Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 14
2.1. Нефрон, образующие его клетки и их маркёры 14
2.1.1. Эндотелиальные клетки клубочка 15
2.1.2. Подоциты 16
2.1.3. Мезангиальные клетки 17
2.1.4. Канальцевый эпителий 18
2.2. Репаративная регенерация 19
2.2.1. Клеточная пролиферация и методы её изучения 19
2.3. Репаративная регенерация почки 21
2.4. Участие неповреждённых клеток почки в репарации нефрона при остром повреждении 22
2.4.1. Регенерация клубочка при остром гломерулонефрите 22
2.4.1.1. Острый гломерулонефрит 23
2.4.1.2. Репаративный ответ клеток клубочка на модели острого гломерулонефрита 23
2.4.2. Регенерация эпителия канальцев при остром повреждении 25
2.4.2.1. Острая почечная недостаточность 25
2.4.2.2. Регенеративный ответ на модели острой почечной недостаточности 26
2.5. Участие неповреждённых клеток почки в репарации нефрона при хроническом повреждении 28
2.5.1. Хронический гломерулонефрит 28
2.5.2. Хроническое повреждение клубочка 31
2.5.2.1. Изменения эндотелиальных клеток 32
2.5.2.2. Изменения мезангиальных клеток 32
2.5.3. Хроническое повреждение эпителия канальцев 33
2.5.3.1. Причины повреждения канальцев 33
2.6. Резидентные стволовые клетки и их участие в регенераторном процессе 35
2.6.1. Свойства резидентных стволовых клеток 35
2.6.2. Резидентная стволовая клетка почки 36
2.6.2.1. Локализация, выделение и участие в регенерации резидентных стволовых клеток почки 37
2.7. Стволовые клетки костного мозга и их участие в регенерации почки 41
2.7.1. Гемопоэтическая стволовая клетка 42
2.7.1.1. Источники получения гемопоэтических стволовых клеток 43
2.7.2. Мезенхимальная стволовая клетка 45
2.7.3. Участие клеток костного мозга в репаративной регенерации почки 45
2.7.3.1. Гемопоэтические стволовые клетки в восстановлении канальцевого эпителия после повреждения 46
2.7.3.2. Мезенхимальные стволовые клетки в восстановлении канальцевого эпителия после повреждения 47
2.7.3.3. Стволовые клетки костного мозга в восстановлении клеток клубочка 48
3. Материалы и методы исследования 54
3.1. Объекты исследования 55
3.1.1. Характеристика нефробиоптатов 55
3.1.1.1. Морфологическое исследование нефробиоптатов больных хроническим гломерулонефритом 55
3.1.2. Лабораторные животные 56
3.1.2.1. Забор пуповинной крови 57
3.1.2.2. Выделение мононуклеаров путем седиментации в градиенте плотности фиколла 57
3.1.2.3. Подсчёт количества мононуклеаров и определение их жизнеспособности 58
3.1.2.4. Забор материала и приготовление гистологических срезов тканей 58
3.2. Гистологические и иммуногистохимические методы исследования 59
3.2.1. Депарафинирование и регидратация парафиновых срезов 59
3.2.2. Окрашивание по Ван-Гизону 59
3.2.3. Окрашивание парафиновых срезов биоптатов почек больных хроническим гломерулонефритом антителами к PCNA и а-ГМА 59
3.2.4. Окрашивание парафиновых срезов биоптатов почек больных хроническим гломерулонефритом антителами к CD34HCD31 60
3.2.5. Окрашивание парафиновых срезов почки крысы антителами KHLA-ABC 61
3.3. Оценка выраженности экспрессии CD34 и CD31 клетками клубочка 61
4. Результаты исследования и их обсуждение 63
4.1. Морфологический анализ биоптатов почек больных хроническим гломерулонефритом 63
4.1.1. Экспрессия CD34 и CD31 в нефробиоптатах больных хроническим гломерулонефритом 64
4.1.2. Морфологические проявления гломерулонефрита 69
4.1.2.1. Изучение присутствия CD34(+)/CD31(-)-клеток в клубочках при различных значениях индекса воспалительной активности гломерулонефрита 70
4.1.2.2. Изучение присутствия CD34(+)/CD31 (-)-клеток в клубочках при различных значениях индекса склероза клубочков 71
4.1.2.3. Изучение изменения индекса склероза клубочков при различных значениях индекса воспалительной активности гломерулонефрита 72
4.1.2.4. Изучение изменения уровня мочевины крови больных хроническим гломерулонефритом при различных значениях индекса воспалительной активности заболевания 74
