Hall. 1975 ), роль которых в поддержании структуры микротрубочек и олигомеров мы будем обсуждать в главе 2.6. Здесь отметим лишь, что удаление белков, ассоциированных с микротрубочками из препарата, приводит к диссоциации олигомера до 6S -тубулина (Weingarten et al., 1975 ).

2.5.2. Сборка мищютотбочек описывается механизмом нуклеаіщи-полимешзации

Рассмотрим теперь вопрос о кинетике полимеризации тубулина. Анализ этого процесса, проводимый непрерывно, например, по исследованию светорассеяния, показывает, что после создания условий полимеризации в инкубационной смеси сборка микротрубочек начинается не сразу, а лишь после лаг-фазы, продолжительность которой тем больше, чем ниже концентрация белка в растворе (см. например, Gas-kin et al., 1974; Borisy et al., 1976 ). Центрифугирование образца перед началом полимеризации резко увеличивает продолжительность лаг-фазы, а при большем времени центрифугирования полимеризация становится вообще невозможной, хотя присутствующий в растворе тубулин сохраняет способность к надстройке на предсу-ществующих микротрубочках (Borisy et al., 1974 ). Добавление к раствору тубулина фрагментов микротрубочек, в частности, микротрубочек аксонем, приводит к исчезновению лаг-фазы и немедленному

росту светорассеяния ( Binder et ai., 1975 ). Эти результаты свидетельствуют о том, что существование лаг-фазы обусловлено необходимостью формирования затравок, и что затравками в системе in vitro могут быть короткие фрагменты микротрубочек.

Эти данные создают предпосылки для предположения о том, что полимеризация тубулина в микротрубочки может быть описана в терминах теории спиральной агрегации молекул (нуклеации-полимериза-ции)(Ооаатеа, Kasai, 1962 ). Согласно этой теории при спиральной агрегации молекул должны быть выделены две фазы - образование затравок, включающих более двух молекул мономера, и элонгация, которая может проходить путем последовательного добавления мономеров к предсуществующему полимеру. Поскольку стадия инициации требует образования агрегата, включающего несколько молекул мономера, то именно эта стадия и оказывается наиболее чувствительной к изменениям концентрации белка в растворе.

Если принять, что сродство мономера к образующемуся полимеру не зависит от длины полимера, то концентрация мономера, находящегося в равновесии с образующимся полимером, не будет зависеть от тотального количества белка в растворе. Эта концентрация мономера называется критической концентрацией; она зависит лишь от ионных условий и температуры, при которых происходит полимеризация. Прямыми следствиями теории спиральной агрегации являются также следующие соотношения: а) начальная скорость полимеризации в присутствии экзогенных затравок пропорциональна произведению концентрации мономера и концентрации полимера, т.е. количества полимерных структур на единицу объема, при условии, что концентрация мономера превышает критическую; б) при разбавлении смеси мономера и полшлера, находившейся в равновесии, происходит деполимеризация части полимера, причем начальная скорость депо-

лимеризации пропорциональна концентрации полимера. Эти предположения прямо проверены В работе (Johnson, Borisy, 1977 )> ^гД^е показано, что сборка тубулина в микротрубочки действительно может быть описана в терминах спиральной агрегации.

Критическая концентрация полимеризации существенно зависит от условий инкубации, но для стандартного препарата, полученного методом сборки-разборки и полимеризующегося в присутствии I мМ ГТФ она составляет обычно 0,1-0,2 мг/мл при рН 6,7. Увеличение рН резко увеличивает критическую концентрацию полимеризации ( Regula et al., 1981).

Таким образом, если в растворе тубулина созданы условия полимеризации, а концентрация превышает критическую, то происходит образование затравок, на которых начинается элонгация. Процесс элонгации продолжается до тех пор, пока концентрация тубулина в растворе не станет равной критической концентрации, после чего количество полимера не изменяется.

2.5.3. Промежуточные продукты при сборке

Электронно-микроскопическое исследование препарата тубулина, полученного методом сборки-разборки и способного к полимеризации, выявило, как мы упоминали выше, кроме димерных молекул тубулина, присутствие тубулиновых олигомеров, имеющих вид двойного кольца или спирали (Kirsctmer et al., 1974 ). Как предполагалось, эти структуры и играли роль затравок в процессе полимеризации. В связи с этим, в ряде лабораторий было проведено электронно-микроскопическое исследование процесса полимеризации тубулина. Элементарные геометрические соображения показали, что олигомеры тубулина не могут непосредственно входить в структуру микротрубочки, поскольку даже их внутренний диаметр (340 А) существенно больше,

чем диаметр микротрубочки. Более того, на ранних этапах полимеризации никогда не удавалось электронно-микроскопически обнаружить структуры типа стопки олигомеров. Обычной структурой, различимой на ранних сроках полимеризации, являются плоские слои из нескольких протофиламентов (Erickson, 1974а ). На поперечных срезах такие слои часто имеют форму буквы С (Erickson, 1975 ). Иногда удается наблюдать ситуацию, когда слой, содержащий уже 13 протофиламентов замыкается в микротрубочку на протяжении какой-то части своей длины (Kirschner et ai., 1975ъ ). Эта ситуация служит указанием на то, что плоские слои протофиламентов действительно являются предшественниками при образовании микротрубочек, тем более, что слои возникают в растворе через несколько минут после начала полимеризации, а затем исчезают и вместо них появляются микротрубочки ( Kirschner et ai., 1975b). При неблагоприятных для полимеризации условиях (например, при низких рН) слои протофиламентов сохраняются в растворе существенно более долгое время (Matsumura, Hayashi, 1976 ),

Относительно роли 30 S -олигомеров в образовании микротрубочек в литературе имеются противоречия. С помощью аналитического центрифугирования показано, что если в препарате белков микротрубочек созданы условия полимеризации, то олигомер полностью из него исчезает, переходя в состав микротрубочек, тогда как часть 6 s -тубулина всегда остатется неполимеризованной (Гель-фанд, Розенблат, 1976). Из этого,во всяком случае, следует, что материал, из которого построен олигомер, способен активно включаться в состав микротрубочек. На ранних стадиях полимеризации с плоскими слоями тубулина, особенно содержащими 3-5 протофиламентов, часто ассоциированы олигомеры, формирующие "завитки" на концах слоев, и это может служить указанием на то, что в процес-

се полимеризации спираль, составляющая олигомер, разворачивается и. образующиеся при этом протофиламенты включаются в состав микротрубочек (Nagle, Bryan, 1976 ).

С другой стороны, Вейсенберг (Weisenberg, 1974 ) индуцировал полимеризацию тубулина непосредственно в ячейке аналитической ультрацентрифуги, скачком увеличивая температуру образца. Оказалось, что при этом скорость седиментации материала, входящего в состав олигомера тубулина, резко снижалась. Автор работы трактовал это. как доказательство того факта, что в процессе сборки на ранних этапах происходит распад олигомера до более мелких структур, которые затем включаются в состав микротрубочек. В работе (Bordas et ai., 1983 ) сборку индуцировали повышением температуры на 2С в минуту с 0С до 37С. Оказалось, что при нагревании до 22С происходит разборка кольцевых олигомеров и других агрегатов тубулина; и лишь при дальнейшем увеличении температуры в смеси, которая уже не содержит олигомеров, начинается сборка микротрубочек.

Таким образом, вероятнее всего, 30s -олигомеры тубулина не являются затравками при сборке. По-видимому, они образуются из замыкающихся на себя протофиламентов тубулина при разборке микротрубочек.

Хотя 30 S -олигомеры и не являются затравками, ясно, что сборка микротрубочек протекает с участием затравок, а промежуточным продуктом при полимеризации являются плоские слои из уложенных бок-о-бок протофиламентов тубулина. Когда количество протофиламентов в слоях достигает 13, слои замыкаются, образуя микротрубочки. Что же касается роли олигомеров, то, как уже говорилось, ясно, что в их состав кроме тубулина входят и белки, ассоциированные с микротрубочками (Keats, Hail., 1975 ). Удаление

ассоциированных белков приводит при стандартных ионных условиях к распаду олигомера до 6 s -тубулина и потере способности к полимеризации (Weingarten et al., 1975 ). Таким образом, наличие в растворе олигомера тубулина свидетельствует о присутствии в препарате белков, ассоциированных с микротрубочками. Скорее всего, обязательное присутствие олигомера в препарате, способном к полимеризации, отражает тот факт, что и для полимеризации, и для стабилизации олигомеров тубулина необходимы белки,ассоциированные с микротрубочками (см. ниже).

2.5.4. Роль ГТФ в сботже

Необходимость ГТФ для сборки микротрубочек, отмеченная еще в работе (Weisenberg, 1972 ), позволила предположить, что в процессе сборки связанный с белком нуклеотид подвергается гидролизу. И действительно, относительно быстро такой гидролиз был обнаружен (Jacobs et al., 1974; Kobayashi, 1975 ). Вместе С тем, ответ: на вопросы о том, как сопряжены процессы сборки и расщепления ГТФ, и о том, какая из двух связанных с тубулином молекул ГТФ подвергается гидролизу в процессе полимеризации, до недавнего времени наталкивался на существенные экспериментальные трудности. Это связано,во-первых,с тем, что в стандартном препарате, получаемом методом сборки-разборки, наряду с димерными молекулами тубулина присутствуют, как уже говорилось, и олигомеры тубулина, содержащие несколько десятков молекул белка ( Kirschner et al., 1974). В таких олигомерах обмен нуклеотидов на Е-участ-ке происходит медленно ( Zeeberg, 1980 ) и, тем самым, экспериментально невозможно отличить Е-участки тубулина олигомеров от и -участков. Во-вторых, такой препарат не свободен от активностей нуклеозиддифосфаткиназы( Nickerson, Wells, 1978 ) и

нуклеозидтрифосфатазы (Burns, Pollard, 1974; Gelfand et al., 1978), не сопряженных с процессом полимеризации. Поэтому исследования гидролиза ГТФ при сборке корректно были проведены лишь после разработки методов очистки тубулина, полученного полимеризацией-деполимеризацией от ассоциированных с ним белков (weingarten et al., 1975) и подбора условий для полимеризации высокоочищенного тубулина (обычно, высокие концентрации Mg²⁺, глицерина или полиэти-ленгликоля)(Ьее, Timasheff, 1975; РОДИОНОВ и др., 1978; Herzog,

Weber, 1978в). Использование такого препарата позволило однозначно показать, что на I моль полимеризованного тубулина расщепляется I моль ГТФ, связанного на Е-участке, тогда как на N -участке нуклеотид при полимеризации не гидролизуется (МсЖеаІ,

Purich, 1977, I978ai ). При этом ГДФ, образующийся на Е-участке, оказывается прочно связанным с образующимися микротрубочками, а неорганический фосфат освобождается в раствор ( Jackobs,

Caplow, 1976 ).

Гидролиз ГТФ при сборке микротрубочек проходит в две фазы - начальная быстрая фаза связана с тотальной полимеризацией тубулина и проходит с кинетикой, идентичной кинетике включения тубулина в состав микротрубочек (David-Pfeuty et al., 1977 ) Медленный гидролиз ГТФ, характерный для второй фазы, происходит тогда, когда суммарное содержание полимеризованного тубулина перестает увеличиваться. Поскольку обработка микротрубочек ультразвуком, не изменяющая количества полимеризованного тубулина, но фрагментирующая микротрубочки, резко увеличивает скорость гидролиза ГТФ во второй (медленной) фазе, вероятно, что в стационарной фазе гидролиз ГТФ осуществляется на концах микротрубочек, тем более, что при различных режимах озвучивания ГТФазная активность хорошо коррелирует с количеством концов микротрубочек,

образующихся в результате озвучивания (David-Pfeuty et ai., I97.

