Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Ядерная оболочка 12
1.1.1. Строение и белковый состав ядерной оболочки и ламины 12
1.1.2. Особенности организации ядерной оболочки клеток дрозофилы 16
1.2. Ядерные поровые комплексы 18
1.2.1. Ультраструктура ядерных поровых комплексов 18
1.2.2. Биохимический состав ядерных пор 21
1.2.3. Механизмы транспорта молекул через ядерную пору 25
1.3. Цитоплазматические поры пористых пластинок. Особенности распределения, структурная динамика и взаимосвязь с ядерными поровыми комплексами 28
1.3.1. Особенности распределения пористых пластинок в различных типах клеток и тканей 29
1.3.2. Биохимический состав пористых пластинок и цитоплазматических пор 31
1.4. Митотическая реорганизация ядерной оболочки и пористых пластинок 33
1.4.1. Характеристика основных этапов клеточного цикла 33
1.4.2. Механизм разборки ядерной оболочки 37
1.4.3. Механизм сборки ядерной оболочки 40
1.4.4. Особенности сборки-разборки ядерных пор in vitro и in vivo 41
1.4.5. Сборка-разборка цитоплазматических пор в условиях in vitro и в митозе in vivo 45
1.5 Ранние эмбрионы дрозофилы как удобная модель для сравнительного исследования ультраструктурной динамики ядерной оболочки и пористых пластинок in vivo 47
1.5.1. Характеристика раннего эмбрионального развития дрозофилы 47
1.5.2. Особенности регуляции клеточного цикла в раннем эмбриогенезе дрозофилы 50
Заключение 54
Глава 2. Материалы и методы 56
2.1. Характеристика использованных в работе лабораторных линий дрозофил 56
2.2. Получение эмбрионов дрозофилы на требуемой стадии развития 56
2.3. Фиксация и заливка эмбрионов для ультраструктурного анализа 56
2.4. Получение, окрашивание и исследование полутонких и ультратонких срезов 57
2.5. Определение цикла деления синцитиального эмбриона 58
2.6. Морфометрический анализ 58
2.7. Вестерн-блот и определение количества белка 61
2.8. Субклеточное фракционирование 62
2.9. Исследование фосфорилирования нуклеопорина р150 63
2.10. Микроинъекции и конфокальная микроскопия на живых эмбрионах дрозофилы 63
Глава 3. Результаты 66
3.1. Сходство и различие ультраструктурной организации ядерных и цитоплазматических пор на стадии интерфазы 66
3.2. Сравнительный анализ ядерных и цитоплазматических пор в процессе их сборки-разборки в митозе 66
3.3. Особенности строения и распределения пористых пластинок на разных стадиях синцитиального развития дрозофилы 78
3.3. Морфометрический анализ количественной динамики ядерных и цитоплазматических пор на разных стадиях эмбриогенеза дрозофилы 83
3.4. Сравнительное исследование относительного количества отдельных нуклеопоринов в эмбрионах дрозофилы на разных стадии эмбриогенеза 86
3.5. Анализ распределения нуклеопоринов в ядерной, мембранной и цитозольной фракциях, выделенных из эмбрионов дрозофилы 88
3.6. Исследование фосфорилирования белков ядерных пор на примере нуклеопорина р 150 91
3.7 Влияние изменения уровня митотических циклинов на процессы сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор 93
3.7.1. Исследование влияния микроинъекции циклогексимида в синцитиальные эмбрионы дрозофилы 94
3.7.2. Морфометрический анализ количества цитоплазматических пор в эмбрионах png-мутантов со сниженным уровнем циклинов 99
3.8. Исследование влияния инактивации cdkl в синцитиальных эмбрионах термочувствительных мутантов на процесс сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор 102
3.9. Изучение действия окадаевой кислоты на процесс сборки ядерных и цитоплазматических пор 105
3.10. Изучение влияния малой ГТФ-азы Ran на сборку ядерных и цитоплазматических пор 107
Глава 4. Обсуждение 111
4.1. Динамика формирования ядерных и цитоплазматических пор в процессе митоза и раннего эмбриогенеза дрозофилы 111
4.2. Исследование функции пористых пластинок в синцитиальных эмбрионах дрозофилы 112
4.3. Cdkl и белковые фосфатазы, чувствительные к окадаевой кислоте, являются ключевыми регуляторами сборки/разборки ядерных и цитоплазматических пор в митозе 114
4.4. Влияние Ran на сборку ядерных и цитоплазматических пор 121
4.5. Заключение 123
Выводы 125
Литература 126
- Особенности регуляции клеточного цикла в раннем эмбриогенезе дрозофилы
- Микроинъекции и конфокальная микроскопия на живых эмбрионах дрозофилы
- Морфометрический анализ количественной динамики ядерных и цитоплазматических пор на разных стадиях эмбриогенеза дрозофилы
- Cdkl и белковые фосфатазы, чувствительные к окадаевой кислоте, являются ключевыми регуляторами сборки/разборки ядерных и цитоплазматических пор в митозе
Введение к работе
Актуальность проблемы. Между ядром и цитоплазмой эукариотической клетки постоянно происходит обмен информационными молекулами (мРНК) и белками -регуляторами репликации, транскрипции и трансляции. Дефекты в механизмах этого процесса могут вести к нарушению экспрессии генов, что может иметь серьезные последствия, начиная с отклонения в развитии организма и заканчивая злокачественным перерождением тканей. С этой точки зрения исследование функциональных взаимоотношений между ядром и цитоплазмой имеет не только фундаментальное научное значение, но и является актуальным вопросом, имеющим приложение в современной медицине. Основную роль в регуляции обмена между ядром и цитоплазмой играют ядерные поровые комплексы (ЯПК) -специфические каналы в ядерной оболочке (ЯдО), через которые осуществляется активный и пассивный обмен макромолекул. ЯПК являются сложными надмолекулярными структурами, в формировании которых принимает участие около 30 различных белков, называемых нуклеопоринами. Изучение механизмов < формирования ЯПК является одной из актуальных задач в исследовании регуляторных механизмов ядерно-цитоплазматического транспорта.