4.1.3. Изучение пролиферативной активности и миофибробластической трансдифференцировки клеток клубочков у больных хроническим гломерулонефритом 75
4.1.3.1. Экспрессия PCNA в нефробиоптатах больных хроническим гломерулонефритом 76
4.1.3.2. Изучение пролиферативной активности клеток клубочков при различных значениях индекса воспалительной активности гломерулонефрита 76
4.1.3.3 Изучение пролиферативной активности клеток клубочков при различных значениях индекса склероза клубочков 80
4.1.3.4. Экспрессия а-ГМА в нефробиоптатах больных хроническим гломерулонефритом 81
4.1.4.4. Изучение миофибробластической трансдифференцировки клеток клубочков при различных значениях индекса воспалительной активности гломерулонефрита 81
4.1.3.5, Изучение миофибробластической трансдифференцировки клеток клубочков при различных значениях индекса склероза клубочков 86
4.1.4. Сопоставление появления CD34(+)/CD31(-)-KneTOK в клубочках с пролиферацией и миофибробластической трансдифференцировкой клеток клубочков 88
4.2. Изучение миграции и распределения трансплантированных мононуклеаров пуповиннои крови человека в интакных почках крыс 91
Заключение 100
Выводы 106
Библиографический список использованной литературы 107
- Участие неповреждённых клеток почки в репарации нефрона при остром повреждении
- Резидентные стволовые клетки и их участие в регенераторном процессе
- Мезенхимальные стволовые клетки в восстановлении канальцевого эпителия после повреждения
- Гистологические и иммуногистохимические методы исследования
Введение к работе
Актуальность темы
Изучение регенерации органов и тканей остаётся одним из самых значимых и актуальных направлений в современной медицине и биологии. В первую очередь, это обусловлено потребностью практической медицины, так как для разработки новых методов лечения просто необходимы фундаментальные знания относительно активации и взаимодействия различных клеточных типов органа в норме и при патологии.
В рамках этого вопроса недостаточно изученными остаются клеточные основы патогенеза различных заболеваний почки, в частности хронического гломерулонефрита (ХГН).
Проблема ХГН занимает одно из центральных мест в нефрологии. Актуальность этого заболевания обусловлена его высокой распространенностью (3-4 место среди всех заболеваний почек [Рябов С.И., 2000]), поражением в основном работоспособной части населения и неизбежным развитием хронической почечной недостаточности [Ермоленко В.М., 2000]. Кроме того, крайне проблематичной остается терапия ХГН. Так, проводимое медикаментозное лечение мало эффективно и сопряжено с многочисленными побочными действиями, гемодиализ является лишь методом паллиативной терапии, а трансплантация почки по ряду причин часто невозможна. В связи с этим необходимым является поиск новых методов лечения, одним из которых может стать клеточная терапия с использованием стволовых клеток.
Во всем мире ведётся интенсивное изучение участия стволовых клеток в регенерации органов и тканей [Almeida-Porada G., 2010; Jeganathan V., 2010; Kumar A.H., 2010; Roomans G.M., 2010; Tsivitse S., 2010; Ulicna M., 2010], и возможности применения этих клеток для патогенетической терапии различных заболеваний, в том числе заболеваний почек [Zubko R., 2009].
Существует мнение, что, подобно другим органам, репаративная регенерация почки происходит за счет трёх основных источников [Anglani F., 2004]: миграции и пролиферации неповреждённых дифференцированных клеток; активации и дифференцировки резидентных стволовых клеток; привлечения и дифференцировки циркулирующих стволовых клеток из костного мозга. Процесс миграции и пролиферации неповрежденных клеток самой почки является основным и наиболее изученным механизмом регенерации [Iruela-Arispe L., 1995; Haseley L. A., 1999; El-Nahas A. M, 2003]. Но, к сожалению, полученные фундаментальные знания мало помогли в разработке эффективной патогенетической терапии ХГН. Поэтому огромные надежды возлагаются на использование экзогенных стволовых клеток, а особенно – гемопоэтических стволовых клеток – для терапии ХГН.