Детальный анализ быстрой фазы гидролиза ГТФ, проводимый одновременно с анализом полимеризации методом светорассеяния, свидетельствует о том, что гидролиз ГТФ, особенно при больших концентрациях тубулина, происходит несколько медленнее, чем образование микротрубочек (earlier, Pantaioni, 1981 ). Эти данные указывают на то, что полимеризация и гидролиз ГТФ, связанного с белком, - это два независимых процесса, причем гидролиз ГТФ, связанного с молекулой тубулина, может происходить через некоторое время после включения этой молекулы в состав полимера. В пользу такой концепции свидетельствует также тот факт, что сборка может происходить и вообще без гидролиза ГТФ, например, при использовании вместо ГТФ его нерасщепляемых аналогов 5 -гуанилилметилен-дифосфоната, 5 -гуанилилимидодифосфата (Arai, Kaziro, 1976; Wei-senberg et ai., 1976a ) или комплекса ионов Cr с ГТФ, который индуцирует интенсивную полимеризацию тубулина, но слабо расщепляется при сборке ( McNeal, Purich, 1978b ).

Как впервые показано в работе (oosawa, Kasai, 1962 ), константа равновесия в реакции полимеризации мономеров в полимерные структуры, а следовательно, и изменения свободной энергии, происходящие при этой реакции, могут быть однозначно определены из величины критической концентрации мономера. Такие изменения при полимеризации тубулина в присутствии различных гуаниловых нук-леотидов ( Karr et ai., 1979а ) свидетельствуют о том, что различия в свободной энергии микротрубочек, собранных в присутствии ГТФ и нерасщепляемых аналогов, незначительны. Вместе с тем, тубу-лин, содержащий на Е-участке ГДФ, полимеризуется значительно хуже, чем тубулин, содержащий ГТФ или его аналоги. Таким образом, очевидно, что именно связывание ГТФ, а не его гидролиз на Е-участ

ке обеспечивает энергию, необходимую для сборки.

Отметим, что время полуобмена нуклеотида на N -участке ту-булина клеток HeLa превышает 30 часов (Spiegeiman et al., 1977). Поскольку микротрубочки в клетках разбираются,по крайней мере, два раза на протяжении клеточного цикла (цитоплазматические микротрубочки при построении митотического веретена, а митотические микротрубочки по завершении митоза), такое большое время обмена делает сомнительным соображения о возможном участии ГТФ на N -участке в регуляции сборки микротрубочек в клетке.

Вместе с тем, имеются достоверные данные, что микротрубочки, на Е-участке которых находится не ГДФ, получающийся из ГТФ в процессе нормальной полимеризации, а один из нерасщепляемых аналогов ГТФ, значительно отличаются по стабильности от обычных микротрубочек. Эти микротрубочки гораздо более устойчивы к деполимеризации при разбавлении раствора ( Weisenberg et al., 1976b) и при действии НИЗКИХ концентраций Са (Arai, Kaziro, 1976; McNeal, Purich, 1978b ). Этот эффект имеет, по-видимому, кинетическую природу ( Karr et al., 1979а ), _{то есть} щщютрубоч-ки, собранные в присутствии аналогов, хотя и разбираются от де-полимеризующих агентов, но значительно медленнее, чем нормальные микротрубочки. Приведенные выше опыты позволяют предположить, что именно гидролиз ГТФ на Е-участке делает микротрубочки чувствительными к фактору (факторам), которые могут регулировать их полимеризацию.

2.5.5. Полярность микроттэубочек Специального обсуждения заслуживает вопрос о полярности микротрубочек, поскольку любые гипотезы об участии микротрубочек в процессах механического движения непременно требуют существования такой полярности. И, действительно, уже элементарные сооб-

ражения симметрии заставляют предположить подобную полярность. В самом деле, микротрубочки, как известно, содержат 13 протофи-ламентов, а каждый из протофиламентов является линейным агрегатом гетеродимеров тубулина. Следовательно, каждый из филаментов имеет полярность, так как в одном направлении субъединицы чередуются так: eijb- лр-сьр - ..., а в другом, наоборот, р<*< - jb<*~-- АоС-... Если считать, что все протофиламенты в составе микротрубочек эквивалентны, то из нечетности количества протофиламентов однозначно следует, что все они в составе микротрубочки имеют одинаковую полярность и, следовательно, ту же полярность имеет вся микротрубочка.

Эти эмпирические соображения были подтверждены прямыми структурными исследованиями. В частности, Эмос ( Amos, 1979) с помощью оптической дифракции с электронно-микроскопических изображений показала, что в составе микротрубочки все димеры тубулина имеют одинаковую полярность. Из этого однозначно следует вывод о полярности микротрубочек.

В течение значительного времени не представлялось возможным прягло выявить полярность микротрубочек в клетке. В последние годы, однако, независимо были предложены два различных метода исследования полярности микротрубочек в клетках. Первый метод разработан в лаборатории Мак-Интоша ( Heidemanu,Mcintosh, 1980 ) Он основан на том, что при добавлении тубулина к предсуществующим микротрубочкам в буфере, содержащем 2,Ъ% диметилсульфоксид, I мМ ЭДТА, 0,5 М 1,4-шшеразинэтансульфонат (рН 6,9) и ряд дру-, гих добавок начиналась дефектная полимеризация тубулина, который образовывал "крюки" на поверхности микротрубочек. По направлению этих "крюков" можно было однозначно судить о полярности микротрубочек. Другой способ выявления полярности микротрубочек

состоит в декорировании их молекулами динеина из аксонем Chiamy-

domonas reinhardi (Haimo, Telzer, 1982 ), ПОСКОЛЬКУ ДИНЄИН, связываясь с цитоплазматическими микротрубочками_;располагается под утлом к ним.

Анализ полярности микротрубочек, проведенный такими методами выявил следующее. Если в микротрубочках из жгутиков обозначить в качестве плюс-конца дистальний, а в качестве минус-конца - проксимальный, то оказывается, что во всех исследованных случаях все цитоплазматические микротрубочки ориентированы так, что их минус-конец расположен около центриоли, тогда как плюс-конец находится ближе к периферии клеток. Сказанное относится ко всем исследованным до сих пор цитоплазматическим микротрубочкам, в частности, к микротрубочкам аксоподий солнечника и дермальных мела-нофоров рыб (Euteuneuer, Mcintosh, I98ia ), микротрубочкам нейронов (tfeidemann et al., 1981; Burton, Paige, 1981 ).

Несколько сложнее обстоит дело с микротрубочками митоти-ческого веретена. Здесь, как в случае декорирования динеином.так и при декорировании тубулиновыми "крюками", получены данные о том, что все микротрубочки полуверетена имеют идентичную полярность (Euteneuer, Mcintosh, 1981b; Haimo, Telzer, 1982 ): их МИНус-KOH-цы находятся вблизи полюсов, а плюс-концы направлены от полюсов. Ясно, что если микротрубочки не связаны с кинетохорами, а подходят к центриолям в митотическом веретене, то они, как и цитоплазматические микротрубочки, связаны с центрами своими минус-концами. Вместе с тем, очевидно, что кинетохорные микротрубочки связаны с кинетохорами плюс-концами. Это отчетливо отличает их от всех остальных микротрубочек, у которых плюс-концы свободны. Таким образом, кинетохорные трубочки митотического веретена представляют собой уникальную систему. Возможно, их повышенная

стабильность по отношению к деполимеризуїощим воздействиям (Brink-ley, Cartwright, 1970, 1975 ) обусловлена тем, что у них блокирован плюс-конец.

Структурная полярность микротрубочек тесно связана с проблемой полярности их сборки, т.е. с вопросом о том, различаются ли два конца микротрубочек по сродству к молекулам тубулина. Эта проблема была детально исследована несколькими группами авторов. В частности, в работе Аллена и Бориси (Allen, Borisy, 1974 ) было показано, что тубулин из мозга способен образовывать микротрубочки на аксонемах жгутиков Chiamydomonas причем надстройка происходит значительно интенсивней на дистальном, чем на проксимальном конце. Аналогичные результаты получены при надстройке тубулина на микротрубочках аксонем жгутиков морского ежа (Binder et al., 1973, 1975 ). Более того, при относительно неблагоприятных условиях полимеризации (низкая концентрация тубулина, низкая температура и т.д.) сборка вообще происходила лишь на дистальном конце.

В гомологичной системе полярность сборки исследовалась в двух работах. В одной из них ( Dentler et al., 1974 ) в качестве затравок применялись фрагменты микротрубочек из мозга, метаболически меченные ³Н-аминокислотами, тогда как в другой работе ( Olmsted et al., 1974 ) применялись фрагменты микротрубочек, декорированные ДЭАЭ-декстраном. В обоих случаях оказалось, что как и при надстройке на микротрубочках жгутиков, полимеризация тубулина из мозга на фрагментах гомологичных микротрубочек происходит полярно - скорость этого процесса на одном конце в несколько раз выше, чем на другом. Эти данные были подтверждены работой лаборатории Киршнера (Summers, Kirschner, 1979 ). В ней различия в скорости роста двух концов микротрубочек были проде-

монстрированы непосредственно с помощью микроскопии в темном поле. Таким образом, два конца микротрубочек отчетливо различаются по константам скоростей ассоциации молекул тубулина.

Длительное время не был исследован вопрос, различаются ли два конца микротрубочки по равновесным константам ассоциации с молекулами тубулина. Такого рода исследования были стимулированы классической работой Вегнера (wegner, 1976 ). Изучая роль гидролиза АТФ в процессе полимеризации актина, он показал, что в отсутствие необратимых изменений мономера в процессе полимеризации, невозможна такая ситуация, когда равновесные константы ассоциации мономера с двумя концами полимера различаются. Действительно, если сборка не вызывает необратимых изменений мономера, то полимер вида А^й... А А, идентичен полимеру A... A A^s, где A^s - мономер, присоединившийся к полимеру последним. Это значит, что изменение свободной энергии в реакции A + A...A ^=^ A^SA... А равно изменению свободной энергии в реакции A + A...A *== A... A A^s. Поскольку » -д0

где К - константа равновесия реакции полимеризации, g - изменение свободной энергии, Т - абсолютная температура, a r - универсальная газовая постоянная (1,987 кал/градмоль), то из равенства свободных энергий следует равенство констант ассоїщйцщі с двумя концами полимера. Вместе с тем, введение необратимой стадии делает неправомочным приведенное выше рассмотрение и позволяет константам равновесия для двух концов различаться между собой. Для сборки актина и тубулина такими необратимыми стадиями являются гидролиз АТФ и ГТФ соответственно.

Сравнение критической концентрации полимеризации на двух концах полимера было проведено для актина с использованием в ка-

честве затравки пучка микрофиламентов из щеточной каемки кишечного эпителия (Pollard, Mooseker, 1981 ) и одиночных микрофила-ментов (wegner, isenberg, 1983 )» а для микротрубочек с использованием затравок из аксонем жгутиков (Bergen, Borisy, 1980 ). Во всех случаях было отчетливо продемонстрировано различие констант ассоциации мономеров с двумя концами соответствующих полимеров. Такое различие ведет к принципиальному выводу - существованию в стационарном состоянии направленного "тока" субъединиц вдоль полимера. Действительно, в начале полимеризации при концентрации мономера, превышающей критическую концентрацию для каждого из концов, происходит сборка полимера на обоих концах. Как только в результате полимеризации концентрация мономера падает до величины, ниже критической концентрации полимеризации на одном из концов, но. остается выше, чем критическая концентрация на другом конце, положение резко меняется. На одном из концов полимера начинается, преимущественно, разборка, а на другом происходит сборка. Конец, на котором проходит преимущественная разборка, для всех микротрубочек структурно эквивалентен проксимальному концу микротрубочек ресничек и жгутиков, т.е. их минус-концу, а конец, на котором происходит сборка - соответственно дистальному концу (плюс-концу). Напомним, что из данных по декорированию ци-топлазматических микротрубочек тубулиновыми "крюками" следует, что у всех цитоплазматических микротрубочек минус-конец является проксимальным, а плюс-конец - всегда дистальным ( Euteneuer,

Mcintosh, 1981а; Heidemann et al., 1981; Mcintosh et al., 1980 ).