Одним из подходов в изучении формирования ЯПК является анализ особенностей их реорганизации в ходе митоза. Известно, что в начале митоза ЯПК разбираются на отдельные белковые компоненты, ламина деполимеризуется, а ядерные мембраны фрагментируются. После окончания митоза образуется сплошная двухслойная оболочка, в которой de novo формируются ЯПК. Известно, что в эукариотической клетке переход к митозу и его завершение происходят в результате активации и инактивации митотических киназ, что вызывает структурные изменения в цитоплазме и ядре клетки (Arellano, Moreno, 1997). Однако, то, как эти митотические факторы регулируют процессы сборки-разборки ЯПК, остается до сих пор мало изученными.
Показано, что в цитоплазме ооцитов и митотически активных клеток, таких, как опухолевые клетки и клетки ранних эмбрионов встречаются необычные мембраны, содержащие структуры, сходные с ЯПК и называемые цитоплазматическими порами (ЦП) или пороподобными комплексами. ЯПК и ЦП сходны по морфологии, белковому составу, а также проявляют синхронность в
процессе обратимой реорганизации в митозе. Мембраны, содержащий ЦП, обозначают как пористые пластинки (ПП) или окончатые мембраны. Они могут быть представлены одиночными пластинками или, чаще, стопками пластинок, расположенных в цитоплазме клетки. Существует предположение, что ПП являются запасающим компартментом нуклеопоринов для формирования ЯПК в ЯдО ооцитов амфибий. Функция ПП в соматических митотически активных клетках на сегодняшний день остается недостаточно исследованной.
Известно, что малая ГТФ-аза Ran принимает активное участие в ядерно-цитоплазматическом транспорте, а также регулирует процессы формирования митотического веретена и ЯдО (Clarke, Zhang, 2004). Недавние исследования продемонстрировали, что Ran контролирует также сборку ЯПК у дрожжей (Ryan et al., 2003) и ЦП в системе in vitro (Walter et al., 2003), однако механизмы этого процесса изучены не достаточно.
Наиболее удобным объектом для изучения регуляции митотической реорганизации ЯПК и ЦП являются эмбрионы дрозофилы на стадии синцитиальной бластодермы. В них ядра претерпевают 13 быстрых синхронных делений, что позволяет получать образцы, содержащие ядра на разных стадиях клеточного цикла. В цитоплазме эмбриона присутствуют также ПП, которые синхронно собираются и разбираются в ходе митоза. В дополнение к этому, начиная с 9 цикла деления, ядра разделяются на две популяции: быстро делящиеся на периферии эмбриона Бластодермальные ядра, и находящиеся в центре эмбриона и не подверженные делению, полиплоидные желточные ядра. Это предполагает существование различий в митотической реорганизации ядер и расположенной рядом с ними цитоплазмы в центральной и периферической областях эмбриона. Синцитиальные эмбрионы дрозофилы удобны также для манипуляций и наблюдения с помощью конфокальной и электронной микроскопии. На основании этого были сформулированы следующие цель и задачи настоящего исследования. Цель диссертационной работы - изучение регуляции митотической реорганизации ядерных и цитоплазматических пор и анализ их функционального взаимодействия в эмбрионах дрозофилы на стадии синцитиальной бластодермы. В работе решались следующие конкретные задачи:
Провести электронно-микроскопический анализ динамики ядерной оболочки и пористых пластинок на разных стадиях клеточного цикла.
Выяснить являются ли пористые пластинки запасающим компартментом нуклеопоринов в синцитиальных эмбрионах дрозофилы.
Определить, как активность митотических киназ и фосфатаз влияет на сборку-разборку ядерных и цитоплазматических пор.
Определить влияние малой ГТФ-азы Ran на процесс сборки ядерных и цитоплазматических пор.
Новизна и научная ценность работы:
С использованием методов электронной микроскопии, морфометрического анализа и микроинъекций впервые показано, что основная часть нуклеопоринов находится в растворенном состоянии в цитоплазме синцития и ПП не являются основным запасающим компартментом для белков ядерных пор. Установлено, что процесс сборки-разборки ЯПК и ЦП регулируется динамическим равновесием между активностью митотической киназы cdkl и действием фосфатаз, чувствительных к окадаевои кислоте. На основании проведенных исследований предложена модель регуляции сборки/разборки ЯПК и ЦП в синцитиальных эмбрионах дрозофилы. Продемонстрировано, что малая ГТФ-аза Ran участвует в формировании ядерной оболочки и ядерных пор и не влияет на формирование цитоплазматических пор. Показано, что синцитиальные эмбрионы дрозофилы являются удобной экспериментальной моделью для изучения процессов регуляции сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор in vivo. Апробация работы
Результаты исследований были представлены на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН в 2002 и 2005 гг., XIX Российской конференции по электронной микроскопии (Москва, 2002), III Международной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы современной биологии и биотехнологии» (Казахстан, Алма-Аты, 2003.), Международном симпозиуме по проблемам мейоза (Санкт-Петербург, 2003), Международном симпозиуме «Ядерная оболочка в передаче информации и генной регуляции» (Дарем, Великобритания, 2004), III съезде ВОГИС (Москва, 2004) и Дальневосточной школе-конференции (Владивосток, 2006).