На сегодняшний день уже показано, что трансплантированные стволовые клетки костного мозга участвуют в восстановлении клеток клубочков и канальцев после острого повреждения почки [Kale S., 2003; Lin F., 2003; Lin F., 2005; Fang T.C., 2005]. К сожалению, ничего не известно об участии собственных гемопоэтических стволовых клеток в регенерации клубочков при ХГН у человека. В тоже время, говорить о целесообразности трансплантации этих клеток при ХГН можно будет только после получения ответа именно на этот вопрос.
Кроме того, перед тем как трансплантировать гемопоэтические стволовые клетки с целью лечения заболеваний почек, необходимо знать их распределение в неповрежденном органе, а именно – возможность миграции введенных клеток в интактную почку, пути этой миграции и дальнейшей дифференцировки в почке реципиента.
Цель и задачи исследования
Целью данного исследования явилось изучить возможность участия гемопоэтических CD34(+)-клеток в процессах регенерации нефронов у больных хроническим гломерулонефритом, а также хоуминг и дифференцировку мононуклеаров пуповинной крови человека в интактных почках крыс.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:
1. На основании иммуногистохимического анализа установить, участвуют ли гемопоэтические CD34(+)-клетки в регенерации нефронов больных хроническим гломерулонефритом;
2. Изучить зависимость появления CD34(+)-клеток в клубочках почки от степени развития морфологических проявлений гломерулонефрита (воспалительной активности заболевания и выраженности склероза клубочков);
3. Проанализировать пролиферативную активность и миофибробластическую трансдифференцировку клеток клубочков и их изменения в зависимости от степени развития морфологических проявлений гломерулонефрита;
4. Провести сравнительный анализ участия гемопоэтических CD34(+)-клеток и резидентных клеток клубочка (пролиферирующих клеток, миофибробластов) в регенерации клубочка при хроническом гломерулонефрите;
5. На основании иммуногистохимического исследования изучить миграцию, распределение и пути дифференцировки трансплантированных мононуклеаров пуповинной крови человека в почке здоровой крысы.
Объект и методы исследования
Изучение участия стволовых клеток в процессах репаративной регенерации почки проводили на 64 нефробиопсиях больных с различными клинико-морфологическими формами течения первичного гломерулонефрита.
Изучение хоуминга стволовых клеток и их распределения в интактной почке проводили на 15 белых беспородных крысах, которым в хвостовую вену вводили фракцию мононуклеаров пуповинной крови человека. Для получения результатов исследования был использован иммуногистохимический метод, позволяющий с помощью специфических маркёров судить о наличии в почках клеток с определённым фенотипом, о пролиферации и миофибробластической трансдифференцировке клеток почечных клубочков.
Достоверность полученных данных и их научная новизна
Достоверность полученных данных достигнута использованием достаточного и представительного объёма экспериментальных исследований, конкретной постановкой и решением поставленных задач с использованием математического анализа и статистического метода. Достоверность различий между результатами оценивали по t-критерию Стьюдента. Оценку связи между качественными непараметрическими признаками проводили с использованием критерия «хи-квадрат».
Автор видит новизну полученных результатов в том, что впервые:
иммуногистохимическими методами показано увеличение в клубочках больных ХГН количества CD34(+)-клеток. Было установлено, что появление этих клеток непосредственно зависит от степени морфологических проявлений заболевания. Кроме того, проведён анализ зависимости наличия CD34(+)/CD31(-)-клеток от изменений пролиферативной активности и миофибробластической трансдифференцировки клеток клубочков. На основании полученных данных впервые установлено, что чаще всего CD34(+)/CD31(-)-клетки обнаруживаются в нефробиоптатах с индексом воспалительной активности, не превышающим 4-х баллов и индексом склероза клубочков, равным 1-2 баллам. Эта стадия гломерулонефрита должна рассматриваться как переломный момент в течение заболевания, когда восстановление клубочковой структуры и функции почек ещё может произойти. Возможно, это связано с тем, что в данный период вклад гемопоэтических стволовых клеток в процесс регенерации клубочков максимален, а склеротические изменения в них незначительны.