Постоянная полимеризация тубулина на плюс-конце и его диссоциация от микротрубочек на минус-конце должна, очевидно, приводить к тому, что молекула тубулина, присоединившись к плюс-концу₇ "проедет" по микротрубочке до минус-конца, где и диссоциирует'в

раствор. Такой процесс получил название полимеризация "головка-в-ХВОСТ" ( head- to- tail polymerization ) ИЛИ тредмиллинг ( tread-milling ). Наличие тредмиллинга для микротрубочек in vitro было впервые показано в работе Марголиса и Уилсона (Margoiis, Wilson 1978). Эти авторы метили Е-участок тубулина ³Н-ГТФ и, пользуясь тем, что нуклеотид, связанный с полимеризованным тубулином, перестает обмениваться на нуклеотид, находящийся в растворе, следили за судьбой белка, включившегося в микротрубочки. Авторы этой работы показали, что меченный ³Н-ГТФ тубулин может включаться в состав микротрубочек даже в стационарном состоянии, причем включенный в состав микротрубочек при импульсном мечении тубулин полностью остается в составе полимера в течение длительного времени, после чего с постоянной скоростью диссоциирует в раствор. Напротив, если вся микротрубочка состоит из меченого тубулина, а инкубация ведется в растворе тубулина, не содержащего метку, то количество радиоактивности в составе микротрубочек начинает падать с первых минут инкубации и падает с той же скоростью, что и в микротрубочках, импульсно меченных ³Н-тубулином. Эти данные свидетельствуют о том, что в стационарном состоянии включение тубулина в состав микротрубочек имеет место, причем происходит в основном на одном из концов, тогда как на другом конце происходит, преимущественно, диссоциация. Таким образом, существование тока субъединиц вдоль микротрубочек in vitro можно считать установленным.

Интенсивность тредмиллинга может быть независимо оценена из соотношения величин константы ассоциации тубулина с плюс- и минус-концами микротрубочек. Такого рода вычисления были независимо проделаны В двух лабораториях (Bergen, Borisy, I980;Karr, Purich, 1979). Авторы этих работ заключают, что отнюдь не всякая молекула

тубулина, связавшаяся с плюс-концом, достигает минус-конца; большая часть молекул белка диссоциирует на том конце, с которым они связались первоначально. Укажем, однако, на то, что критические концентрации полимеризации для двух концов микротрубочки наверняка существенно зависят от ионных условий, наличия белков, ассоциированных с микротрубочками и т.д., и поэтому эффективность тредмиллинга в клетке (как и сам факт его существования in vivo ) представляется неизвестной.

Если, однако, движение субъединиц вдоль микротрубочек в клетке имеет место, то ясно, что любой клеточный элемент, прикрепленный к стенке микротрубочки, будет двигаться со скоростью, равной скорости этого тока. Таким образом, возможно, что именно с помощью тредмиллинага обеспечивается направленный перенос материала в различных процессах зависимого от микротрубочек внутриклеточного транспорта (Margolis et al., 1978; Margolis, Wilson, 1981). Энергетика этого процесса и, в частности, его зависимость от постоянного гидролиза ГТФ подробно обсуждается в теоретических работах Хилла И Киршнера (Hill, Kirschner, 1982а, Ъ ).

2.5.6. Центры сборки микротрубочек

Исследование сборки микротрубочек в клетке удобнее всего проводить методом непрямой иммунофлуоресценции, поскольку этот метод, как мы уже упоминали, дает возможность наблюдать за распределением микротрубочек во всей клетке сразу, и, вместе с тем, обладает достаточной разрешающей способностью. Для исследования сборки микротрубочек в клетке их вначале разрушают (например, колцемидом или охлаждением), а затем следят за восстановлением микротрубочек после отмывки от колцемида. Такие исследования были проведены на культивируемых фибробластах линии ЗТЗ (Osborn,

Weber, 1976a ), а также на макрофагах (Prankei, 1976 ). В обработанных колцемидом клетках микротрубочки отсутствуют, но им-мунофяуоресценция выявляет первичную ресничку, микротрубочки которой не деполимеризуются митостатиком (см. ниже). При удалении колцемида начинается сборка микротрубочек из района, лежащего непосредственно под первичной ресничкой, причем микротрубочки по мере роста остаются связанными с клеточным центром, а полное восстановление завершается примерно за 90 минут. Аналогичная картина наблюдается и после восстановления в результате деполимеризующего действия охлаждения (Prankei, 1976 ), причем, как после действия охлаждения, так и при использовании умеренных доз колцемида (до 10 мкМ) скорость роста микротрубочек составляет 1-1,5 мкм в минуту.

Распространение микротрубочек от центра клетки в сторону периферической цитоплазмы наблюдается также и при исследовании клеток, распластывающихся на субстрате (osborn, Weber, 197бъ ). В последнем случае, однако, не ясно, происходит ли на самом деле полимеризация тубулина, или имеет место лишь перераспределение предсуществующих микротрубочек, поскольку в нераспластайных клетках (в отличие от клеток, обработанных колцимидом) цитоплаз-матические микротрубочки сохраняются (Тинт, 1979). Хорошо известно, что цитоплазматические микротрубочки, как правило, связаны с центриолями; такая связь неоднократно выявлялась электронно-мик-роскопически (см. сводку в обзоре Porter, 1966 ). Таким образом, сборка цитоплазматических микротрубочек в клетках происходит от района центриолей. Как правило, центриоли в клетках окружены различными дополнительными структурами и именно с ними и связаны микротрубочки. В частности, в эпителиальных клетках РЕ из почки свиньи на стадии g-j- клеточного цикла на центриоли формиру-

ются центриолярные сателлиты; на стадии G сателлиты разрушаются и центриоль оказывается окруженной фибриллярным гало. Микротрубочки в этих клетках связаны с сателлитами или с гало (Воробьев, Ченцов, 1978).

Участки клеток, с которыми связаны микротрубочки, принято называть центрами организации микротрубочек (Pickett-Heaps, 1969). Для цитоплазматических микротрубочек животных клеток центрами организации микротрубочек являются центриоли с окружающим их пери-центриолярным материалом.

В большинстве клеток имеются 1-2 центриоли. В то же время, в клетках нейробластомы КИ5 восстановление микротрубочек после действия колцемида происходит на значительном количестве (в среднем, около 12) центров (Spiegeiman et ai., 1979а ). Более того, оказывается, что при индукции дифференцировки происходит агрегация этих центров и вместо многих центров образуется один центр организации микротрубочек, имеющий диаметр 3-4 мкм (Spiegeiman et al.,I979b).

Природа множественных центров организации микротрубочек была исследована с помощью электронной микроскопии. Оказалось, что клетки нейробластомы отличаются от большинства других культивируемых клеток наличием множественных центриолей (Brinkley et ai., 198I; Sharp et ai., 1981 ). Следовательно, и в этом случае центрами организации микротрубочек являются центриоли. Наличие множественных.центриолей, однако, не является отличительным признаком нервных клеток, так как, например, в первичных культурах нейронов из ганглиев задних корешков спинного мозга крысы ни одна из клеток (даже имеющих значительное количество отростков) не содержит более двух центриолей (Sharp et al., 1982 ).

Центриоли могут служить центрами, на которых происходит

сборка микротрубочек не только из эндогенного клеточного тубули-на, но и в системах, использующих экзогенный тубулин. Для опытов такого рода клетки лизируют тритоном Х-100 после разрушения собственных микротрубочек, например, колцемидом, а затем инкубируют лизированные клетки в растворе тубулина. Оказывается, что если для этих опытов использовать тубулин, освобожденный от белков, ассоциированных с микротрубочками с помощью хроматографии на фос-фоцеллюлозе, то он образует значительное количество микротрубочек, прикрепленных к клеточным центрам (Brinkley et ai., 1981 В присутствии белков, ассоциированных с микротрубочками, экзогенный тубулин на центриолях интерфазных клеток надстраиваться неспособен.

В митотических клетках центриоли также являются центрами организации микротрубочек; кроме того, микротрубочки в клетках, находящихся в митозе, прикрепляются и к кинетохорам хромосом, которые, следовательно, также можно рассматривать как центры организации микротрубочек. И кинетохоры и центриоли способны служить центрами полимеризации тубулина. Для центриолей это было показано, например, в работе (Telzer, Rosenbaum, 1979 ), авторы которой выделили центриолярный комплекс из клеток HeLa , остановленных в метафазе колцемидом. С помощью микроскопии в темном поле и электронной микроскопии они показали, что инкубация с тубулином из мозга приводит к образованию значительного количества микротрубочек на перицентриолярном материале. В этом случае к сборке был способен тубулин, содержащий ассоциированные белки, а также осветленный гомогенат мозга крупного рогатого скота. Аналогичные результаты были получены и на лизированных клетках, а не на выделенных центриолях (Gould, Borisy, 1977; Snyder, Mcintosh,1975

Обработка лизированных клеток тубулиномприводит также к

интенсивной надстройке микротрубочек на кинетохорах метафазных хромосом; это дает основание считать, что кинетохоры также являются центрами организации микротрубочек (McGiii, Brinkley, 1975; Telzer et al., 1975; Cox et al., 1983 ) Данные по определению полярности микротрубочек в митотическом аппарате свидетельствуют о том, что центриолярные микротрубочки митотического веретена, как и цитоплазматические микротрубочки, прикреплены к центриолям своими минус-концами, а их плюс-концы свободны и могут присоединять тубулин. В то же время, для кинетохорных микротрубочек характерна противоположная полярность - они связаны с кинетохора-МИ ПЛЮС-КОНЦами (Buteneuer, Mcintosh, 1981b; Telzer, Haimo, 1981).

Это говорит о том, что если кинетохоры являются центрами организации микротрубочек, то они отличаются от всех остальных центров организации, так как инициируют рост микротрубочек противоположной (по сравнению с остальными центрами) полярности.

В настоящее время, к сожалению, относительно мало известно о белковом составе центров организации микротрубочек и механизме их действия. Имеется ряд сообщений о получении препарата базаль-ных тел (структурно сходных с центриолями) в количествах и чистотой, достаточной для электрофоретического исследования (Gould, 1975; Anderson, Floyd, 1980 ). Разработаны методы выделения частично очищенных препаратов центриолей, хорошо сохраняющие морфологию этих структур (Nadezhdina et al., 1978 )_f однако даже такие препараты не обладают чистотой, достаточной для изучения белков центриолей.

Относительно механизма инициации полимеризации микротрубочек на клеточном центре существуют две точки зрения. Согласно одной из них, микротрубочки не обязательно образуются на клеточном центре - они начинают образовываться также и свободно, в цито-

плазме (или вблизи клеточного центра), но микротрубочки, связанные с центром, характеризуются большей стабильностью, чем свободные. В пользу такой точки зрения говорит то, что после отмывки от митостатика нокодазола микротрубочки формируются не только на клеточных центрах, но и вблизи их ( De Brabander et al., 1980 ), и лишь затем свободные микротрубочки заменяются связанными с клеточным центром ( De Brabander et al., 1981a ). Такая интерпретация представляется весьма-вероятной, если учесть, что для противоположных концов микротрубочек критическая концентрация полиме ризации тубулина различна - для плюс-концов она ниже, а для минус-концов - выше. Поскольку у микротрубочек, связанных с центри-олями, блокированы минус-концы, они будут стабильны при более низкой концентрации тубулина, чем свободные микротрубочки, у которых оба конца доступны для сборки и разборки. Более того, как указал Киршнер ( Kirschner, 1980 ), микротрубочки со свободным плюс-концом и блокированным минус-концом будут эффективно конкурировать с плюс-концами свободных микротрубочек за тубулин, освобождающийся с минус-концов свободных микротрубочек, тогда как с их собственных минус-концов тубулин освобождаться не будет. Это постепенно приведет к тому, что весь материал свободных микротрубочек окажется перенесенным на микротрубочки, связанные с центрами, которые и останутся в клетке.