Вклад автора
Автором были зафиксированы образцы эмбрионов дрозофилы и приготовлены препараты для световой и электронной микроскопии, проведен качественный анализ электронно-микроскопических образцов, а также выполнен морфометрический анализ количества ЯПК и ЦП.
Гель электрофорез, Вестерн-блот анализ, субфракционирование, количественная оценка содержания нуклеопоринов в различных фракциях, конфокальная микроскопия и микроинъекции были проведены Е.А.Онищенко (Содерторнский университетский колледж, Стокгольм, Швеция).
По результатам работы опубликованы следующие работы: Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Динамика и функция окончатых мембран в ранних эмбрионах Drosophila melanogaster II Тезисы докладов XIX Российской конференции по электронной микроскопии, Черноголовка, РАН. 2002. С. 210
Губанова Н.В.. Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Динамика окончатых мембран в раннем эмбриогенезе Drosophila melanogaster. Ультраструктурные исследования и морфометрический анализ. // Тезисы докладов Ш Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии и биотехнологии», Алма-Аты, Казахстан. 2003. С. 151 Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Электронно-микроскопический анализ динамики окончатых мембран в раннем эмбриогенезе у Drosophila melanogaster. Ультраструктура пороподобных комплексов в процессе митоза. // Тезисы докладов Международного Симпозиума по проблемам мейоза. Санкт-Петербург, Цитология. 2003. Т.45(9). С. 252.
Onischenko Е.А., Gubanova N.V.. Kiseleva E.V., Hallberg E. Downregulated assembly of annulate lamellae in syncytial Drosophila embryos II International Symposium: Communication and gene regulation at the nuclear envelope. The University of Durham. 2003. P. 26.
Губанова H.B.. Онищенко E.A., Киселева Е.В. Сравнительный анализ структурно-функциональной организации окончатых мембран и ядерной оболочки в раннем эмбриогенезе дрозофилы // Тезисы докладов. III съезд ВОГиС. «Генетика в XXI:
современное состояние и перспективы развития», Москва, Россия. 2004. Т. II С. 281.
Onischenko ЕА, Gubanova NV, Kieselbach Т, Kiseleva EV, Hallberg E Annulate lamellae play only a minor role in the storage of excess nucleoporins in drosophila embryos. II Traffic. 2004. V. 5. P. 152-164;
Onischenko E.A., Gubanova N.V., Kiseleva E.V., Hallberg E. Cdkl and Okadaic acid-sensitive phosphatases control assembly of nuclear pore complexes in Drosophila embryos. II Мої. Biol. Cell. 2005. V. 16. P. 5152-5162;
Морозова K.H., Губанова H.B.. Киселева E.B. Структурная организация и возможная функциональная роль пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры. // Цитология. 2005. Т. 47(8). С. 667-678; Губанова Н.В., Онищенко Е.А., Киселева Е.В. Малая ГТФ-азы Ran влияет на сборку ядерных пор, но не участвует в сборке цитоплазматических поровых комплексов. // Тезисы докладов. X Международная молодежная Школа-конференция, Владивосток, Россия. 2006. С. 132.
Губанова Н.В., Морозова К.Н., Киселева Е.В. Структурная организация и функция ядерных пор. // Цитология. 2006. Т. 48(11). С. 887-899.
Губанова Н.В.. Киселева Е.В. Структурная организация и функция ядерной оболочки // Цитология. 2006. Т. 49(3) (в печати).
Особенности регуляции клеточного цикла в раннем эмбриогенезе дрозофилы
Цитоплазматический отдел ЯПК локализован над и непосредственно в плоскости внешней ядерной мембраны. Он состоит из тонкого кольца, имеющего толщину около 20 нм и диаметр около 120 нм (Рис. 1.3), и восьми цитоплазматических субъединиц размером 30 нм, каждая из которых несет по одному цитоплазматическому филаменту, направленному в цитоплазму.
Цитоплазматические субъединицы сидят на тонком кольце, как бусины на нитке, и могут вращаться в разных направлениях (Akey, Radermacher, 1993; Hinshaw et al., 1992; Goldberg, Allen, 1996; Ris, 1997; Kiseleva et al., 1998). Звездчатое кольцо, расположенное под тонким кольцом, содержит восемь трехгранных субъединиц, которые разъединяют цитоплазматические субъединицы. В цитоплазматическом отделе имеется также периферическая глобула, которая закрывает вход в центральный канал транспортера со стороны цитоплазмы и связана с помощью филаментов с тонким кольцом (Kiseleva et al., 2000) (на Рис. 1.3 не показана).
