Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее время механизмы окислительного стресса привлекают особое внимание исследователей прежде всего благодаря широкому признанию его роли в этиологии не только серьезных патологий, но «нормального» физиологического старения (Fiskum et al., 1999; Murphy et al., 1999; Lenaz., 2001; Dawson and Dawson 2003; Beal., 2004; Bossy-Wetzel et al, 2004; Shen and Cookson, 2004; Андреев и др., 2005). Процесс старения - одна из биологических проблем, постоянно вызывающая огромный интерес. До сих пор наиболее популярной концепцией старения остается свободно-радикальная гипотеза Хармана (Наггаап, 1956), предположившего, что ведущую роль в ослаблении жизненных функций с возрастом играет окисление биополимеров активными формами кислорода (АФК). В дальнейшем было установлено, что при старении действительно возрастает уровень окислительных повреждений ДНК, белков и липидов, что может быть следствием либо увеличения в старости продукции АФК, либо ослабления антиоксидантной защиты, либо пропорционального возрасту организма повреждающего воздействия АФК. По мнению В.П. Скулачева, «...«реостат», регулирующий продолжительность жизни, - это скорость образования АФК внутри митохондрий» (цит. по Скулачев, 2005), поскольку именно эти органеллы являются источником большей части АФК в клетках организма. В норме для предотвращения окислительного стресса в клетке существует несколько степеней защиты, препятствующих генерации избыточного количества АФК митохондриями. Самым последним рубежом защиты клеток, по мнению В.П. Скулачева, является процесс самоликвидации этих органелл, названный, по аналогии с апоптозом, «митоптозом» (Скулачев, 1999).
Еще в 60-х годах минувшего столетия, с развитием ультраструктурных исследований клетки, важную роль в процессах старения стали отводить факторам на субклеточном уровне. Возникла точка зрения, что старение является выражением событий, разыгрывающихся непосредственно в цитоплазме клетки (Policard and Bessis, 1968).
і В настоящее время не вызывает сомнения факт, что митохондрии являются центральным звеном в цепи событий, приводящих к запуску в клетке окислительного стресса. Однако, несмотря на огромное количество работ, посвященных исследованию механизмов окислительного стресса и вызываемого им апоптоза, принципы участия митохондрий в них до сих пор нельзя считать установленными. На каждой из стадий развития этих процессов еще не выявлены многие принципиальные механизмы, не идентифицированы все компоненты сигнальных путей, не прослежена их взаимосвязь и соотношение этих процессов с основными биоэнергетическими функциями митохондрий.
Если вышеизложенная гипотеза о запрограммированности старения верна и в основе старения и связанных с ним патологий лежит повышенная генерация АФК, то оптимальная терапевтическая стратегия должна состоять в повышении мощности систем защиты от АФК. В таком случае защита клеток от митохонд-риальных АФК посредством антиоксидантов должно останавливать или хотя бы замедлять развитие патологий и физиологического старения. В.П. Скулаче-вым был предложен антиоксидант - катионный аналог хинона - SkQl, составленный из пластохинона, проникающего катиона и деканового линкера. Биохимические исследования полученного антиоксиданта показали, что SkQl является мощным антиоксидантом многократного действия. Огромный интерес представляет изучение ультраструктуры клеток и тканей при действии препарата SkQl, поскольку отличительной особенностью митохондрий является четко выраженная взаимосвязь функционального состояния и ультраструктуры этих органелл. Анализ ультраструктуры ткани при исследовании действия митохон-дриального антиоксиданта - SkQl позволяет исследовать наличие патологических изменений клеток, а также доставку данного препарата к искомой мишени - митохондриям.
Цель и задачи исследования
Цель работы состояла в выявлении закономерностей преобразования ультраструктуры митохондриального аппарата клетки при окислительном стрессе, а также в исследовании на ультраструктурном уровне действия препа рата SkQl как митохондриального антноксиданта при развитии обусловленных окислительным стрессом патологий.
Были поставлены следующие задачи исследования:
1. Установить закономерности последовательных преобразований ультра структуры митохондриального аппарата при клеточной гибели, вызванной окислительным стрессом на различных экспериментальных моделях:
• На культурах клеток различных тканей (культуры клеток HeLa, фиб-робластов человека);
• На экспериментальной модели изолированной ткани миокарда;
• В условиях естественно протекающих процессов в ткани миокарда экспериментальных животных (линия SHR-SP).
2. Исследовать на ультраструктурном уровне механизм развития явления митоптоза как последнего рубежа защиты клеток при окислительном стрессе, в модельных экспериментах на клетках культуры HeLa, на экспериментальной модели изолированной ткани миокарда, а также in vivo на летательной мышце D. melanogaster.
3. Установить обусловленные окислительным стрессом возраст-зависимые изменения ультраструктуры митохондрий на уровне целого организма.