Такие соображения, будучи сами по себе достаточно аргументированы, наталкиваются, однако, на серьезную трудность - существование кинетохорных микротрубочек, которые имеют полярность, несовместимую с полярностью, которую требует гипотеза Киршнера (Kirschner, 1980 ). Поэтому следует предположить, что либо ки-нетохорные микротрубочки являются нестабильными, временными образованиями, либо центры организации микротрубочек нужны не для

того, чтобы стабилизировать связанные с ними микротрубочки. Вполне возможна альтернативная гипотеза, что центры - это затравки, на которых происходит сборка микротрубочек (De Bratander, 1982). Так как образование затравок является наиболее медленной, . лимитирующей стадией сборки ( Gaskin et ai., 1974 ), наличие в клетках затравок может облегчить и регулировать образование ци-топлазматических микротрубочек. Способность центров митотических клеток индуцировать сборку in vitro из тубулина, не очищенного от ассоциированных белков, может свидетельствовать о том, что в митозе центры являются эффективными затравками, способными конкурировать с затравками, возникающими в результате спонтанной нуклеации в присутствии ассоциированных белков. Возможно, в интерфазных клетках центры значительно менее эффективны и способны индуцировать сборку лишь в отсутствие спонтанной инициации.

Красивой иллюстрацией роли центров в регуляции состояния микротрубочек в клетках являются работы Шливы с соавторами, исследовавших изолированные меланофоры рыбы Pteropyllum scalare Они показали, что если пигмент в клетках находится в диспергированном состоянии (клетка темная), то меланфор содержит в 2-2,5 раза больше микротрубочек, чем когда он агрегирован ( клетка светлая)(Schiiwa, Euteneuer, 1978 ). в соответствии с этими данными центр диспергированных клеток индуцирует образование большего числа микротрубочек при полимеризации in vitro , чем центр клеток, в которых пигмент агрегирован ( Schiiwa et ai., 1979 ).

Несомненно, во всех исследованных клетках микротрубочки образуются на центрах. Однако, было бы неправильно думать, что они остаются связанными с клеточными центрами постоянно. Такая постоянная связь доказана лишь для небольшого числа типов клеток, в которых ее удается непосредственно проследить на иммунофлуорес-

центных препаратах, например, для меланофоров ( Schiiwa et ai., 1979) или для макрофагов (Prankei, 1976 ). Вместе с тем, рее в относительно старых электронно-микроскопических исследованиях ми-тотических клеток обнаружено небольшое количество микротрубочек, не связанных с центриолями и кинетохорами (Mcintosh et ai., 1975 ). Еще более яркий пример представляет исследование микротрубочек в аксоне нематодыCaenorhabditis elegans (Chalfie, Thompson, 1979). В этой работе показано, что подавляющая часть (если не все) микротрубочки в аксонах не доходят до тела клетки, и, следовательно, система цитоплазматических микротрубочек в аксонах состоит из коротких перекрывающихся друг с другом микротрубочек. Аналогичный результат получен недавно и для аксонов культивируемых нервных клеток крысы (Bray, Bunge, 1981 ).

В культивируемых клетках микротрубочки часто изогнуты, а плотность их вблизи ядра настолько велика, что иммунофлуоресцент-ная микроскопия не может ответить на вопрос, связаны ли в них все микротрубочки с центром. Вместе с тем, электронно-микроскопическое определение количества микротрубочек при восстановлении после действия холода свидетельствует о том, что количество микротрубочек вблизи центра в клетках в этот момент значительно выше, чем в контроле (Воробьев, Ченцов, 1982). Это показывает, возможно, что микротрубочки в исследованных клетках только собираются на центрах, а затем отделяются от них и переходят в цитоплазму.

Центриоль в клетке часто служит одновременно и базальным телом, от которого отходит первичная ресничка (см., например, Воробьев, Ченцов, 1978). Доля культивируемых клеток, содержащих первичную ресничку, зависит как от условий культивирования, так и от типа клеток. Как правило, в культурах с высокой плотностью

монослоя или при пониженном содержании сыворотки в культуральнои среде количество клеток с первичной ресничкой ниже, чем в культурах, стимулированных к вхождению в клеточный цикл ( Tucker et

al.,I979 ).

Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что сборка микротрубочек в клетках происходит на центрах, содержащих в качестве основного компонента центриоль. Весьма вероятно, что одним из факторов, регулирующих количество микротрубочек в клетке и их распределение,является активность центров организации микротрубочек, то есть их способность стимулировать сборку.

2.5.7. Регуляция сборки микротрубочек ионами кальция

Существуют и другие факторы, которые могут участвовать в

регуляции сборки микротрубочек. Одним из таких факторов являет-

„ 2+ о, _, .. г, 2+

ся Са. Соображения о возможности регуляторнои роли ионов Са

возникли еще после появления первой работы по самосборке микротрубочек (weisenberg, 1972 ), поскольку в ней было показано,

что обязательным условием сборки микротрубочек в экстрактах моз-

2+ га является полное удаление свободного Са с помощью ЭГТА. Од-

2+ нако, механизм ингибирующего действия Са на сборку микротрубо-

?+ чек окончательно пока не выяснен. Ясно, что способность Са ин-

гибировать сборку микротрубочек существенным образом зависит от

состава инкубационной среды, использовавшейся для сборки. В стан-

2+ дартных условиях полимеризации сборка подавляется лишь 2 мМ Са

(Olmsted, 1976 ). Вместе с тем, повышение концентрации Mg в

2+ смеси до 5 мМ резко увеличивает чувствительность сборки к Са ;

2+

при этом для полуингибирования достаточно всего лишь 5 мкМ Са (Rosenfeid et ai., 1976 ). Чувствительность сборки к Са увеличивается также при повышении ионной силы инкубационной среды до

200 мМ KCI (Nishida, 1978 ). Принципиальное значение для чувст-

р. витальности сборки к Са имеет и чистота препарата тубулина.

Так, показано (Nishida, Sakai, 1977 ), что при одних и тех же

ионных условиях сборка микротрубочек в грубом экстракте из моз-

?+

га ингибируется 10 мкМ Са , в то время, как в препарате, очищенном методом сборки-разборки, чувствительность к Са примерно в 100 раз ниже. Более того, высокая чувствительность системы к Са восстанавливается, если к очищенному тубулину добавить фракцию белков гомогената, осаждаемых сульфатом аммония между 20 и 40% насыщения.

Эти результаты свидетельствуют о том, что чувствительность

р.

микротрубочек к Са определяется какими-то белковыми факторами,

р, а не непосредственно взаимодействием Са и тубулина. Поиски такого фактора были предприняты в ряде лабораторий. В частности, в

одной из работ (Магсша et al., 1978 ) было показано, что очи-

р,

щенный до гомогенности универсальный Са -связывающий белок кальмодулин ингибирует сборку микротрубочек при концентрации свобод-

р,

ного Са порядка 10 мкМ. Аналогичным действием обладал и тропо-

р, нин С. В отсутствие Са , однако, эти белки не изменяли ни скорости сборки, ни количества образовавшегося полимера. Эти данные были подтверждены Ниішедой и его соавторами (Wishida et al., 1979 ), которые показали, что кальмодулин, кроме того, может связываться С тубулином in vitro (Nishida, Kumagai, 1979 ). Тубулин, однако, не является единственным белком микротрубочек, связывающим кальмодулин. Кальмодулин способен связываться также и с фактором тау, ассоциированным с микротрубочками, причем в отличие от взаимодействия с тубулином, взаимодействие с фактором тау происходит

р , лишь в присутствии Са (Kakuchi, Sobue, 1981 ). Поскольку фактор тау стимулирует сборку микротрубочек (см. ниже), одним из

возможных объяснений влияния кальмодулина на чувствительность

р. микротрубочек к Са может служить конкуренция между тубулином

и кальмодулином за фактор тау, имеющая место только в присутст-

„ 2+ вии Са .

В пользу подобной интерпретации свидетельствует также тот

факт, что кальмодулин увеличивает чувствительность микротрубочек

р. к Са лишь в присутствии белков, ассоциированных с микротрубочками. В отсутствие же ассоциированных белков высокие концентрации кальмодулина, наоборот, снижают Са -чувствительность, воз-

р, можно за счет связывания свободного Са (Lee, Wolff, 1982).

p.

Об участии кальмодулина в действии Са на микротрубочки

можно также предполагать на основании данных ( Schiiwa et al., 1981), демонстрирующих, что обработка клеток, экстрагированных детергентами, трифтазином или другими ингибиторами кальмодулина

снижает чувствительность микротрубочек к микромолярным, но не

р.

миллимолярным концентрациям Са . Наконец, последним доводом в

пользу роли кальмодулина в регуляции сборки микротрубочек может служить распредаяение этого белка в клетках, исследованное методом непрямой иммунофлуоресценции. Эти данные (Anderson et al., 1978; Welsh et al., 1978 ) показывают, что в делящихся клетках кальмодулин локализуется в митотическом веретене, причем особенно высока его концентрация между полюсами митоза и хромосомами. Разрушение микротрубочек веретена с помощью колцемида и й₂о приводит к диффузному распределению кальмодулина ( Welsh et al., 1979). Перераспределение кальмодулина не наблюдается, однако, при охлаждении клеток до 0С; поскольку при охлаждении клеток разрушаются "непрерывные" микротрубочки, но не микротрубочки, идущие к кине-тохорам (Brinkley, Cartwright, 1975); вероятно, кальмодулин связан с кинетохорнымимикротрубочками. Электронная микроскопия с

использованием иммунопероксидазной метки подтвердила эти данные и показала, что концентрация кальмодулина особенно высока в тех участках митотического аппарата, где микротрубочки идут близко друг от друга (De Mey et ai., 1980 ). С помощью иммуноэлектронной микроскопии кальмодулин выявлен также в связи с цитоплазмати-ческими микротрубочками (Caceres et ai., 1983 ).

Нельзя, однако, исключить, что действие кальмодулина на сборку микротрубочек неспецифично. На это указывает, во-первых,то,

?+ что для увеличения чувствительности микротрубочек к Са требуются концентрации кальмодулина в несколько раз превышающие концентрацию тубулина в смеси (Marcum et ai., 1978 ),а во-вторых,то, что кальмодулин может быть заменен другими Са -связывающими белками. В частности, примерно такой же активностью, как и кальмодулин обладает упоминавшийся уже тропонин С (Marcum et ai., 1978 ), а еще более высокой активностью - белок s _Ю0 из мозга (Baudi-er et al., 1982).

Возможно также, что регуляция разборки микротрубочек ионами Са осуществляется совсем по другому механизму. Одним из таких механизмов может быть зависимый от Са протеолиз ассоциированных с микротрубочками белков (Sandoval, Weber, 1978 ), который приводит к особенно сильной деградации высокомолекулярных ассоциированных белков (Burguyne, Cumraings, 1982 ) и вызывает потерю ассоциированными белками полимеризующей активности (Klein et al.,

1981).

p. Таким образом, вопрос о механизмах действия Са нельзя счи-

тать полностью решенным, хотя сам факт участия Са в регуляции

сборки можно \ считать установленным, по крайней мере, in vitro .

p.