выявлено, что мононуклеары пуповинной крови человека, трансплантированные в системный кровоток крыс, мигрируют в неповреждённую почку и встраиваются в эпителиальную выстилку дистальных канальцев нефрона.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты работы расширяют и углубляют представления о регенерации почки человека. Так, нами установлено, что при ХГН восстановление происходит не только за счёт эндогенного резерва почки, но и гемопоэтических CD34(+)-клеток. Совокупность полученных данных позволила определить критический период в развитии хронического гломерулонефрита с точки зрения прогноза заболевания, которым является индекс воспалительной активности от 1 до 4 баллов и индекс склероза клубочков равный 1-2 баллам. Именно в этот момент в клубочках чаще определялись CD34(+)-клетки, не экспрессирующие CD31. Полученные данные имеют большое практическое значение, так как могут быть использованы для диагностики и определения прогноза течения заболевания у больных гломерулонефритом.
Проведенный эксперимент способствовал обнаружению новых фактов о способности мононуклеаров пуповинной крови человека, трансплантированных в кровоток здоровой крысы, мигрировать в почку и заселять её. На основании того, что клетки человека обнаружены среди эпителия дистальных канальцев, было сделано предположение, что именно дистальные канальцы могут служить “нишей” прогениторных клеток почки.
Безусловно, полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения проблемы регенерации почки в норме и при повреждении, в разработке методов лечения хронических заболеваний почки с использованием стволовых клеток. Кроме того, полученные данные должны быть использованы в учебном процессе при подготовке специалистов медико-биологического профиля.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Наличие CD34(+)/CD31(-)-клеток в клубочках почек больных хроническим гломерулонефритом является подтверждением гипотезы об участии прогениторных кроветворных клеток в регенерации органов, в частности почки, и это участие максимально при минимальной и умеренной воспалительной активности заболевания и минимальном склерозе клубочков. При более выраженном воспалении и склерозе регенерация происходит за счёт пролиферации и миофибробластической трансдифференцировки клеток клубочка.
2. Мононуклеары пуповинной крови человека, трансплантированные в системный кровоток крыс, мигрируют в неповреждённую почку и встраиваются в эпителиальную выстилку дистальных канальцев нефрона.
Сведения об апробации результатов диссертации
Основные результаты диссертационной работы доложены на 77-й Всероссийской студенческой научной конференции, посвящённой 125-летию со дня рождения профессора М.Н. Чебоксарова (Казань, 2003); XIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Молодые учёные в медицине” (Казань, 2008), XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Молодые учёные в медицине” (Казань, 2009), и XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Молодые учёные в медицине” ( Казань, 2010).
Сведения о публикациях по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 1 статья в ведущем научном рецензируемом журнале, рекомендованном Высшей аттестационной комиссией для опубликования основных результатов диссертаций. Общий объём публикаций – 1,6 условно печатных листа, в том числе авторский вклад – 0,8 условно печатных листа.
Личный вклад соискателя
Приведённые в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы. Соискателем составлен план, поставлены задачи, определены этапы исследования. Автор провёл подбор и анализ литературы, определил и применил наиболее адекватные условия проведения эксперимента. Автор выделял фракцию мононуклеаров из пуповинной крови человека и участвовал во введении этих клеток в хвостовую вену крыс. Им лично проведены забой животных, забор материала (почки) и его последующая заливка в парафин; нарезаны парафиновые срезы. В ходе исследования соискатель провел 348 иммуногистохимических окрашивания срезов, с которых им было получено 407 фотографий. Статистическая обработка, теоретическое обобщение материалов исследования, оформление, публикации результатов исследования, формулирование выводов и рекомендаций также проведены лично диссертантом.
Внедрение результатов работы
Результаты проведённого исследования внедрены в учебный процесс на кафедре нормальной анатомии, кафедре гистологии, включены в основной курс (рабочая программа) дополнительной образовательной программы “Молекулярная и клеточная медицина” ГОУ ВПО “Казанский ГМУ Росздрава”. Иммуногистохимическая оценка к маркёрам CD31, CD34, PCNA, -ГМА при комплексном исследовании ХГН внедрена в практику ГМУ “Детская республиканская клиническая больница” (г. Казань).