Центральный компартмент является наиболее массивной частью ЯПК, формирует центральный канал поры и состоит из двух симметричных частей (Рис. 1.3). Каждая из них включает фрагмент цилиндрического транспортера и два кольца, внутреннее и трансмембранное, которое пронизывает ядерную мембрану и служит связующим звеном в системе спиц. Эти кольца соединяют периферические компартменты ЯПК посредством вертикальных спиц и обеспечивают, вероятно, согласованное функционирование поры в процессе транспорта молекул. Центральный канал ЯПК, расположенный внутри транспортера, может либо расширяться от 10 нм в неактивном состоянии до 26 нм и более (Kiseleva et al., 1998; Pante, Капп, 2002), либо сужаться, за счет изменения расстояния между соседними субъединицами транспортера и внутреннего кольца. Считается, что пора имеет периферические каналы диаметром около 5 нм между составляющими ее компартментами, через которые могут диффундировать небольшие молекулы (Kiseleva et al., 2000). Согласно данным электронной микроскопии, кольцо спиц ядерной поры контактирует с ламиной, сетью промежуточных филаментов, подстилающей внутреннюю мембрану ядра (Акеу, 1989; Goldberg, Allen, 1996).
Внутриядерный компартмент ЯПК располагается под внутренней ядерной мембраной и состоит из внутриядерного кольца диаметром 120 нм, которое тесно контактирует с мембраной и содержит восемь трехгранных субъединиц. Они располагаются между отходящими от кольца 10-нм филаментами, формирующими баскет-структуру (Рис. 1 в, г). В неактивной ядерной поре фибриллы баскета закрывают вход в пору, а в активной поре они формируют дополнительное «терминальное» кольцо диаметром около 50 нм (Goldberg, Allen, 1993; Kiseleva et al., 1996).
Структурная организация ЯПК у человека, птиц, амфибий, насекомых и высших растений сходна и является высоко консервативной. Плотность расположения пор в ЯдО варьирует в среднем от 13 до 30 пор на мкм2 ядерной оболочки, и достигает 5 000 пор на одно ядро в ранних эмбрионах дрозофилы (Onischenko et al., 2004). Предполагается, что все ядерные поры являются универсальными и могут обеспечивать транспорт молекул как в ядро, так и в цитоплазму. Изменение числа поровых комплексов в ЯдО высших эукариот может происходить при изменении функционального состояния клеток, вероятно, за счет их образования de novo (Maul, 1977). В то же время, из-за тесной связи с ламиной, ЯПК высших эукариот не могут изменять свое местоположение.
В отличие от высших, у низших эукариот (дрожжей) отсутствует ламина и перинуклеарное кольцо центрального отдела, благодаря чему их ядерные поры могут свободно перемещаться вдоль ЯдО, и их плотность в различных участках оболочки может существенно меняться. Структура ядерных пор дрожжей менее изучена по сравнению с порами высших эукариот, хотя показано, что их диаметр ( 100 нм) меньше, чем у пор высших организмов ( 120 нм), а часть нуклеопоринов в них отсутствует. Предложенные две модели организации ЯПК дрожжей (Yang et al., 1998; Kiseleva et al., 2004), демонстрируют более простое строение по сравнению с клетками высших эукариот, хотя периферические отделы в порах дрожжей также несимметричны, а центральный канал имеет те же размеры, что и у высших эукариот. Наблюдаемая универсальность ассиметричной организации ЯПК предполагает, что именно такое строение необходимо для обеспечения возможности двунаправленного транспорта молекул через ЯПК.
Используя биохимические, иммунологические методы и функциональный анализ одиночных нуклеопоринов, всего в ядерных порах позвоночных обнаружено 32 белка, непосредственно входящих в состав поры, а также 18 белков, относящихся к классу ЯПК-ассоциированных белков (Cronshaw et al. 2002).
Нуклеопорины взаимодействуют между собой, образуя комплексы, и организуют примерно 12 субъединиц, на которые пора разбирается в профазе и из которых она собирается в телофазе (Matsuoka et al., 1999; Miller et al, 2000; Smythe et al., 2000) (Рис. 1.4). Новые поры, по-видимому, также собираются из этих субкомплексов во время S-фазы, когда количество пор у позвоночных удваивается (Vasu, Forbes, 2001).
В экспериментах с использованием GFP-меченых белков и антител к нуклеопоринам было установлено, что внутриядерная баскет-структура ЯПК содержит Nupl53, Nup98/Gle2, Nup50 и новый субкомплекс Nupl60, содержащий целую группу белков Nupl60/Nupl33/Nup96/Nupl07 и другие. К потенциальным составным компонентам центрального отдела ЯПК относят: комплекс Nup93/Nup205/Nupl88 и Nupl55, а также Nup62/Nup58/Nup54/Nup45-cy6KOMroieKc, который расположен около или непосредственно в районе центрального транспортера. Цитоплазматические филаменты содержат Nup214, Nup88, Nup358, RanGAP (белок, активирующий ГТФ-азу Ran) и RanBPl (Ran binding protein). Специфический убиквитин-подобный модификатор SUMO-1, связывающий RanGAP и Nup358, также расположен на цитоплазматических фибриллах (Vasu, Forbes, 2001).