Что же касается роли Са как регулятора полимеризации тубулина

в клетке, то можно привести лишь работу Шливы (Schiiwa, 1976 ),

показавшего, что 10 мкМ Са вызывает в присутствии ионофора A23I87 втягивание аксоподий у солнечника ikctinosphaerum eichhorni и ингибирует рост аксоподий после их разрушения охлаждением. Поскольку единственным цитоскелетным элементом аксоподий являются микротрубочки, и электронная микроскопия показывает, что при об-

?+ 2-4-

работке Са они исчезают, вероятно, что действие Са на аксоподий связано с разрушением им микротрубочек.

2.5.8. Влияние митостатиков на сборку микротрубочек

Основным средством при исследовании микротрубочек в живых клетках являются митостатические алкалоиды: колхицин, колцемид, винбластин, винкристин, нокодазол, подофиллотоксин, таксол. Структурные формулы этих веществ приведены на рис. I и 2. Поэтому, выяснению механизма их действия посвящено немалое количество работ. Не останавливаясь на ранних публикациях, показывающих, что все j эти митостатики останавливают деление клеток и вызывают (за исключением таксола) разрушение микротрубочек в клетках, напомним лишь, что, как хорошо известно,эти вещества специфически связываются с тубулином (см. выше в этом обзоре и, подробнее в обзоре Dustin» 1974).

Ниже мы обсудим механизм действия митостатических веществ на примере колхицина, указав на особенности других препаратов. Отдельно мы обсудим действие таксола, принципиально отличающегося от остальных митостатиков по эффектам на микротрубочки.

Принципиальньш свойством колхицина является его способность, связываясь с тубулином, практически не реагировать с целыми микротрубочками. ЭТО было впервые показано В 1973 ГОДУ (Wilson, Meza, 1973), когда было установлено, что колхицин не связывается со стабильными внешними дублетами микротрубочек из аксонем жгутиков

сперматозоидов морского ежа. Вместе с тем, солюбилизация тубули-на из этих микротрубочек приводит к тому, что он начинает связывать колхицин, причем параметры связывания совпадают с таковыми для стандартного цитоплазматического тубулина. Эта работа определила представление о том, что колхицин действует на микротрубочки, связываясь с растворимым тубулином и препятствуя тем самьм его полимеризации.

Анализ дозовой зависимости ингибирования сборки и связывания с тубулином, проведенный для колхицина и других митостатиков, свидетельствовал, что сборка полностью ингибируется задолго до того, как все (или хотя бы половина) молекул тубулина в инкубационной смеси свяжут митостатик (Wilson et ai., 1976 ). Это явление получило название субстехиометрического ингибирования. Наиболее вероятной причиной субстехиометрического ингибирования могло бы быть связывание колхицина с микротрубочками, поскольку в таком случае связывание одной молекулы колхицина с микротрубочками могло бы полностью ингибировать сборку. Однако, как мы уже упоминали, колхицин с микротрубочками не связывается. Это кажущееся противоречие было разрешено В работе (Margolis, Wilson, 1977 ). В этой работе было показано, что комплекс тубулин-колхицин является существенно более эффективным ингибитором сборки, чем свободный колхицин. Он ингибирует надстройку тубулина на предшествующих микротрубочках практически немедленно после добавления в суб-стехиометрических концентрациях, в то время, как свободный колхицин подавляет ее лишь после продолжительной лаг-фазы. Более того, комплекс колхицин-тубулин не вызывает разборки микротрубо-чек, использующихся в качестве затравки.

Прямые измерения стабильности микротрубочек, с которыми связан комплекс колхицин-тубулин показали, что такие микротру-

бочки существенно стабильней, чем контрольные и значительно медленнее деполимеризуїотся при разбавлении (Margoiis et аі., 198О;

Deery, Weisenberg, 1981 ). Это говорит о том, что комплекс колхицин-тубулин с высоким сродством связывается с растущим концом микротрубочек и блокирует этот конец, подавляя на нем как полимеризацию, так и деполимеризацию. Такой блок, однако, не является абсолютным и увеличение количества свободного тубулина в растворе приводит к ограниченной полимеризации ( Parreii, Wilson,

1980; sterniight, Ringei, 1979 ). Более того, если в растворе комплекс колхицин-тубулин присутствует в высокой концентрации, то он сам по себе оказывается способным к включению в состав микротрубочек. На таких микротрубочках может происходить дальнейшая надстройка свободного тубулина, однако критическая концентрация полимеризации на их концах тем выше, чем выше количество включенного комплекса (sterniight, Ringei, 1980 ). Следовательно, имеет место смешанный механизм ингибирования: при физиологических концентрациях тубулина и субстехиометрических концентрациях колхицина комплекс митостатик-тубулин вызывает блок полимеризации на концах микротрубочек, а увеличение количества комплекса приводит к его включению в полимер, увеличивающему критическую концентрацию полимеризации (Farrell, Wilson, 1980),

Принципиально важно, однако, что при всех условиях колхицин вызывает разрушение микротрубочек лишь за счет ингибирования полимеризации. С іфедсуществующими микротрубочками он может связываться только по концам ( в виде комплекса с тубулином) и разборки микротрубочек не вызывает. Таким образом, разрушаются в присутствии колхицина микротрубочки лишь за счет естественной деполимеризащш, а стабильные микротрубочки ресничек и жгутиков, не находящиеся в равновесии с пулом свободного тубулина, к колхи-

цину резистентны.

Сказанное выше относительно действия колхицина, полностью относится и к другим митостатикам групп колхицина и винбластина, которые также действуют на сборку микротрубочек в субстехиомет-

рИЧеСКИХ КОНЦеНТраЦИЯХ И Не УСКОРЯЮТ разборки МИКрОТрубОЧеК (Wilson

et ai., 1976 ). Особенностью митостатиков группы винбластина является то, что они, кроме ингибирования сборки микротрубочек вызывают образование паракристаллов тубулина (см. раздел 2.4). Процесс агрегации тубулина винбластином происходит при существенно больших концентрациях митостатика, чем подавление сборки. Вероятно, сборка ингибируется при связывании винбластина с участком молекулы тубулина, имеющим высокое сродство к митостатику, тогда как агрегация индуцируется при связывании с участком, имеющим меньшее СрОДСТВО (Bhattacharyya, Wolff, 197бЪ ).

Существенно другим действием на микротрубочки обладает недавно исследованный противоопухолевый митостатик - таксол (рис. 2), выделенный ИЗ ТИССа Taxus brevifolica ( Wani et al., I97D. Оказалось, что таксол, в отличие от других митостатиков стимулирует, а не ингибирует сборку микротрубочек (Schiff et al., 1979). Эта стимуляция выражается как в уменьшении лаг-периода при сборке, так и в увеличении количества полимеризованного тубулина. Собранные в присутствии таксола микротрубочки не разбираются при охлаждении до 4С и при добавлении Са даже до концентрации 4 мМ. В стандартных условиях полимеризации добавление таксола снижает критическую концентрацию полимеризации до 0,01 мг/мл и ниже. Сборка в присутствии таксола не зависит от нуклеотидов и ассоциированных белков, хотя таксол не ингибирует ни связывания их с тубулином, ни гидролиз нуклеотида при сборке ( Schiff, Horwitz, 1981). Микротрубочки в клетках, обработанных таксолом, также

^

_с—

NH-CH-CH-C -О і

О CHs-G-O ₀

X ГМ ^0Н

/ Ч-С-І

0-С-СНз II ^D

_о

Рис. 2. Структурная формула таксола

е.ег

отличаются повышенной устойчивостью к охлавдению и колхицину (Schiff, Horwii?z, 1980 ). Таксол связывается с микротрубочками in vitro , причем количество участков связывания примерно совпадает с количеством микротрубочек в смеси (Manfredi et al., 1982 ). Таксол также насыщаемым образом связывается с культивируемыми клетками; разборка микротрубочек при помощи нокодазола, колхицина или винбластина подавляет связывание таксола, что свидетельствует о том, что и в клетках таксол связывается лишь с полиме-ризованным тубулином ( Manfredi et al., 1982 ). Интересно, что распределение микротрубочек в клетках, обработанных таксолом,резко изменяется: микротрубочки собираются в пучки, а количество микротрубочек, связанных с центросомами, резко уменьшается ( De Brabander et al., 1981Ъ ).

Таким образом, таксол является уникальным митостатиком, который в отличие от других митостатиков, связывается с микротрубочками, а не с деполимеризованным тубулином и ингибирует разборку микротрубочек, а не их сборку.

/

2.6. ЕЕИКй,АССОЦИИРОВАННЫЕ С МИКРОТРУБОЧКАМИ

Разработка условий для самосборки микротрубочек in vitro и их выделения методом сборки-разборки дали возможность исследовать, какие белки кроме тубулина входят в состав микротрубочек. В ранних работах (см., например, Sheianski et ai., 1973; Weingarten et ai., 1974) утверждалось, что микротрубочки, выделенные методом сборки-разборки, представляют собой гомополимер, в состав которого входит лишь тубулин. Однако, более тщательный анализ выделенных белков показал, что тубулин в таком препарате составляет лишь 80-95% (в зависимости от особенностей процедуры выделения), а остальная часть препарата представлена многими белками (Erickson 1974Ъ; Borisy et al., 1974; Borisy et al., 1975; Sandoval, Cua-trecasas, I976ai ). Значительная часть этих белков не удаляется из препарата после повторных циклов полимеризации-деполимеризации (Sloboda et al., 1976а ). В препарате микротрубочек, кроме того, обнаруживается заметное количество различных ферментативных активностей, в частности, активности аденозинтрифосфатазы (Burns, Pollard, 1974; Gelfand et al., 1978 ), нуклеозиддифосфаткиназы (Nickerson, Wells, 1978 ), протеинкиназы, зависимой от цАМФ (Rap-paport et al., 1976; Sandoval, Cuatrecasaa, 1976b ), ЩЮТЄИН-КИНазы, зависимой ОТ Ca И кальмодулина (Burke, De Lorenzo, 1981; Yamamoto et al., 1983 ), ДИГЛИЦеридкиназЫ (Daleo et al., 1974 ), щелочной и кислой фосфатазы (Prus, Wallin, 1983 ) и др.

Присутствие в препаратах нетубулиновых компонентов определило представление о том, что в состав микротрубочек, кроме тубулина входят и другие белки. Они получили название белков, ассоциированных с микротрубочками. Часто эти белки называют ташке MAP, что является сокращением : ..английского названия microtubule-

associated proteins .

Необходимо отметить, что наличие МАР в препарате не является артефактом процедуры полішеризации-деполрщеризации, поскольку нетубулиновые компоненты обнаруживаются и при выделении микротрубочек в стабилизирующих условиях, то есть без деполимеризации и повторной сборки in vitro (Kirkpatrick et al., 1970).

Уже в первых работах, посвященных исследованиям MAP, было показано, что в препаратах, выделенных из мозга, основное количество ассоциированных белков составляют белки чрезвычайно высокого молекулярного веса (Murphy, Borisy, 1975 ). Молекулярный вес этих белков, определенный с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, существенно превышает 200 000 даль-тон. Таких белков в препарате из мозга обнаруживается, как правило, два. Более тяжелый из них получил название MAPI, а менее тяжелый - МАР2. Их молекулярные массы составляют примерно 350 000 и 300 000, соответственно (sioboda et al., 1976b), хотя по другим данным ОНИ равны 290 000 И 270 000 (Murphy, Borisy, 1975 ). Такой значительный разброс связан, по-видимому, с тем, что для определения молекулярного веса таких тяжелых белков не существует маркеров более высокого молекулярного веса и поэтому зависимость молекулярного веса от электрофоретической подвижности приходится экстраполировать к более высоким молекулярным весам, что естественно, снижает точность определения. Другая группа ассоциированных белков - это тау-белки, имеющие молекулярный вес в районе 60 000 (Cleveland et al., 1977а ).