Структура и объем диссертации
Участие неповреждённых клеток почки в репарации нефрона при остром повреждении
Гломерулонефрит (ГН) - это группа заболеваний почек, при которых первичное и основное повреждение происходит в клубочках, а не в канальцах, сосудах или интерстиции. В развитии ГН общепризнанной является концепция иммунного воспаления [10, 29]. Считают, что иммунные процессы определяют не только возникновение, но переход острых форм ГН в хронические. В зависимости от механизма образования иммунных комплексов, выделяют два иммунопатологических варианта развития ГН. В одном случае иммунные комплексы образуются при взаимодействии аутоантител с аутоантигенами, являющимися белками самой почечной ткани. Такие комплексы располагаются непосредственно на базальной мембране, вызывая её повреждение [29]. В другом случае образование иммунных комплексов происходит в крови вследствие связывания антител с внепочечными и внеклубочковыми антигенами. Эти иммунные комплексы вначале циркулируют в крови, а затем осаждаются на базальных мембранах клубочковых капилляров или в мезангии [29]. Кроме того, в патогенезе ГН большое внимание уделяется реакциям клеточного иммунитета с участием В- и Т-лимфоцитов, что подтверждается возможностью развития экспериментального нефрита у здорового животного (кролика) путём введения ему в кровь сыворотки крови животного, страдающего ГН [15, 28]. ГН может протекать в острой и хронической формах. Острый гломерулонефрит (ОГН) - это наиболее частое диффузное воспалительное заболевание почек с преимущественным поражением клубочков.
Основным этиологическим фактором развития ОГН являются различные формы стрептококковой инфекции [28, 32]. Изменения в почках при остром постстрептококковом ГН обусловлены отложением в капиллярах клубочков гетерологичных иммунных комплексов [25]. В патологический процесс вовлекаются все клубочки. Они увеличены, капиллярные петли значительно расширены и облитерированны набухшими и пролиферирующими эндотелиальными и мезангиальными клетками, мезангии инфильтрирован лейкоцитами. В целом морфологическая картина данного заболевания оценивается как эндокапиллярный пролиферативный ГН, в котором выделяют несколько форм. Если в капиллярах клубочка преобладают лейкоциты - это экссудативная форма; при сочетании пролиферации клеток клубочка с лейкоцитарной инфильтрацией - экссудативно-пролиферативная, в случае преобладания клеточной пролиферации - пролиферативная форма ОГН [25,32]. Классической моделью для изучения ОГН является antihy-1 гломерулонефрит крыс [177]. Thy-1 - гликопротеин, присутствующий на клетках тимуса, головного мозга, а также мезангиальных клетках крыс [122]. Однократное внутривенное введение антиhy антител крысам приводит к развитию острого комплемент-опосредованного ГН [177], который имеет большое сходство с острым мезангиопролиферативным ГН человека. Особенностью данной модели является спонтанное выздоровление с практически полным восстановлением клубочков [127]. При взаимодействии введенных антиhy-1-антител с Thy-рецепторами на поверхности мезангиальных клеток, происходит образование иммунных комплексов и развитие тотального (более 95%) мезангиолизиса. Гломерулярные капиллярные петли теряют опору и расширяются. Происходит активация подоцитов, старающихся компенсаторно предотвратить дальнейшее перерастяжение капилляров [177].
