Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние десятилетия существенное внимание уделяется исследованию механизмов симбиоза, в частности анализу взаимодействия эндосимбионтов и их хозяев, так как на основе полученных знаний становится возможным использовать влияние эндосимбионтов на различные функции хозяина. Эффективность симбиоза зависит от генотипа организмов и условий их обитания (Thomas, Blanfbrd, 2003). В естественной среде обитания все организмы подвержены влиянию различных неблагоприятных факторов, и изучение особенностей поведения симбионтов в условиях стресса обеспечивает получение новой информации о процессах, происходящих в симбиотических ассоциациях в природе. Хозяин и симбионт, каждый в отдельности, могут специфически реагировать на изменения условий окружающей среды, а ответ симбиотической ассоциации в целом будет зависеть от взаимодействия партнеров в новых условиях. Можно предположить, что под влиянием экспериментально созданных неблагоприятных факторов среды будет происходить либо активация, либо ингибирование процессов взаимодействия симбионтов, и исследование их организации и динамики в таких условиях позволит выявить дополнительные особенности отношений в системе эндосимбионт-хозяин. До настоящего времени влияние изменений факторов среды на морфологию и взаимоотношения симбионтов, особенно на ультраструктурном уровне, мало изучены и являются активно развивающейся и актуальной областью исследований.
Эндосимбиотические бактерии рода Wolbachia широко распространены среди членистоногих и вызывают у них изменения репродуктивных функций, такие как цитоплазматическая несовместимость, партеногенез, феминизация и андроцид (Werren et al., 2008). Исследование особенностей строения и функциональной роли Wolbachia позволяет выявить механизмы симбиоза на клеточном и организменном уровнях, и найти возможные пути влияния бактерий на численность популяций насекомых-вредителей сельского хозяйства, а также на виды организмов, патогенных для животных и человека.
Одним из удобных модельных объектов для исследования процессов взаимодействия Wolbachia-хозяин является Drosophila melanogaster, цитологические и генетические особенности которой достаточно подробно изучены. В настоящей работе мы использовали этот объект, а в качестве стрессовых факторов среды для симбиотических организмов было выбрано влияние на них повышенной температуры и голодания хозяина.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - провести исследование влияния повышенной температуры и голодания на морфологию клеток яичников и ранних эмбрионов D. melanogaster, симбиотических бактерий Wolbachia в этих клетках, а также на взаимодействие бактерий и хозяина на клеточном и субклеточном уровнях.
Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать и сравнить ультраструктуру клеток яичников и синцитиальных
эмбрионов D. melanogaster, неинфицированных и инфицированных
бактериями Wolbachia, в стандартных лабораторных условиях и после
воздействия повышенной температуры и голодания.
-
Провести сравнительный анализ распределения и морфологии бактерий в клетках яичников и синцитиальных эмбрионах D. melanogaster в стандартных лабораторных условиях и после стрессовых воздействий.
-
Провести сравнительный анализ структурно-функциональных взаимодействий между бактериями и внутриклеточными органеллами хозяина в стандартных лабораторных условиях и после воздействия на D. melanogaster повышенной температуры и голодания.
Научная новизна
С использованием методов световой микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии, а также методов молекулярной биологии, в работе впервые проведен подробный комплексный анализ тонкой структурной организации и взаимодействия симбиотической ассоциации Wolbachia (штамм wMelPop) - D. melanogaster (линия wl 118) в экспериментальных стрессовых условиях. Установлено, что тепловое воздействие и голодание хозяина вызывают различные изменения морфологии Wolbachia штамм wMelPop в цитоплазме синцитиальных эмбрионов и клеток яичников, однако не влияют на их распределение у мух линии wl 118.
Впервые в клетках яичников D. melanogaster wlU8 описаны Wolbachia, контактирующие с электронно-плотными тельцами, которые предположительно являются покоящейся формой бактерий. Их количество увеличивается при голодании мух.
На ультраструктурном уровне продемонстрировано, что, несмотря на изменение морфологии каждого из симбионтов в ответ на стресс, тесные структурно-функциональные контакты бактерий с цитоплазматическими органеллами хозяина сохраняются.
Впервые показано, что присутствие Wolbachia штамм wMelPop увеличивает частоту апоптоза в гермариях яичника D. melanogaster wlll8 по сравнению с неинфицированными мухами.
Практическая значимость работы
Штамм wMelPop в настоящее время считается наиболее патогенным штаммом бактерий Wolbachia, снижающим продолжительность жизни у D. melanogaster и комаров. Результаты нашего исследования, демонстрирующие особенности поведения партнеров симбиотической ассоциации Wolbachia (штамм wMelPop) - D. melanogaster (линия wl 118) в стрессовых условиях, могут быть использованы при построении моделей для поиска путей воздействия с помощью Wolbachia на численность популяций насекомых, являющихся переносчиками заболеваний человека и животных, а также вредителей сельского хозяйства.
Положения, выносимые на защиту:
-
Симбиотические бактерии Wolbachia штамм wMelPop вызывают увеличение апоптоза клеток в контрольной точке гермария яичника D. melanogaster.
-
Присутствие Wolbachia в организме D. melanogaster не влияет на изменение морфологии клеток яичников, происходящие под действием повышенной температуры и голодания.
-
При действии повышенной температуры и голодания характер распределения
Wolbachia штамм wMelPop в синцитиальных эмбрионах и клетках яичников
D. melanogaster сохраняется, однако происходят различные изменения
морфологии бактерий, обусловленные как их дегенерацией, так и адаптацией
к стрессу. 4. В условиях теплового стресса и голодания мух бактерии Wolbachia
продолжают тесно контактировать с эндоплазматическим ретикулумом и
митохондриями в клетках яичников D. melanogaster.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на: XLV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2007); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007); Международной конференции «Развитие эволюционной идеи в биологии, социологии и медицине» (Новосибирск, 2007); V Международной конференции, посвященной биологии Wolbachia (Колимбари, Крит, Греция, 2008); IV съезде микробиологов Узбекистана (Ташкент, Узбекистан, 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина (Москва, 2009); XXIII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2010); 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010); Научной школе-конференции «Успехи в исследовании симбиоза» (Реховот, Израиль, 2010); Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010); на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых отечественных журналах.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Эксперименты по тепловому воздействию на симбионтов проведены совместно с Д.А. Ворониным.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы (157 ссылок). Работа изложена на 161 страницах, содержит 58 рисунков и 5 таблиц.