Детальный анализ ассоциированных белков из мозга проведен в работе (Murphy et al., 1977а ), в которой было показано, что в препарате микротрубочек, полученном двумя циклами полимеризации-деполимеризации, имеется свыше 35 белков, отличных от тубу-

лина. После шести циклов выделения в препарате, кроме MAPI, МАР2 и тау остаются лишь очень небольшие количества белков с молекулярными весами 345 000, 180 000 и 70 000. В одной из работ ( Berko-witz et ai., 1977 ) для анализа ассоциированных белков использовали кроме электрофореза и двумерный электрофорез-изоэлектри-ческое фокусирование в системе 0 Фаррела и показали, что при повторных циклах полимеризации-деполимеризации доля высокомолекулярных МАР в препарате остатется постоянной. Кроме того, были обнаружены MAP с молекулярными массами 30 000 и 35 000, которые составляют 1,1-1,2$ от всех MAP (Berkowitz et ai., 1977 ). Относительное содержание этих белков в препарате при повторных циклах полимеризации также не изменяется. Таким образом, с микротрубочками из мозга в постоянной стехиометрии соосаждаются два белка очень высокой молекулярной массы (MAPI и МАР2), меньшее количество белков с молекулярной массой 60 000-70 000 (тау-белки), а также небольшое количество белков с молекулярными массами 180 000, 35 000 и 30 000.

Идентификация ассоциированных белков в клетках других типов осложняется тем, что тубулин в клетках, отличных от нейронов, присутствует в количествах, значительно меньших, чем в мозге (Hiller, Weber, 1978 ). Это приводит к тому, что для получения экстрактов, в которых концентрация тубулина превышает критическую, приходится использовать существенно менее I мл буфера для гомогенизации на I г исходных массы клеток или тканей ( Doenges et ai., 1979 ). В то же время, хорошо известно, что ассоциированные с микротрубочками белки чрезвычайно чувствительны к протеоли-

ТИЧЄСКОЙ деградации ( Sandoval, Weber, I978; Weather^bee et al., 1980; Burguyne, Cummings, 1982 ). Поэтому получение высококонцентрированных экстрактов может приводить к деградации MAP.

В силу приведенных выше соображений неясно, насколько правомерны утверждения о существовании микротрубочек, не содержащих ассоциированных белков, основанные лишь на выделении их из клеток методом полимеризации-деполимеризации (см., например,_Doenges et al., 1977; Nagle et al., 1977; Wiche et al., 1979 ) Более того, нет полной уверенности даже в том, что обнаружение в выделенных препаратах МАР того или иного молекулярного веса доказывает его существование в исследованных клетках, а отсутствие одного из MAP, характерных для мозга, в других тканях, означает его реальное отсутствие. Вполне возможно, что многочисленные кажущиеся противоречия, имеющиеся по поводу МАР в немозговых клетках, объясняются просто пестротой картины протеолитической деградации МАР (с*.., например, pa60TH:Seeds, Maccioni, 1978; Duerr et al., 1981; Olmsted, Lyon, 1981 ), а сравнение тех или иных тканей с мозгом по спектру МАР без соответствующих контролен означает всего лишь сравнение их по спектру и активности гидролизующих МАР про-теиназ ( Ray et al., 1979 )

Этих трудностей позволяют избежать два подхода. Первый из них состоит в том, что к препарату микротрубочек из мозга добавляется экстракт исследуемых клеток, меченных С- или S-аминокислотами и проводится несколько циклов полимеризации-деполимеризации, В конечном продукте клеточные MAP анализируются по метке, поэтому к носителю - тубулину и MAP из мозга - добавляется относительно небольшое количество экстракта, чем существенно понижается опасность протеолиза (Cleveland et al., 1979 ). Второй, значительно более трудоемкий подход, основан на выделении тех или иных MAP из исследуемых клеток, получении против них антител и иммунохимическом или иммунофлуоресцентном выявлении соответствующих белков в клетке.

Сополимеризация с белками из мозга в тех или иных модификациях была применена для анализа МАР в нескольких работах (Cleveland et al., 1979; Solomon et al., 1979; Duerr et al., 1981; Zieve, Solomon, 1982; Greene et al., 1983 ) ^Эти работы отчетливо показали, что в составе микротрубочек в различных культивируемых клетках имеются те же MAP, что и в мозге - высокомолекулярные MAP и тау-белки. Эти белки идентифицированы не только по подвижности при электрофорезе, но и по пептидным картам. Вместе с тем, среди MAP культивируемых клеток присутствуют белки, которых нет во фракции MAP из мозга. Например, во многих линиях клеток млекопитающих найдены MAP с молекулярным весом 80 000 (Pallas, Solomon, 1982) и 220 000 (Duerr et al., 1981 ). Кроме того, методом сополимеризации в митотических клетках выявлен специфический MAP С молекулярным весом 150 000 (Zieve, Solomon, 1982 ).

Второй метод - выделение МІР, а затем его иммунологическая идентификация в клетках или в нефракционированном гомогенате, -наиболее последовательно применен к культивируемым клеткам параллельно В двух лабораториях (Weatherbee et al., 1978; Bulin-ski, Borisy,1979. Оказалось, что при выделении циклами полимеризации без глицерина с микро труб очками из клеток ^НеЪа соочища-ется довольно большое количество белков с молекулярными массами от 68 000 ДО 210 000 дальтон (Sulinski, Borisy, 1979; Weatherbee et al., 1980 ), однако основную массу составляет белок с молекулярной массой 210 000, который стехиометрически соосаддается с микротрубочками, составляя 4-5% от тотального белка препарата после двух и более циклов. В препарате имеется также белок с молекулярной массой 125 000, который соосаящается с микротрубочками в постоянной стехиометрии (Bulinski, Borisy, 1980с ) Антитела к этим белкам окрашивают сеть цитоплазматических микро-

трубочек в культивируемых клетках HeLa и реагируют лишь с соответствующими белками после разделения тотальных белков клеток HeLa электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (Buiinski, Borisy, 1980а ). Это свидетельствует, во-первых, о том, что изучаемые белки связаны с клетками как in vivo, так и in vitro и, во-вторых, что они не являются продуктами протеолиза более крупных предшественников, которые и связаны с микротрубочками в клетках. Антитела к белку с молекулярной массой 210 000 из клеток Не La выявляют этот белок также во всех других исследованных клетках приматов, но не реагируют с клетками грызунов и птиц (Buiinski, Borisy, 1980Ъ ). Иммунологически показано, что в микротрубочках клеток HeLa кроме того содержится белок, идентичный МАР2 из мозга по способности соосаждаться с микротрубочками, по молекулярной массе, по реакциям с антителами против МАР2 из мозга (Weatherbee et al., 1982 ). Этот белок не мог быть обнаружен стандартными биохимическими методами, поскольку он присутствовал в клетках HeLa в крайне малом количестве.

Существенная информация о минорных белках, ассоциированных с микротрубочками, может быть получена с помощью моноклональ-ных антител. Такой подход только начинает применяться, однако, Изант с соавторами уже обнаружили в клетках HeLa MAP, специфичный для микротрубочек митотических клеток (Izant et al., 1982 ). Этот MAP имеет молекулярную массу 200 000; в интерфазных клетках антитела против него окрашивают от 15 до 40 точек, расположенных в клеточном ядре. Данные предварительного описания еще трех клонов гибридом, продуцирующих антитела против MAP с молекулярной массой около 200 000, свидетельствуют о том, что другие варианты этого белка присутствуют и в цитоплазматических микротрубочках ( Izant et al., 1983 ).

Имеется значительное количество работ, посвященных роли MAP в регуляции полимеризации тубулина. Первые указания на участие МАР в этом процессе были получены независимо в лабораториях Кирш-нера и Бориси ( Weingarten et al., 1975; Murphy, Borisy, 1975 ). Эти авторы очистили тубулин от MAP с помощью ионообменной хроматографии и показали, что при такой очистке он теряет способность к полимеризации, а возвращение удаленных MAP восстанавливает эту способность. Роль МАР в процессе полимеризации была исследована в ряде работ. Витман с соавторами ( Witman et al., 1976 ) показали, что увеличение количества ассоциированных белков повышает как скорость полимеризации, так и количество полимера. Зависимость массы микротрубочек от концентрации МІР в смеси показана и .другими авторами (Sioboda et al., 1976а ). Эти данные свидетельствуют о том, что МІР действуют на сборку стехиометрически, а не каталитически.

Микротрубочки могут собираться из тубулина и в отсутствие MAP, однако этот процесс крайне неэффективен - количество обра-зующегося полимера мало, а концентрация тубулина, необходимая для полимеризации, в десятки раз превышает критическую концентрацию полимеризации В присутствии MAP (Dentler et al., 1975; Murphy, Borisy, 1975 ). Собранные без MAP микротрубочки способны связывать MAP из раствора. Этот процесс не блокируется колхицином, что свидетельствует о том, что связывание происходит не за счет сборки новых микротрубочек в присутствии добавленных MP, а за счет декорирования тех микротрубочек, которые были собраны ранее без MAP ( Sloboda, Rosenbaum, 1979 ).

Кинетические исследования свидетельствуют о том, что MAP стимулируют как элонгацию микротрубочек на предсуществующих затравках ( Witman et al., 1976 ), так и образование новых затравок

(Murphy et al., 1977b ), Стшлуляция сборки микротрубочек фракцией MAP может означать либо увеличение скорости присоединения субъединиц тубулина к микротрубочке, либо замедление их диссоциации, так как суммарная скорость образования микротрубочек представляет собой разность этих величин. Для того, чтобы выбрать между этими возможностями, Мэрфи с соавторами (Murphy et al., 1977b ) исследовали зависимость начальной скорости элонгации микротрубочек (на экзогенных затравках) от концентрации тубулина-при высокой и низкой концентрациях MAP. Так как увеличение концентрации MAP с 0,04 до 0,22 мг/мл не меняет зависимости начальной скорости полимеризации от концентрации тубулина, ясно, что реакция полішеризации, как таковая, МАР не ускоряется, а, следовательно, MAP могут стимулировать сборку, лишь тормозя деполимеризацию микротрубочек. Стабилизация микротрубочек фракцией MAP против деполимеризации разбавлением или охлаждением прямо показана в работе ( Sloboda, Rosenbaum, 1979).

Как мы уже упоминали, при деполимеризации микротрубочек образуется смесь олигомеров и 6S -димеров тубулина (Kirschner et al.,

1974; Гельфанд, Розенблат, 1976). Эта смесь может быть разделена с помощью центрифугирования или гель-фильтрации ( Borisy,

Olmsted, 1972; Kirschner et al., 1975 ) ^ПР^{И этом} ассоциированные белки оказываются в составе олигомера (Erickson, 1974а ). Хроматография на фосфоцеллюлозе, удаляющая ассоциированные белки из препарата, диссоциирует олигомер ( Weingarten et al., 1975)« Следовательно, MAP стабилизируют не только микротрубочки, но и олигомеры тубулина. Наличие МАР в составе олигомера тубулина хорошо объясняет, почему сборка микротрубочек происходит лишь в препарате, содержащем олигомер, поскольку, удаляя олигомеры центрифугированием (Borisy, Olmsted, 1972 ), мы тем самым удаляем из препаратов MAP.