Возможно, поэтому эндотелиальная выстилка в большинстве гломерул остаётся неповреждённой, и только у 8% клубочков формируются микроаневризмы с повреждением эндотелиальных клеток и подоцитов на пятый день заболевания [176]. В это же время наблюдается 20-кратное увеличение числа клеток почечного клубочка [177, 181], большинством из которых являются делящиеся мезангиоциты. Восстановление мезангиума начинается сразу же после повреждения и происходит за счёт активации, миграции и пролиферации сохранившихся неповреждённых мезангиальных клеток клубочка и юкстагломерулярного аппарата [78, 94, 141, 199]. Эти процессы запускают цитокины (IL-1, IL-6, IL-8, фактор некроза опухоли-а (TNF-а), PDGF, моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1), фактор роста фибробластов-р (p-FGF)), выделяющиеся из повреждённых мезангиальных клеток. Активированные мезангиальные клетки для восстановления повреждённого мезангиального матрикса значительно усиливают продукцию его физиологических компонентов (коллаген IV, ламинин, гепаран-сульфат) [214]. Кроме того, мезангиальные клетки в ответ на PDGF высвобождают эндотелиальные факторы роста, необходимые для регенерации эндотелия [182]. Регулятором данного процесса, является сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) [232], количество которого уже на ранних стадиях повреждения резко возрастает за счёт повышения его синтеза подоцитами, активированными мезангиальными клетками, инфильтрирующими лейкоцитами [232]. Таким образом, пролиферация эндотелиальных клеток происходит вместе с пролиферацией мезангиальных клеток.
Делящиеся эндотелиоциты сосредотачиваются в клубочках с микроаневризмами вокруг пролиферирующих мезангиальных клеток и к концу первой недели их количество увеличивается в 7-9 раз [176]. Хотя к 14-му дню пролиферация и мезангиальных и гломерулярных эндотелиальных клеток прекращается, в клубочке отмечается выраженная гиперклеточность и значительное расширение экстрацеллюлярного матрикса [176]. В тоже время, начиная с 7-го дня от начала заболевания, происходит активация апоптоза [49] и ремоделирования матрикса [209] - двух основных гомеостатических процессов, направленных на восстановление гломерулярной структуры и функции [176, 204]. Ремоделирование матрикса осуществляется матриксными металлопротеиназами (коллагеназа IV), синтезируемыми активированными мезангиальными клетками в ответ на ИЛ-1, PDGF, трансформирующий фактор роста-р (TGF-p) [209]. В результате, к концу 6-й недели за счёт тончайшего баланса между клеточной пролиферацией резидентных гломерулярных клеток и их апоптозом, а также синтезом компонентов экстрацеллюлярного матрикса и мезангиальных металлопротеиназ, происходит полное структурное и функциональное восстановление клубочка [94, 136].
Резидентные стволовые клетки и их участие в регенераторном процессе
Стволовая клетка - это незрелая клетка, способная к физиологическому самообновлению, и дающая начало потомкам, развивающимся в специализированные клеточные типы [155, 161, 234]. Различают несколько типов стволовых клеток, и прежде всего -эмбриональные и взрослые стволовые клетки. Самой ранней стволовой клеткой является тотипотентная зигота, из которой формируются все зародышевые и внезародышевые ткани [46]. По мере развития зиготы клетки начинают специализироваться и формируют в бластоцисте кластер клеток - внутреннюю клеточную массу, или эмбриональные стволовые клетки. Эмбриональные клетки являются плюрипотентными, т.е. способными дифференцироваться в клетки трёх зародышевых листков, из которых образуются все клеточные типы взрослого организм. Из этого следует, что клетки внутренней клеточной массы - это родоначальницы резидентных стволовых клеток всех органов [46]. О существовании взрослых (тканевых, резидентных) стволовых клеток в таких органах, как скелетная мышца, костный мозг, желудочно-кишечный тракт, роговица, где они необходимы для непрерывного тканеобразования, известно уже давно. По классическим представлениям, для взрослых стволовых клеток любого органа характерны следующие свойства [48]: 1. Высокий пролиферативный потенциал и интенсивная способность к самоподдержанию - свойства, необходимые для осуществления гомеостаза ткани, к которой они принадлежат; 2. Способность к мультилинейной дифференцировке в пределах своей ткани. Например: ГСК образуют все виды клеток крови [61, 87]; стволовые клетки нервной ткани дают начало нейронам, астроцитам и олигодендроцитам [104] и т.д.; мезенхимальные стволовые клетки могут дифференцироваться в фибробласты, остеобласты и жировые клетки [111]. 3. Способность при трансплантации восстанавливать повреждённую ткань, из которой они происходят [203, 219].