Микроинъекции и конфокальная микроскопия на живых эмбрионах дрозофилы
Цитоплазматические поры (ЦП), сходные по своей морфологии с ЯПК, встречаются в составе ПП - составного компартмента эндоплазматического ретикулума (Palade, 1955). Впервые эти структуры были описаны, как «пустые» участки цитоплазмы, характеризующиеся двойным лучепреломлением Моне (Моппе, 1945), при анализе центрифугированных неоплодотворенных яиц морского ежа Arbacia punctulata (Kessel, 1989). В 1952 г. сходные образования были обнаружены у других животных этого семейства при изучении клеток в световом и электронном микроскопе. Затем эти структуры были выявлены также в сперматогониальных клетках и ооцитах. Авторы определяли их, как слоистые мембраны, периодические мембраны, пористые пластинки, пористые мембраны и т.д. Для этих цитоплазматических органелл был предложен термин annulate lamellae - пористые пластинки, закрепившийся в современной научной литературе (Swift, 1956). Если в работах 1950-1960-х годов эти органеллы обнаруживались в основном в эмбриональных клетках или в женских гаметах (Kessel, 1963), то к 1980-м годам они были описаны также в опухолевых клетках, в клетках растений и в соматических клетках различного происхождения и функций (Franke et al., 1972; Nakayama et al., 1977; Pereda et al., 1989)
С первых шагов обнаружения ПП в цитоплазме различных клеток, перед исследователями встал вопрос об их происхождении и функциональной роли. Помимо цитоплазмы, ПП были выявлены также внутри ядер некоторых клеток, например, в ядрах ооцитов морского ежа (Afzelius, 1955). Поскольку при электронно-микрокопическом анализе строения ЦП они напоминали ЯПК, то было высказано предположение об образовании этих органелл из выпячивания ЯдО в профазе митоза (Hertig, 1968; Swift, 1956). В то же время, другие авторы предполагали, что ПП являются структурной вариацией ЭРП (Palade, 1955) и могут формироваться либо из эндоплазматических пузырьков (Kessel, 1989), либо из цистерн аппарата Гольджи (Maul, 1977; Spindler, Hemleben, 1982). Наличие в ПП структур, морфологически сходных с ЯПК, на первых этапах исследования затрудняло их идентификацию, как отдельных цитоплазматических органелл, но, с другой стороны, вызывало интерес исследователей к их функции и причинам появления в клетках. Структурная организация, динамика и обновление ядерных пор относятся к актуальным проблемам современной биологии, поэтому вопрос о возможной функциональной роли цитоплазматических пор в этих процессах представляет существенный интерес.
Частая встречаемость ПП в быстро растущих и митотически активных клетках (ооцитах, эмбриональных и опухолевых клетках) впервые была продемонстрирована Кесселом и Бимсом (Kessel, Beams, 1968). ПП были описаны в ооцитах всех основных групп организмов (Kessel, 1989; Ramos, 1999; Rawe et al., 2003). Можно предположить, что присутствие ПП в таких клетках обусловлено их уникальной способностью значительно увеличивать свои размеры без деления, т.е. связано с необходимостью накопления значительного количества материала, требующегося для поддержания нормальной жизнедеятельности усиленно растущей клетки. ПП были описаны в половых клетках (сперматогониях, сперматоцитах, сперматидах) и позвоночных, и беспозвоночных (Panigua et al., 1984; Chakraborty et al., 1986). ПП широко распространены также в клетках Сертоли семенников млекопитающих (Kessel, 1989). Больше всего ПП обнаруживается в сперматогенных клетках насекомых и млекопитающих (Romeo et al., 1992). ПП являются маркерными органеллами, что может быть использовано для отслеживания миграции половых клеток в эмбриогенезе.
В обычных соматических клетках ПП встречаются редко (Bellamy, Kendall, 1985), в некоторых соединительных тканях не встречаются вообще, однако, их появление отмечено при сверхэкспрессии некоторых белков ЯПК, таких, например, как р62, Nup214, Nupl53 и Pom 121 (Ewald et al., 1996; Daigle et al., 2001).
В растениях ПП отмечены в пыльце при формировании пыльцевой стенки, в растущих пыльцевых зернах (Sen, 1970), в культуре стебля (Franke, 1972), в микроспороцитах (Sheridan, Barrnett, 1969), в постмейотических тетраспоровых клетках красных водорослей (Peel, 1973), во флоэме татарника, зараженного желтым вирусом (Steinkamp, Hoefert, 1972).
Многочисленные исследования указывают на широкое распространение ПП в опухолевых и раковых клетках - в лимфомах, аденомах, саркомах, меланомах, нейробластомах, мезотелиомах, лейкемии и др. (Nakayama, 1977; Jesionek-Kupnicka, 1999). Так, например, ПП были обнаружены в опухолевых клетках злокачественной меланомы, фиброидной мезотелиомы и лимфобластической лимфомы. Позднее ПП были описаны в 3 из 40 случаев рака простаты человека, в то же время в 20 случаях доброкачественной простатической гиперплазии ни одной ПП не наблюдалось. Многочисленные ПП были отмечены в клетках парацистовидной аденомы, при раке молочной железы крыс, в случае диффузной лимфоцитной лимфомы, в аденокарциноме фаллопиевых труб, первичном раке фаллопиевых труб (Kessel, 1989). Кроме того, ПП встречаются в экзокринном раке поджелудочной железы, в ацинарных опухолевых клетках, в случае саркомы, гепатомы, паращитовидной аденомы, рака груди, злокачественной меланомы мочевого пузыря, нейробластомы, опухоли яичников, простаты, гипофизомы и других случаях злокачественных перерождений (Jesionek-Kupnicka, 1999).
