Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ. 5
Научная новизна работы 8
Практическое значение работы 8
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
ФУНКЦИИ АФК 9
Механизмы образования АФК 9
Окислительный стресс 10
Механизмы клеточной защиты от АФК 14
Сигнальная функция АФК 15
РОЛЬ NO И АКТИВНЫХ ФОРМ АЗОТА 19
Химическая биология NO 19
Синтез N0 в организме 20
Цитотоксичность NO и нитрозильный стресс 22
Защитные и сигнальные эффекты NO 24
МИТОХОНДРИИ КАК ИСТОЧНИК И МИШЕНЬ АФК И АФА 27
Взаимодействие АФК и митохондрий 27
Взаимодействие АФА и митохондрий 30
Участие АФК и АФА в апоптозе 39
ВЛИЯНИЕ ИШЕМИИ/РЕПЕРФУЗИИ НА РАЗЛИЧНЫЕ ОРГАНЫ 42
Ишемия/реперфузия сердца 43
Ишемия/реперфузия мозга 46
Ишемия/реперфузия почек 48
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 51
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 65
Образование нитрита изолированными митохондриями 65
Влияние NO-синтазы на функционирование дыхательной цепи 65
Определение образования нитрита в почке при моделировании ишемии/реперфузии..69
Определение трансмембранного потенциала выделенных митохондрий 70
Определение сопряженности митохондрий 72
Оценка трансмембранного потенциала митохондрий клеток витальных срезов почки...73
Оценка продукции АФК в клетках витальных срезов почки 77
Оценка продукции NOb клетках витальных срезов почки 81
Транслокация белков Вахи цитохром с при ишемии/реперфузии 85
Иммуногистохимическое окрашивание белка Вах в клетках почки при ишемии/реперфузии 87
ВЫВОДЫ 91
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 92
Введение к работе
Одним из уникальных свойств организмов и составляющих их клеток является способность адаптироваться к изменяющимся условиям внешней среды, в том числе к дефициту кислорода. Однако условия гипоксии, вызванные ограничением кровотока в органе, служат мощным стрессорным фактором для клеток и могут приводить к необратимым нарушениям метаболизма и структуры клеток, а в конечном счете к нарушению функционирования и повреждениям всего органа или ткани.
Повреждения, вызванные ограничением кровоснабжения, могут происходить во всех без исключения органах при различных хирургических вмешательствах. Вынужденная ишемия становится риск-фактором при трансплантации органов брюшной полости, образовании тромбов, а также при сильно выраженной артериальной гипотензии. Зачастую в естественных (при тромбозе) и всегда в искусственных условиях (при оперативном вмешательстве), за ишемией обычно следует реперфузия и реоксигенация тканей, происходящая при восстановлении кровотока. Такое чередование гипоксии и реоксигенации приводит к состоянию «окислительного стресса», который хорошо описан для многих тканей организма и который является сильно выраженным и в ф значительной мере необратимым деструктивным процессом, ограничивая, таким образом, стратегию вмешательства в жизнедеятельность органа.
Однако, даже в столь неблагоприятных условиях в клетках реализуются различные сигнальные пути, направленные на сохранение их целостности и жизнеспособности. Клеточные структуры имеют достаточный запас прочности и устойчивости к окислительному стрессу, тем не менее, метаболические резервы клетки ограничены и при длительном и интенсивном воздействии компенсаторно-приспособительные реакции сменяются апоптотическими или некротическими сигналами.
В первую очередь в условиях гипоксии в клетках происходит ряд изменений, приводящих к вспышке образования активных форм кислорода (АФК) после восстановления концентрации кислорода. В первую очередь при ограниченной доступности кислорода, особенно в условиях отсутствия кислородных буферных систем (таких как миоглобин), чем невыгодного отличается, скажем, почка от сердца, достаточно быстро происходит восстановление компонентов дыхательной цепи, что при последующей w реоксигенации может приводить к одноэлектронному восстановлению кислорода с образованием супероксидного радикала. Кроме того, в органах подвергшихся ишемии/реперфузии активируются воспалительные процессы, происходит инфильтрация нейтрофилов и макрофагов, вносящих свой вклад в окислительное повреждение ткани за счет выработки АФК системой НАДФН-оксидазы.
Одновременно в клетках активируется синтез оксида азота и других; активных форм азота (АФА), в результате чего к окислительному стрессу добавляется нитрозильное повреждение. Это приводит к повреждению ДНК и нарушениям функционирования белков, в том числе митохондриальных. Взаимодействие N0 с митохондриями имеет особое значение, ввиду наличия митохондриальной формы NOS, активность которой в первую очередь влияет на функционирование самих митохондрий.
В последние годы не подвергается сомнению тот факт, что роль митохондрий в клетке не ограничена производством энергии, поскольку они принимают непосредственное участие в индукции и регуляции апоптотической гибели клеток. В условиях окислительного и нитрозильного стресса, спровоцированного ишемией и реперфузией, функционирование митохондрий приобретает особое значение, поскольку с одной стороны они могут являться одним из источников АФК и АФА, а с другой служат центральным регуляторным и исполнительным звеном программы клеточной гибели.