Это убедительно продемонстрировано для ГСК [219]. 4. Ответственность за образование дифференцированных потомков соответствующей ткани в физиологических условиях при отсутствии повреждения [210, 233]. Поскольку закладка резидентных стволовых клеток происходит во время формирования органов, остановим своё внимание на развитии почки. Как известно, образование метанефрогенной почки происходит за счёт реципрокных индуцированных событий между двумя разными почечными зачатками - выростом вольфова протока (мочевой почкой) и метанефрогенной мезенхимой [79]. Мочевая почка индуцирует эпителиально-мезенхимальную трансдифференцировку метанефрогенной мезенхимы в эпителиальные клетки нефрона (от капсулы до дистальных канальцев). В тоже время, мезенхимальные клетки индуцируют ветвление мочевой почки (мезенхимально-эпителиальную трансдифференцировку) и формирование собирательных трубочек, чашечно-лоханочной системы и мочеточников [46]. Таким образом, почка развивается из двух зачатков. Возникает абсолютно логичный вопрос: из какого зачатка будет происходить стволовая клетка, и каким клеточным типам будет давать начало? Или для каждого зачатка будет существовать отдельная стволовая клетка? В развитии нефрона принимают участие как минимум 5 типов клеток предшественниц: метанефрогенные мезенхимальные эпителиальные клетки предшественницы; ангиобласты, или эндотелиальные клетки предшественницы; гладкомышечные предшественники; стромальные клетки предшественницы и клетки мочевой почки, которые образуют в конечном итоге 26 клеточных типов взрослой почки [139]. На сегодняшний день нет данных о наличии почечной стволовой клетки в пресоматической и промежуточной мезодерме, но есть экспериментальные доказательства наличия стволовой эпителиальной клетки в метанефрогенной мезенхиме [160].
В начале 90-х годов прошлого века Бурров и Вильсон описали культуру клеток нефрогенной зоны развивающейся почки человека, которые они назвали нефробластами [65]. Затем Барасер с коллегами сумели показать, что в метанефросе существует клеточный тип, который может образовывать все эпителиальные элементы нефрона [160]. Для этого был использован ретровирус, который подсаживали в стволовую клетку, а затем он был выявлен во всех отделах нефрона, а также в собирательных трубочках [160]. Что касается ангиобластов, то раньше считалось, что эндотелиальные клетки почки имеют экзогенное происхождение, т.к. в выращенных in vitro почках гломерулы не развиваются, либо они формируются при культивировании метанефроса на мембранах аллантоиса [46]. Позднее Абрагамсон с коллегами выращенную in vitro почку трансплантировали в переднюю камеру глаза, и наблюдали развитие эндотелиальных клеток (включая гломерулярные капилляры) [174]. Образованные эндотелиальные клетки имели почечное происхождение, что позволило предположить существование почечных ангиобластов. Однако до сих пор не понятно, имеют ли эндотелиальные клетки-предшественницы самостоятельное метанефрогенное происхождение. Ещё меньше известно о предшественниках почечных сосудистых гладкомышечных и мезангиальных клеток, появляющихся в нефроне позднее всех других клеток. В настоящее время нет однозначных данных о локализации взрослых стволовых клеток в почке, хотя поиски этой клеточной популяции ведутся достаточно активно.