ПП были обнаружены в различных линиях культуры клеток, однако доля клеток в пассаже, содержащих ПП, сильно отличалась у разных линий. Так для линий HeLa, HF-SV80, MCF7, А431, СаСо-2, глиома U333CG/343 MG, НаСаТ, RC37, BMGE, MDBK, MDCK, а также в первичной культуре клеток человеческих кератиноцитов, было зарегистрировано от 50 до 95 % клеток в пассаже, содержащих ПП. Менее 20 % клеток, содержащих ПП, были обнаружены в линии Hep G2, и только 5 % клеток содержали ПП в таких линиях как PtK2 и RV (Cordes et al., 1996). ПП встречаются также в клеточных линиях не опухолевого происхождения, таких как RC37 и BMGE. Возможно, такая картина наблюдается вследствие гетерогенности клеточной популяции, постоянной для каждой клеточной линии.
Таким образом, полученные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что ПП появляются в клетках, способных быстро и неограниченно расти или делиться. По-видимому, это связано с тем, что в цитоплазме таких клеток накапливается избыточное количество нуклеопоринов, и создаются специфические условия, необходимые для формирования ПП. Очевидно, что необходимы интенсивные исследования, направленные на детальное изучение значения ПП в раковых и опухолевых клетках.
Морфометрический анализ количественной динамики ядерных и цитоплазматических пор на разных стадиях эмбриогенеза дрозофилы
Оболочка ядра начинает формироваться в процессе митоза на стадии ранней телофазы. Этот процесс был подробно исследован в условиях in vitro, при инкубации грубого экстракта цитоплазмы и мембран из ооцитов амфибий и компактного хроматина спермы (Wiese et al., 1997; Lohka, 1998). Было показано, что на начальном этапе формирования ЯдО происходит связывание рибосом-содержащих везикул с поверхностью декомпактизующегося хроматина спермы. Затем, с шероховатыми пузырьками сплавляются гладкие пузырьки, что приводит к формированию крупных фрагментов ЯдО (Рис. 1.76). Далее эти фрагменты сливаются, поверхность ядра выравнивается и происходит перераспределение интегральных мембранных белков между наружной и внутренней мембранами ЯдО (Wiese et al., 1997).
Установлено, что на стадии ранней телофазы в ЯдО появляются белки LAP2, LBR, эмерин и мембранный белок ядерной поры Рот 121 (Burke, Ellenberg, 2002). Затем начинается сборка ЯПК (см. следующий параграф) после завершения которой, ламины, сначала В, а затем А/С, появляются в ядре в конце телофазы начале интерфазы (Wiese et al., 1997; Burke, Ellenberg, 2002). В этих же экспериментах было установлено, что при нарушении формирования нормальных поровых комплексов, внутренняя и внешняя мембраны ЯдО не располагаются параллельно, а образуют вздутия и инвагинации относительно друг друга, что, как полагают, связано с нарушением формирования ламины.
Цитоплазматические компоненты клетки могут принимать активное участие в сборке оболочки ядра. Например, при исследовании процесса сборки ядер in vitro, было установлено, что ЯдО не формируется после добавления в инкубационную смесь реагентов, разрушающих микротрубочки (Ewald et al., 2001). Высказано также предположение об участии ПП в сборке ЯдО и ядерных пор (Морозова и др., 2005).
Сборка и разборка ядерных пор интенсивно изучались и изучаются в экспериментах in vitro, благодаря которым была получена уникальная информация о последовательных этапах и механизмах регуляции этих процессов. При этом, в большинстве случаев, используется цитоплазматический экстракт из ооцитов амфибий, который инкубируется с компактным хроматином спермы, и за 1,5 - 2,5 часа такой инкубации формируются функционально активные (способные к репликации и транскрипции) ядра со зрелыми ядерными порами (Marshall, Wilson, 1997; Lohka, 1998).
Исследование формирующейся in vitro ЯдО, с использованием высокоразрешающей сканирующей электронной микроскопии, позволили получить новые данные о последовательности событий, происходящих в области цитоплазматического отдела ядерной поры (Goldberg et al, 1997; Marshall, Wilson, 1997). Было показано, что после формирования вокруг декомпактизующегося хроматина крупных фрагментов ядерной оболочки, в них начинается сборка ЯПК. Сначала в различных участках наружной ядерной мембраны появляются небольшие углубления, которые затем превращаются в поры размером 10-20 нм. Далее диаметр пор увеличивается до 40 нм и начинается последовательное формирование сначала центральных, а затем периферических компонентов ЯПК. Установлено, что сборка составляющих пору отдельных компонентов происходит асинхронно: сначала образуется одна составляющая компонент субъединица, затем вторая и т.д. При этом пора постепенно увеличивается в размере и за 4-6 минут превращается в зрелую пору диаметром 110-120 нм (Goldberg et al., 1997). Эти данные впервые продемонстрировали, что сборка ЯПК осуществляется за счет формирования промежуточных структур. Следует отметить, что процесс сборки ядерных пор со стороны ядра до сих пор до конца не изучен, также как и не ясен вопрос о синхронности формирования периферических отделов ядерных пор. С использованием митотического экстракта в опытах in vitro было показано, что распад ядерной оболочки происходит за счет формирования длинных трубочек и цистерн, напоминающих компоненты эндоплазматического ретикулума (Cotter et al., 1998).