В то же время эффекты АФК и N0 в клетке не следует рассматривать только с позиции их негативных, повреждающих влияний. Именно действие АФК и оксида азота в сочетании с соответствующим редокс-статусом клетки обуславливает защитные эффекты, входящие в понятие прекондиционирования. Известно, что клетку можно подготовить к резкой смене гипоксии нормоксией, происходящей при ишемии/реперфузии, через адаптацию путем воздействия кратковременных периодов гипоксии, сменяющихся такими же периодами нормоксии, что и является процессом ишемического прекондиционирования. Этот защитный механизм является одной из наиболее развиваемых научных проблем, поскольку представляет собой наиболее совершенное природное устройство адаптации к ишемическому стрессу.
Расшифровка отдельных фрагментов прекондиционирования привела к использованию для защиты от ишемии/реперфузии фармакологического т прекондиционирования, за счет воздействия на те или иные реакции защитного w каскада. Упорядочивание сигнальных путей прекондиционирования выявило ключевой фермент этого каскада - киназу гликоген синтазы-Зр, ассоциированную с митохондриями. Эта киназа отвечает за индукцию неспецифической проницаемости (НП) митохондрий, то есть стратегия защиты заключается в сведении на нет всех возможных механизмов индукции НП. Причем один из защитных механизмов реализуется с участием АФК, когда их продукция не достигает критических, повреждающих величин.
Известно, что митохондриальная НП может индуцироваться, в том числе и от АФК, в то же время одним из последствий индукции НП является избыточная генерация АФК, что обеспечивает каскад усиления генерации митохондриями кислородных радикалов, механизм которого остается неясным. Открытие митохондриальной поры является необходимым элементом апоптотического каскада, что в сочетании с вспышкой генерации АФК и АФА может обеспечивать гибель клеток и повреждения ткани, наблюдаемые при острой ишемии/реперфузии.
Исходя из вышесказанного, становится ясной необходимость детального изучения роли АФК и АФА в развитии ишемического и реперфузионного повреждения клетки, а также механизмов их защитного действия. Центральной) фигурой этих эффектов следует признать митохондрии, и именно исследование их функционирования в условиях ишемии/реперфузии может помочь в составлении целостной картины регуляции выживания или гибели клетки в ходе развития окислительного стресса.
Выбор в качестве модели окислительного стресса почечной ишемии/реперфузии не случаен. Большинство исследований механизмов гипоксии/реоксигенации ведутся на сердечной и мозговой ткани, поскольку повреждения именно этих органов наиболее часто встречаются в медицинской практике. Исследованиям метаболического и функционального состояния почки в условиях ишемии/реперфузии и особенностей в патогенезе ишемического повреждения уделяется значительно меньше внимания. Однако, острая почечная недостаточность, спровоцированная ишемией, а также необходимость хирургических вмешательств делают чрезвычайно востребованным изучение механизмов окислительного повреждения и стратегий защиты от него применительно именно к почечной ткани.
Целью данной работы было исследование функционирования щ митохондриального аппарата клеток почки в условиях ишемии/реперфузии и участие АФК и АФА в развитии повреждения, а также поиск потенциальных защитных механизмов.
Задачи исследования:
1) изучение морфо-функционального состояния митохондрий клеток почки, подвергшейся ишемии/реперфузии
2) оценка изменения продукции N0 в клетках почки в ходе ишемии/реперфузии
3) исследование механизмов генерации N0 в клетках и его влияния на функционирование митохондрий
4) оценка изменения продукции АФК в клетках почки в ходе ишемии/реперфузии
5) изучение действия потенциального защитного агента хлорида лития на выраженность патологических изменений при ишемии/реперфузии почки Научная новизна работы
Было показано нарушение работы митохондриального аппарата клеток почки при ишемии/реперфузии, выражающееся в падении трансмембранного потенциала, индукции НП и набухании митохондрий. Обнаружено усиление продукции АФК и АФА в клетках почки, подвергшейся ишемии/реперфузии, кроме того, показано митохондриальное происхождение АФК и АФА. Выявлено, что основным результатом синтеза N0 митохондриями является подавление дыхания за счет ингибирования цитохромоксидазы электрон-транспортной цепи. Показано, что ишемия/реперфузия почки вызывает запуск в клетках апоптотических сигнальных путей, которые реализуются через транслокацию в митохондрии белка Вах и выход из митохондрии цитохрома с. Подтверждена роль ионов лития как агента фармакологического прекондиционирования, в качестве мишени которого выступает митохондриальная НП. Все основные функциональные изменения митохондрий почки, происходящие при ишемии/реперфузии, уменьшались в результате предобработки LiCI. Практическое значение работы
Данные, полученные в настоящем исследовании, расширяют представление о механизмах ишемического повреждения почки и потенциальных защитных механизмах. Полученный материал может использоваться для разработки фармакологических препаратов, способных уменьшать или предотвращать патологические изменения при острой почечной недостаточности или оперативных вмешательствах.