Локализация МАР в составе микротрубочек с помощью нескольких электронно-мшфоскопических методов изучалась в ряде работ. Данные, полученные в некоторых из них (Dezitler et ai., l976;siobo-da, etal?, 1976a; Murphy", Borisy., 1975 ), свидетельствуют О ТОМ, что наличие высокомолекулярных МАР в составе микротрубочек ведет к появлению на их поверхности нитевидных выростов, отчетливо различимых при исследовании срезов с осадков микротрубочек. Эти вы-

о росты расположены на микротрубочках с кажущимся периодом 320 А и

особенно хорошо выявляются после фиксации материала смесью глута-рового альдегида и танина (Kim et ai., 1979 ). Детальное исследование распределения "ручек", формируемых высокомолекулярными МАР на микротрубочках, было проведено Эмос (Amos, 1977 ) с использованием негативно контрастированных препаратов и техники оптической дифракции. Из сравнения картин оптической дифракции с картиной, получаемой от дифракции на модельных структурах, она определила, что истинный осевой период расположения МАР на стенке

о микротрубочки равен 960 А (т.е. одна молекула высокомолекулярного MAP на 12 тубулиновых димеров) и, что молекулы МАР на соседних протофиламентах расположены со сдвигом, что приводит к образованию спиральной укладки. Такая укладка может быть описана,

о например, двухзаходной спиралью с шагом 590 А или однозаходной

о спиралью с шагом 192 А.

Необходимо отметить, что если вместо высокомолекулярных MAP для сборки микротрубочек использовать фракцию тау-белков, то выросты на их стенках не образуются и стенка микротрубочек выглядит значительно более гладкой (Zingsheim et al., 1979 ).

Поскольку высокомолекулярные MAP образуют "ручки", далеко отходящие от стенки микротрубочек, ясно, что с микротрубочками связана лишь небольшая часть их молекулы, и эта часть может

обусловливать > их полимеризующую активность. Авторы работы, в которой это прямо показано ( Vaiiee, Borisy, 1977 ), обрабатывали микротрубочки, полученные циклами полимеризации-деполимеризации, низкими концентрациями трипсина, что приводило к избирательному расщеплению высокомолекулярных MAP и исчезновению "ручек", но не подавляло способности препарата к полимеризации. При этом в препарате не оставалось никаких MAP с молекулярными массами более 50 000. Это значит, что полимеризующей активностью обладает фрагмент, длина которого составляет лишь 20% от полной длины молекулы высокомолекулярного MAP. Можно думать, что остальная часть молекулы, не связанная со стенкой микротрубочки, принимает участие не в реакции полимеризации, а в организации связывания микротрубочек с другими клеточными органеллами (см. ниже).

Ко времени написания данной работы были выделены в очищенном виде четыре цитоплазматических MAP: фактор тау ( Cleveland et al.,1977a), MAP2 (Kuznetsov et al., 1978a; Herzog, Weber, 1978a; Kim et al., 1979 ), MAPI (Кузнецов и др., 1981), а также белок С молекулярной массой 215 000 ИЗ клеток HeLa ( Buiinski, Borisy, 1980 с). Поскольку два из этих MAP впервые выделены в нашей лаборатории, а анализ их свойств и влияния на полимеризацию тубу-лина составляют предмет настоящей работы, мы рассмотрим свойства других МАР в сравнении со свойствами MAPI и МАР2 и проведем это сравнение в разделе "Обсуждение результатов".

Относительно хорошо изучены высокомолекулярные MAP, связанные с микротрубочками аксонем ресничек и жгутиков. Эти белки, называемые динеинами ( Gibbons, Rowe, 1965 ), локализуются в виде двух рядов ручек на микротрубочке А дублета и могут быть экстрагированы растворами с высокой или низкой ионными силами ( Gibbons, 1965 ). Динеин обладает АТФазной активностью ( Gibbons,

1963; 1966), что позволило предположить, что именно этот MAP осуществляет механохимическое сопряжение, превращая энергию АТФ в механическое движение жгутика. В настоящее время это можно считать установленньм, так как в реактивированных АТФ аксонемах жгутиков частота биения пропорциональна количеству динеиновых ручек ( Gibbons, Gibbons, 1976 ), антитела к динеину ингибируют как его АТФазную активность, так и реактивацию ( Bibbons et al., 1976 ), а у ряда мутантов хламидомонады с неподвижными жгутиками и у людей с синдромом КартагенеРа, характеризующимся неподвижностью жгутиков сперматозоидов и ресничек мерцательного эпителия отсутствуют динеиновые ручки аксонем (Afzeiius, 1976; Pedersen, Rebbe, 1975 ). В пользу такого предположения говорит и тот факт, что динеиновые ручки могут связывать микротрубочку А того дублета, на котором они расположены, с микротрубочкой В соседнего дублета (Warner, 1976 ), и,следовательно, могут обеспечивать АТФ-зависимое скольжение микротрубочек соседних дублетов друг относительно друга, что приводит, благодаря наличию поперечных связок , К изгибу жгутика (Summers, Gibbons, 1971 )

Полная структура динеиновых ручек пока неясна, однако можно с уверенностью сказать, что в состав ручек входит несколько типов полипептидных цепей; в частности, при экстракции динеинового комплекса 0,6 М NaCi в его составе обнаруживаются два типа тяжелых цепей с молекулярной массой 450 000-500 000 (Bell, 1983 ) ,а также, ряд белков значительно меньшей молекулярной массы (Gibbons, Pronk, 1979).

2.7. ВОЗМОЖНЫЕ ФУНКЦИИ МИКРОТРУБОЧЕК

Наиболее интересным и, вместе с тем, слабее всего изученным во всей проблеме микротрубочек является вопрос о функциях микротрубочек в клетках. Ясно, что микротрубочки - универсальные орга-неллы эукариотических клеток (Porter, 1966 ) и потому должны выполнять какие-то чрезвычайно существенные клеточные функции. Сравнительно ясно, что в ресничках и жгутиках микротрубочки играют ключевую роль, являясь основным компонентом аксонем, к которому крепятся все остальные элементы и который взаимодействует с динеином, обеспечивая механохимическое сопряжение (см. обзор Gibbons, 1981 ). Хорошо известно, что микротрубочки составляют основную массу митотического веретена, а разрушение микротрубочек колцемидом ведет к разрушению митотического аппарата и ингибиру-ет расхождение хромосом (см. обзор inoue, 198I ). Вместе с тем, механизм действия микротрубочек митотического веретена известен значительно хуже, чем в случае микротрубочек аксонем, и существует много различных гипотез относительно того, как осуществляются перемещения хромосом в митозе. Так;, например, имеются гипотезы, в которых в качестве движущей силы рассматриваются процессы координированной сборки и разборки микротрубочек (см., например, обзор inoue, 1976 ), функционирование связанных с микротрубочками АТФаз (cande, Wolniak, 1978 ), а также смешанные механизмы (Margolis et ai., 1978 )_# Окончательный выбор между этими гипотезами сделать пока невозможно.

Еще меньше можно сказать о роли микротрубочек в интерфазных клетках. Здесь неясно не только то, каким способом работают микротрубочки, но даже в каких процессах они участвуют. Ответы на эти вопросы в настоящее время основываются, преимущественно, на данных ингибиторного анализа, то есть на исследованиях изменений

в тех или иных функциях клеток при разрушении микротрубочек ми-то статиками. При этом необходимо учитывать, что в клетках разрушение микротрубочек может приводить к тем или иным эффектам не прямо, а быть опосредовано другими клеточными компонентами, и потому данные ингибиторного анализа следует трактовать с осторожностью.

Тем не менее, опыты по действию митостатиков отчетливо показывают, что разрушение микротрубочек приводит к подавлению колебательного движения гранул в цитоплазме культивируемых клеток (Freed, Leibowitz, 1970 ). Колцемид подавляет направленное движение фибробластов по субстрату, поскольку в присутствии мито-статика у клеток пропадает деление края на стабильные и активные участки, и весь край становится активным (Васильев и др., 1972). Митостатики ингибируют также секрецию ряда гормонов и белков (см., например, Wolff, Bhattacharyya, 1975; Williams, Lee, 1976; Chambaut-Guerin- et al.,1978 ), причем ингибирование осуществляется не за счет подавления процесса секреции как такового, а, по-видимому, за счет подавления процесса переноса секреторных гранул к клеточной поверхности (Malaisse, Malaisse-Lagae, 1975 ). От микротрубочек зависит и правильное расположение,и перенос по цитоплазме других органелл. Так, в работе ( Heggeness.et al., 1978) методом непрямой иммунофлуоресценции показано, что распределение митохондрий в клетках зависит от распределения микротрубочек - вблизи каждой митохондрии проходит микротрубочка, а разрушение микротрубочек колхицином вызывает резкое перераспределение митохондрий, большая часть которых оказывается сосредоточенной вблизи ядра. Связь микротрубочек с митохондриями выявлялась и на ультраструктурном уровне ( Smith et al., 1975, 1977 ) Отметим, однако, что связь митохондрий с микротрубочкшли не носит

перманентного характера; в молодых культурах фибробластов из сердца курицы такая связь не наблюдается, тогда как у клеток в стационарной фазе она выражена очень хорошо (Couchman, Rees, 1982 ). Таким образом, митохондрии в клетке часто (но не всегда) связаны с микротрубочками и эта связь является объектом регуляции со стороны клеток.

Существование прочных связей между микротрубочками и покрытыми мембранами органеллами описано не только для митохондрий, но и для других органелл, например, для синаптических пузырьков, лизосом, секреторных гранул и др. (Allen, 1975; Smith, 1971; Sher-line et ai., 1977; Frixione, 1983 ). Связывание этих op-ганелл с микротрубочками удается воспроизвести in vitro , причем такое связывание зависит от белков, ассоциированных с микротрубочками (Supemant, Dentier, 1982 ). от белков, ассоциированных с микротрубочками зависит также и связывание аденовирусов с концами микротрубочек (Weatherbee et ai., 1977 ), а тубулин входит в состав окаймленных клатрином пузырьков (Pfefer et ai., 1983).

Хорошо известна также роль микротрубочек в поддержании нормальной морфологии и распределения аппарата Гольджи. В норме аппарат Гольджи в культивируемых клетках занимает положение вблизи клеточного ядра, в районе, в котором кроме него находится центр организации микротрубочек ( Kupfer et ai., 1982 ). Разрзшіение микротрубочек митостатиками (Moskalewski et al., 1976 ) или ox-лаждением(Моакаіетеакі et al., 1980 ) ведет к распаду комплекса Гольджи на отдельные элементы, распределенные по всей цитоплазме. Аналогичное действие оказывает таксол, а также введение монокло-нальных антител к тубулину (Wehiand et al., 1983а ).

В клетках наблюдается также связь микротрубочек с промежу-

точными филаментами. Эта связь документирована в большом количестве работ. Так, Гейгер и Сингер (Geiger, Singer, 1980 ), используя антитела против белка промежуточных филаментов десмина и антитела против тубулина, нашли, что в культивируемых клетках гладких мышц распределение микротрубочек и промежуточных филаментов совпадает. Однако, это совпадение не является полным - существуют отдельные фибриллы каждого из типов, не связанные с фибриллами другого типа ( Singer et al., 1982). Выявляется также связь между микротрубочками и промежуточными филаментами виментинового типа в фибробластах (Ball, Singer, 1981 ). Даже при нарушении нормального расположения микротрубочек в клетках при обработке таксолом связь между ними и промежуточными филаментами сохраняется (Geuens et al., 1983 ).

В пользу того, что между промежуточными филаментами и микротрубочками имеется стабильная связь, свидетельствует также хорошо установленный факт, что в клетках, обработанных колхицином и другими митостатиками, нормальное расположение промежуточных филаментов нарушается, и промежуточные филаменты скапливаются вблизи ядра (см. сводку таких работ в обзоре Zackroff et al., 1981). Наличие мостиков.между микротрубочками и промежуточными филаментами, выявляемых с помощью электронной микроскопии, также свидетельствует о том, что в такой связи участвуют белки, ассоциированные с микротрубочками ( Rice et al., 1980 ).