Результаты экспериментов по исследованию механизмов распада и сборки ядерных пор in vitro были подтверждены в опытах in vivo, при изучении деления ядер в ранних эмбрионах дрозофилы (Kiseleva et al., 2001). Было установлено, что при разборке ЯПК, которая начинается в профазе митоза, сначала разбираются центральные, затем периферические компоненты пор, после чего ЯдО распадается. ЯПК разбираются на 12 субкомплексов (Matsuoka et al., 1999; Miller, Forbes, 2000; Smythe et al., 2000), из которых затем поры собирается на стадии ранней телофазы, после формирования ядерной оболочки через те же промежуточные структуры (Рис. 1.8), которые наблюдались при формировании ЯПК в опытах in vitro. Интересно, что формирование пор в экспериментах in vivo инициируется преимущественно в участках слияния везикул ЭПР с наружной ядерной мембраной. При этом сначала в отверстие поры встраивается центральный транспортер, затем собираются звездчатое и тонкое кольцо, и в последнюю очередь формируются цитоплазматические гранулы и фибриллы (Kiseleva et al., 2001). Таким образом, этот процесс является зеркальным отражением разборки ЯПК в профазе. Можно предположить, что сборка ЯПК со стороны нуклеоплазмы должна происходить аналогично тому, что наблюдается со стороны цитоплазмы, за исключением того, что вместо гранул с фибриллами будет формироваться баскет-структура.
Существуют неоднозначные данные относительно последовательности сборки нуклеопоринов в ЯПК в ранней анафазе. Эксперименты in vivo показали, что в поздней анафазе с хроматином связываются нуклеопорин Nupl53 и белок ядерной ламины LAP2 (Bodoor et al., 1999а; 19996). После формирования вокруг декомпактизующихся хромосом двух мембран ядерной оболочки инициируется формирование центрального отдела ЯПК, которое начинается со встраивания белка Рот121 и субкомплекса Nup62, включающего также белки Nup58, Nup54 и Nup45. Затем в ядерную пору встраиваются нуклеопорин CAN/Nup214, который образует комплекс с белком Nup88(84), и белок gp210, который ассоциируются с мембранами ядерной оболочки в поздней телофазе. По данным других авторов (Smythe et al., 2000), последовательность сборки нуклеопоринов в ЯПК несколько отличается.
Сначала собирается комплекс, состоящий из нуклеопоринов Nup62 и Nup214, а затем к ним присоединяется Nupl53. Существует также предположение о том, что сборка ЯПК у позвоночных инициируется в результате взаимодействия комплекса Nupl07-Nupl60 с хроматином (Walther et al., 2003а; Harel et al., 20036).
До сих пор неясно, какова последовательность сборки белков на самых начальных этапах формирования ЯПК de novo и что инициирует слияние мембран в этом участке. Предполагается, что Рот121 необходим на первом этапе слияния двух мембран ядерной оболочки (Bodoor et al., 19996), тогда как gp210, в большом количестве накапливающийся вблизи поры, обеспечивает ее стабильность и встраивание в этот участок других нуклеопоринов (Vasu, Forbes, 2001). Недавние исследования продемонстрировали, что для встраивания новых ядерных пор в интактную ЯдО необходим комплекс Nup 107-160, который ассоциирован с местом формирования новой ядерной поры в ЯдО как с ядерной, так и с цитоплазматической стороны (D Angelo et al., 2006). Также было показано, что для встраивания ЯПК требуется присутствие Ran-ГТФ в ядерном и цитоплазматическом отделах поры (D Angelo et al., 2006).
Cdkl и белковые фосфатазы, чувствительные к окадаевой кислоте, являются ключевыми регуляторами сборки/разборки ядерных и цитоплазматических пор в митозе
При каждом делении ядра отдаляются друг от друга, и в телофазе 8 и 9 цикла большая часть ядер (бластодермальные ядра) мигрируют по направлению к периферии эмбриона (Zalokar, Erk, 1976). Ядра на заднем конце эмбриона, достигают клеточной мембраны первыми и формируют полярные тельца во время 9-ого цикла деления, тогда как на переднем конце эмбриона, который определяется по наличию пиле, ядра достигают периферии только в интерфазе 10-ого цикла. Цитологические исследования показали, что для кортикальной миграции ядер необходимы микротрубочки (Zalokar, Erk, 1976). Фое и Альберте (Foe, Albers, 1983) предположили, что, после того, как ядра достигли кортекса, они удерживаются там за счет взаимодействия астральных микротрубочек с желточными гранулами, которые к 10-ому циклу деления перемещаются в центр эмбриона. Предполагают, что микротрубочки центросом ассоциированы с каждым ядром, и таким образом удерживают желточные гранулы в центре эмбриона. В результате этого на периферии образуется область цитоплазмы, свободной от желточных гранул. Ядра, в свою очередь, также связаны с центросомами, и при помощи микротрубочек дистанцируются от плазмалеммы. Предполагается, что отталкивающие силы между астральными микротрубочками соседних ядер, удерживают ядра на одинаковом расстоянии друг от друга (Zalokar, 1976; Hatanaka, Okada, 1991), а взаимодействие астральных микротрубочек с кортикальным актином обеспечивает организацию ровного слоя ядер (Sullivan et al., 1993). Монослой бластодермальных ядер делится практических синхронно, образуя, так называемые митотические волны на поверхности эмбриона (Foe, Alberts, 1983). Митотические волны соответствуют разнице в фазе клеточного цикла между пространственно уделенными ядрами. В большинстве случаев эти волны возникают практически одновременно на противоположных полюсах эмбриона и встречаются в экваториальной его части (Foe, Alberts, 1983). После 3-х циклов деления, ядра уменьшаются в размере и плотно покрывают всю поверхность эмбриона. В течение 14-ого цикла деления (5-ая стадия эмбриогенеза), когда на периферии эмбриона количество ядер достигает 6 тыс., между ними начинают формироваться клеточные мембраны, которые затем полностью окружают ядра, и образуется бластула.