4. Исследовать действие митохондриального антноксиданта SkQl непосредственно на морфологию хондриома клеток.
5. Изучить действие SkQl как митохондриального антноксиданта на клеточном уровне, а также на уровне всего организма.
Научная новизна. Проведенные электронно-микроскопические исследования показали, что предложенный В.П. Скулачевым катионныи аналог хинона - SkQl является уникальным по своей эффективности антиоксидантом, действие которого специфически направлено на митохондрии и не осложнено побочным прооксидантным действием. Впервые установлено, что,SkQl полно стью предотвращает развитие апоптоза, вызванного окислительным стрессом, в клетках культуры HeLa. Впервые на ультраструктурном уровне доказано, что SkQl оказывает мощное антиоксидантное действие на уровне целого организма: препарат значительно замедляет развитие возрастных изменений, связанных с окислительным стрессом в летательной мышце мухи D. melanogaster; оказывает защитное действие при развитии обусловленной возрастом патологии - дистрофии сетчатки у крыс линии OXYS и восстанавливает ультраструктуру пигментного эпителия до состояния, характерного для этой ткани у животных без нарушения зрения; оказывает мощное защитное действие на ткань миокарда, останавливая патологические процессы, развивающиеся с возрастом в кардиомиоцитах крыс линии OXYS.
Практическая ценность работы. Результаты работы имеют большое теоретическое значение для понимания роли митохондрий в развитии окислительного стресса, а также вклада процессов, развивающихся на субклеточном уровне, в патогенез старения и связанных с ним заболеваний.
Большой практическое значение работы состоит в подтверждении на ультраструктурном уровне антиоксидаитных свойств нового препарата SkQl, что позволяет использовать это вещество для профилактики и лечения возраст-зависимых патологий, связанных с окислительным стрессом, в практической медицине. Результаты работы могут использоваться в курсах лекций по клеточной биологии, цитологии, а также патофизиологии.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на: 5-ой Пу-щинской конференции молодых ученых «Биология — наука 21 века» (Пущино, 2001); Всероссийском рабочем совещании «Митохондрии в патологии» (Пущино, 2001); XIX Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2002); Третьем съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); II Всероссийской конференции «Клинические и патогенетические проблемы нарушений клеточной энергетики (митохондриальная патология)» (Москва, 2002), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003); 1-ом съезде Общества клеточной биологии (Санкт б Петербург, 2003); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); 29 FEBS Congress (Варшава, Польша, 2004); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005); XXI Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2006); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007); VI European congress International Association of Gerontology and Geriatrics (Санкт-Петербург, 2007); XXII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2008); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 262 страницах, список литературы включает в себя 584 названия. Работа имеет приложение, составленное из электронно-микроскопических фотографий, иллюстрирующих результаты исследований.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом для исследования служили клетки культуры тканей (культура эпителия рака шейки матки человека HeLa, культура подкожных фибробла-стов человека); миоциты желудочков сердца; изолированные митохондрии сердца; летательная мышца ZX melanogaster; пигментный эпителий и миоциты желудочков сердца крыс линии OXYS (получены из Института цитологии и генетики СО РАН).
Клетки культуры получали и растили по стандартным методикам. Для исследования действия окислительного стресса на ультраструктуру клетки культуры обрабатывали перекисью водорода в концентрация 100 мкМ и 150 мкМ в течение суток для клеток культуры HeLa и фибробластов, соответственно. Для индукции апоптоза, клетки культуры Hela обрабатывали в течение 4 и 8 часов TNF-a в концентрации 5 нг/мл в присутствии 1 мкг/мл em. Для индукции митоптоза клетки культуры HeLa обрабатывали миксотиазолом в концентрации 2 мкМ, добавленным вместе с разобщителем (DNP) в концентрации 400мкМ в течение 3 суток.
Эксперименты на ткани сердца проведены на модели изолированных кусочков миокарда, инкубированных в условиях гипоксии, разработанной Л.С. Ягужинским (Сапрунова и др., 2002). Исследование активности цитохром с оксидазы проводили по общепринятой методике (Seligman et al, 1968).
Для исследования действия митохондриального антиоксиданта пласто-хинон-децил-трифенилфосфония (SkQl) клетки культуры HeLa прединкубиро-вали в течение 7 дней с препаратом SkQl в концентрации 20нМ; на корм, потребляемый особями D. melanogaster опытной группы, наносили 1,85 нМ препарата каждые 5 дней; крысы линии OXYS получали препарат ежедневно в течение 68 дней либо с едой в концентрации 250 нмоль/кг, либо в виде глазных капель, концентрация препарата в которых составляла 250 нМ.
В работе использовались стандартные приемы электронной микроскопии (Бирюзова и др., 1963).