Участие белков, ассоциированных с микротрубочками, в связывании промежуточных филаментов и микротрубочек подтверждают и биохимические данные. Так, показано, что белки нейрофиламентов соочищаются с микротрубочками в циклах полимеризации-деполимеризации (Keates, Hall, 1975; Runge et al., 1979'). В работе ( Ber-

kowitz et al., 1977 ) с помощью электронной микроскопии в пре-

парате микротрубочек из мозга обнаружены промежуточные филамен-ты. При смешивании промежуточных филаментов с микротрубочками образуется трехмерная сеть, включающая оба компонента и выявляемая с помощью вискозиметрии, электронной микроскопии или седи-ментационного анализа (Runge, Williams, 1982; Minami, et al.,

1982). Белки, ассоциированные с микротрубочками, обладают способностью связываться с промежуточными филаментами. Такое связывание ведет к потере этими белками способности стимулировать сборку микротрубочек (Leterrier et al., 1982 ).

Интересно, что в культивируемых фибробластах линии NRK при трансформации вирусом саркомы Рауса нормальная связь промежуточных филаментов с микротрубочками нарушается и большая часть промежуточных филаментов оказывается сосредоточенной около ядра, как в клетках, обработанных колхицином (Ball, Singer, 1981).

Многочисленны примеры участия микротрубочек в переносе материала в цитоплазме. Кроме упоминавшегося митотического веретена от интактной системы микротрубочек зависят многие типы внутриклеточного движения в интерфазных клетках. Одним из самых ярких примеров такого рода является перенос пигментных гранул в хроматофорах, где сотни гранул координирование переносятся на значительное расстояние со скоростью около 20 мкм/сек. (Porter, 1973 ). В хроматофорах имеется хорошо ориентированная радиальная система микротрубочек, вдоль которой переносятся'пигментные гранулы (schiiva, 1978 ), а разрушение микротрубочек приводит к инги-бированию транспорта гранул (см., например, Luby-Pheips, 1982; Beckerie, Porter, 1983 ). Таким образом, весьма вероятно, что микротрубочки принимают участие в переносе гранул в хроматофорах.

Другим, хорошо изученным примером зависимости внутриклеточ-

ного переноса от микротрубочек, является аксоплазматический транспорт. Так, колхицин, винбластин и подофиллотоксин ингиби-руют аксоплазматический транспорт (Wooten et al., 1975; Paulson, McGiure, 1975 ), а локальное введение колхицина ведет к накоплению вблизи места введения переносимого с аксонным током материала (Smith, 1980 ). Интересно, что при введении крысам $,р -иминодипропионитрила наблюдается перераспределение материала по поперечнику аксона - микротрубочки вытесняются к центру, а промежуточные филаменты - к периферии. При этом авторадиографическое исследование показывает, что переносимый с быстрым аксоплазматический транспортом материал оказывается ассоциированным с микротрубочками, а не с нейрофиламентами (Papasozomenos, Yoon, 1982 ). Поэтому можно полагать, что именно микротрубочки, а не промежуточные филаменты (нейрофиламенты) существенны для нормального процесса аксоплазматического транспорта.

Примеры зависимости внутриклеточного транспорта от микротрубочек слишком многочисленны, чтобы попытаться привести их в данном обзоре сколько-нибудь исчерпывающе. Существенно другое: даже в тех случаях, когда, на первый взгляд, разрушение микротрубочек приводит к эффектам, не связанным с изменениями внутриклеточного транспорта, эти эффекты могут на самом деле объясняться нарушениями такого транспорта. Например, нарушение нормального распределения стабильного и активного краев у мигрирующих фиб-робластов при действии митостатиков может быть объяснено подавлением направленного транспорта материала, необходимого для образования активного края к переднему краю фибробласта. Вместо этого такой материал, по-видимому, диффундирует от центра клетки к мембране по всему клеточному периметру, что приводит к образованию активного края не только на переднем конце, но и на ста-

бильных боковых краях.

Отметим в заключение, что пока ничего нельзя сказать, каким именно образом микротрубочки принимают участие во внутриклеточном транспорте материала. По всей видимости, для объяснения механизмов транспорта возможны, в принципе, две гипотезы. Во-первых, может быть, что транспорт материала вдоль микротрубочек в цитоплазме осуществляется каким-либо способом, сходным со способом функционирования микротрубочек в ресничках и жгутиках. В частности, возможно, что" материал, переносящийся вдоль микротрубочек, связывается с теми или иными ассоциированными белками и передается по ним. сопряженно с гидролизом АТФ.

Во-вторых, возможно,перенос материала вдоль микротрубочек осуществляется за счет контролируемой сборки микротрубочек на одном конце и разборки на другом конце, а переносимый материал относительно стенки микротрубочек не передвигается. Некоторым свидетельством в пользу такой концепции могут служить данные о том, что обработка культивируемых клеток таксолом, приводящая к подавлению разборки микротрубочек, вызывает митотический блок и приводит к изменениям клеточной подвижности, подобным тем, какие вызывают в клетках колхицин и другие вещества, блокирующие

полимеризацию (schiff, Horwitz, 1980; De Brabander et al., ^І98ІВ) Вне зависимости от того, участвует ли процесс сборки-разборки непосредственно в функционировании микротрубочек, ясно, что он принципиально важен для этой системы, поскольку правильная работа цитоплазматических микротрубочек требует того, чтобы в надлежащее время цитоплазматические микротрубочки присутствовали в тех частях клетки, в которых они должны функционировать. Более того, существенно, что цитоплазматические микротрубочки не собираются раз и навсегда. Они являются лабильными образова-

ниями, посколько колхицин, ингибирующий полимеризацию тубулина, вызывает разрушение микротрубочек (за счет естественно идущих процессов полимеризации). Кроме того, при тотальных перестройках клеток, например, при распластывании или при построении митоти-ческого веретена, тотальной реорганизации подвергается и система микротрубочек.

Вместе с тем, чрезвычайно мало известно относительно процессов, регулирующих сборку микротрубочек. В частности, при исследовании процессов сборки in vitro показано лишь, что полимеризация тубулина стимулируется ассоциированными белками, но ни один из этих белков к моменту начала настоящей работы не был выделен в чистом виде, не было исследовано их действие на полимеризацию, связывание с микротрубочками и свойства.

Еще меньше данных имелось относительно регуляции состояния микротрубочек в живых клетках. В частности, полностью отсутствовали данные о том, каковы клеточные механизмы, определяющие стабильность микротрубочек в цитоплазме, хотя, очевидно, именно от этих механизмов и должна зависеть степень полимеризации клеточного тубулина и перестройки системы цитоплазматических микротрубочек в зависимости от потребностей клетки.

В связи с этим настоящая работа и была посвящена выяснению природы факторов, определяющих сборку и разборку микротрубочек в клетках и в бесклеточной системе.

3 . IV1 А Т Е Р И А Л Ы И МЕТОД Ы

3.1. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

З.І.І. Препаративные методы

3.1.I.I. Получение препарата белков микротрубочек

Для получения белков микротрубочек из мозга крупного рогатого скота пользовались методом полимеризации-деполимеризации ( Weisenberg et ai., 1973 ), модифицированным нами (Родионов и др., 1978). Для этого свежий мозг немедленно после получения (обычно не позднее 30 минут с момента забоя) помещали в лед. Через I час после этого (время, необходимое для доставки материала в лабораторию) мозг гомогенизировали в блендере при 4-5С в буферном растворе, содержащем 50 мМ имидазол, 50 мМ KCl , 0,5 мМ MgCi₂ pl^n 7,2 из расчета I мл буферного раствора на I г сырого веса ткани. После гомогенизации в таком буфере рН гомогената обычно равнялся 6,7. Гомогенат центрифугировали при 15 000g в течение 20 минут для удаления крупных обломков клеток, после чего к суперна-танту добавляли ГТФ до конечной концентрации 0,1 мМ и осветляли центрифугированием на высокой скорости (100 000g , 30 мин., 2С). Осветленный гомогенат разбавляли тем же буфером, что и для гомогенизации, но содержащим 8 или 12 М глицерин и имеющим рН 6,7, чтобы конечная концентрация глицерина составила 4 М, добавляли ЭГТА до конечной концентрации I мМ и инкубировали 60 мин. при 37С для полимеризации тубулина.

Образовавшиеся микротрубочки осаждали в течение 40 мин. центрифугированием при 140 000 g в течение 40 мин., осадки суспендировали в буферном растворе, содержащем 50 мМ имидазол, 50 мМ KG1 , 0,5 мМ MgCi₂ , 0,1 мМ ГТФ, инкубировали при 0С

в течение 30 мин. для деполимеризации и осветляли центрифугированием при 100 000g в течение 30 мин. при 0С. Получаемый таким образом материал являлся суммарным препаратом белков микротрубочек, полученным одним циклом полимеризации-деполимеризации.

Для проведения второго цикла полимеризации белок инкубировали 30 мин. при 37С в присутствии І мМ ГТФ и I мМ ЭГТА, осаждали (100 000 g , 20С, 30 мин.), суспендировали в буфере с ОДмМ ГТФ без ЭГТА и деполимеризовали (0С, 30 мин.). Деполимеризован-ные белки микротрубочек освобождали от агрегатов денатурированного белка центрифугированием (100 000 g , 0С, 30 мин.).

Для хранения препарата применяли буфер, содержащий 4 М глицерин. Хранили препарат при 4С не более 10 дней. Для получения белков микротрубочек из такого препарата микротрубочки осаждали центрифугированием, суспендировали, деполішеризовали и осветляли, как описано выше.

В ряде случаев при отработке методов выделения белка MAPI мы получали белок микротрубочек, как описано в работе (Karr et al., 1979Ъ ). Этот вариант метода полимеризации-деполимеризации отличался от описанного выше тем, что гомогенизацию проводили с помощью гомогенизатора с тефлоновым пестиком в буфере, содержащем 10 мМ имидазол, 0,52 М сахарозу, І мМ АТФ и I мМ ЭГТА, рН 7,2. Как утверждается в этой работе, в таких условиях разрушение клеток проходило без нарушения целостности митохондрий, лизосом и других везикулярных органелл цитоплазмы. В этом случае полимеризация индуцировалась ГТФ и глицерином (конечная концентрация I мМ и 4 М соответственно).

3.1.1.2. Получение очищенного тубулина и Фракции белков, ассо
циированных с микротрубочками.

Похожие диссертации на Регуляция сборки и разборки микротрубочек в клетках

Участие микротрубочек в регуляции актинового цитоскелета в клетках эндотелия Смурова Ксения Михайловна

Регуляция формирования радиально-симметричной системы микротрубочек в интерфазной клетке Бураков Антон Владимирович

Исследование динамики формирования и механизмов регуляции сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogasterГубанова Наталья Владимировна

Посттрансляционные модификации тубулина в системе микротрубочек клеток млекопитающих в ходе стандартного митоза и при патологии деленияБалашова Елена Евгеньевна

Формирование радиальной системы микротрубочек в интерфазных клетках млекопитающих: роль динеина и протеинкиназы LOSKКоваленко Ольга Викторовна

Внецентросомные детерминанты организации микротрубочек в интерфазных клеткахБродский Илья Борисович

Центросомальные и свободные микротрубочки в цитоплазме культивируемых клеток Чернобельская Ольга Аркадьевна

Реорганизация системы микротрубочек в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в интерфазных клеткахХарченко Марианна Викторовна

Регуляция дифференцировки клеток трансгенными нейротрофическими факторамиПавлова Галина Валериевна

Морфогенез и его регуляция в культуре эпидермальных клеток человекаВоротеляк, Екатерина Андреевна