В то время как большинство ядер мигрирует в кортикальную зону, часть из них остается в центре эмбриона - это желточные ядра, которые продолжают синхронно делиться с остальными ядрами до 10 цикла деления. Отставая в делении на несколько минут от бластодермальных ядер, желточные ядра подвергаются эндорепликации и становятся полиплоидными. Показано, что желточные ядра лишены центросом, в результате чего они не способны поддерживать дистанцию относительно друг друга и способны сливаться с соседними ядрами, образуя около 100 полиплоидных ядер (Foe, Albers, 1983).
Контроль митотических циклов в ранних эмбрионах дрозофилы не зависит от окончания репликации ДНК, как в большинстве клеток. После обработки эмбрионов дрозофилы амфидоколином, ингибирующим синтез ДНК, в бластодермальных ядрах повторялись циклы центросомной репликации, сборки-разборки ламины и конденсации-деконденсации хромосом (Raff, Glover, 1988). Фое и Альберте предположили, что механизм обратной связи, основанный на полной репликации ДНК, не способен координировать митотические события в синцитиальном эмбрионе (Foe, Albers, 1983). На основании этого было сделано предположение о том, что регуляция клеточного цикла находится под влиянием изменения активности митотических киназ (Foe, Albers, 1983; Edgar et al., 1994).
Клеточный цикл в период синцитиального развития эмбриона дрозофилы имеет значительные отличия от описанного ранее. До 14 цикла деления, в нем отсутствуют стадии G1 и G2, а также система checkpoints, поэтому переход от стадии к стадии контролируется исключительно изменением активности митотических киназ во времени, такой тип контроля называется relative time control. Ядра, в которых произошел ненормальный синтез ДНК или митоз, исключаются из последующих раундов деления и не мигрируют в периферическую область, а остаются в центре эмбриона. В регуляции клеточного цикла в раннем эмбриогенезе принимают участие циклины - Е, J, А, В и ВЗ (Sauer et al., 1995; Jacobs et al., 1998; Kolonin, Finley, 2000). Циклины D и F (F циклин характерен только для дрозофилы) образуют комплекс с cdk2 и функционируют на постбластодермальных стадиях развития, когда появляются G1 и G2 стадии, переходы между которыми эти комплексы и контролируют.
Циклин Е, материнского происхождения, присутствует в период раннего эмбрионального развития на постоянно высоком уровне, вне зависимости от стадии клеточного цикла. К 14-ому циклу деления материнские транскрипты циклина Е полностью деградируют и появляются зиготические, которые восполняют уровень циклина Е до изначального уровня еще на три последующие стадии. Циклин Е образует комплекс с cdk2 и запускает репликацию ДНК, этот же комплекс предотвращает повторную репликацию генома в этом же цикле деления (Saueretal., 1995).
Циклин J обнаруживают только в синцитиальных эмбрионах дрозофилы до стадии целлюляризации. Он образует комплекс с митотической киназой cdk2 (синоним cdc2c) и осуществляет контроль S-стадии. При блокировании действия этого циклина в эмбрионах на стадии телофазы наблюдается хроматиновые мостики, которые, как предполагают, связаны с нарушением синтеза ДНК в S-стадии. Предполагают, что циклин J выполняет роль, характерную для циклина А у млекопитающих, у которых комплекс циклин A/cdk2 контролирует S-стадию, это предположение поддерживается тем фактом, что наиболее близким гомологом для циклина J является циклин А млекопитающих (Kolonin, Finley, 2000).
Митотические циклины А, В и ВЗ образуют комплекс с митотической киназой cdkl и действуют кооперативно. При этом циклины А и В проявляют цитоплазматическую локализацию во время интерфазы, и ядерную - в процессе митоза, тогда как циклин ВЗ постоянно локализован в ядре (Jacobs et al., 1998). На стадии ранней профазы циклин А транспортируется в ядро, где вместе с циклином ВЗ регулирует конденсацию хроматина (Jacobs et al., 1998). Предполагают, что основную роль в инициации митоза играет циклин А, меньшую циклин В и самую незначительную циклин - ВЗ. С этим предположением согласуются данные о том, что в мутантных эмбрионах дрозофилы, лишенных циклина ВЗ, митоз проходит нормально. В отсутствие циклина В митоз проходит медленнее и формируются необычные веретена деления, на основании чего предполагают, что циклин В регулирует преобразование интерфазных микротрубочек в митотическое веретено (Jacobs et al., 1998). Если у позвоночных циклин А играет двойственную роль (с одной стороны, он контролирует S-фазу клеточного цикла, а с другой необходим -для входа в митоз), то в синцитиальных эмбрионах дрозофилы циклин А не играет существенной роли в регуляции S-стадии. Однако, показано, что димер - циклин A/cdkl, предотвращает повторную репликацию ДНК. Так в эмбрионах, мутантных по циклину А, наблюдалась эндорепликация нормальных митотических ядер (Sauer et al., 1995).