Считается, что в органах стволовые клетки располагаются в специальных "нишах", строма которых получает хорошую васкуляризацию, и которые защищают клетки от внешних воздействий [145]. Так, стволовые клетки кожи локализованы в луковице волосяного фолликула, глубоко в дерме, и окружены пигментными клетками, защищающими их от УФ излучения [46]. Стволовые клетки роговицы располагаются в хорошо кровоснабжающемся лимбе и окружены пигментными клетками [46]. Оливер с коллегами выдвинули предположение, что "нишей" взрослых стволовых клеток почки является почечный сосочек [218]. К такому заключению они пришли на основании результатов экспериментов, в которых нуклеотидную метку вводили 3-х дневным крысам и мышам, у которых активно продолжался нефрогенез, и большое количество клеток пролиферировало. Спустя два месяца с помощью флюоресцентной микроскопии Вгёи(+)-клетки выявляли в почечном сосочке. BrdU способен накапливаться в ДНК только медленно делящихся клеток, к которым и относятся стволовые клетки [46]. Было показано, что после ишемического повреждения количество меченых клеток значительно снижается [218]. Это связано с активацией пролиферативного ответа, и миграцией этих клеток в зону повреждения, что необходимо для восстановления поврежденных структур. Культивирование Вгсіи(+)-клеток показало, что они обладают характеристиками почечных стволовых клеток: экспрессируют эпителиальные и мезенхимальные маркёры, формируют клеточные сферы и обладают некоторой пластичностью со способностью к дифференцировке в нейроны при определенных условиях среды [218]. Используя этот же метод, группа японских учёных выделили BrdU(+)-клетки иной локализации [154]. Семинедельные мыши каждый день в течение недели получали BrdU. Спустя 2 недели после последней инъекции, клетки, содержащие метку, были обнаружены в проксимальных канальцах и названы прогениторно-подобными канальцевыми клетками [154]. После ишемического повреждения BrdU(+)-K)ieTKH начинали активно пролиферировать, приобретали черты эпителиальных клеток (вместо виментина экспрессировали Е-кадгерин) и
Мезенхимальные стволовые клетки в восстановлении канальцевого эпителия после повреждения
На сегодняшний день существует ряд экспериментальных работ, говорящих о способности МСК участвовать в восстановлении почки после повреждения [45, 80, 102, 164, 169]. Так Мориджи и другие показали, что у мышей, которым трансплантантировали МСК после цисплатин-индуцированной острой почечной недостаточности, наблюдалось усиление канальцевой регенерации и улучшение функции почек [164]. Так как вновь образующиеся эпителиальные клетки почки содержали Y-хромосому (МСК вводили от мышей-самцов мышам-самкам), авторы предположили, что наблюдаемый ренопротективный эффект обусловлен дифференцировкой МСК в почечные эпителиальные клетки [164]. Подобное улучшение почечной морфологии и функции наблюдали и исследователи под руководством Тогеля, когда крысам с острой почечной недостаточностью, вызванной временной ишемией, вводили в кровоток МСК [45]. Но они показали, что ренопротективный эффект осуществляется не посредством трансдифференцировки введённых клеток, а за счёт описанного ранее паракринного воздействия со стороны МСК [102]. В почке паракринное воздействие МСК проявлялось снижением экспрессии провоспалительных (II lb, TNF-a, гамма-интерферон) и повышением количества антивоспалительных цитокинов (интерлейкин 10 (IL-10), bFGF, TGF-а и т.д.) [102]. Дюффилд с коллегами также подтвердили отсутствие трансдифференцировки МСК в клетки канальцевого эпителия [80]. Аналогичное исследование Фанга с коллегами было направлено на определение того, какая именно фракция костного мозга участвует в восстановление канальцевого эпителия. Подобно многим, они обнаружили, что МСК не участвуют в этом процессе и что восстановление канальцевого эпителия происходит за счёт ГСК [95]. Итак, на основании данных полученных в различных лабораториях, можно сделать вывод, что процесс репарации эпителия канальцев после острого ишемического повреждения происходит в основном за счёт выживших клеток, а вклад в этот процесс клеток костного мозга значительно меньше. Это можно объяснить тем, что при остром повреждении действие повреждающего фактора непродолжительно. Почке достаточно своего собственного резерва -миграции и пролиферации неповреждённых клеток канальцев и активации резидентных клеток-предшественниц для восстановления эпителиальной выстилки канальцев. Логично было бы предположить, что в условия хронического повреждения канальцев происходит активация дополнительных регенераторных механизмов, а именно миграция костномозговых столовых клеток из циркуляции.
Ведь в первую очередь процесс регенерации направлен на восстановление нормальной структуры, а не на развитие соединительнотканного рубца. Но, к сожалению, подобные исследования в литературе не описаны. В тоже время, нельзя исключить, что клетки костного мозга при трансплантации оказывают паракринное воздействие на процессы восстановления почки. К сожалению, исследования по участию клеток костного мозга в регенерации почки в основном были направлены на изучение восстановления канальцевого аппарата, и значительно меньшее внимание уделялось их роли в репарации клубочка. Было показано, что клетки костного мозга принимают активное участие в восстановлении мезангиальных клеток. Впервые это продемонстрировала группа исследователей под руководством Имасава [217]. Для этого они создавали химерных мышей, костный мозг которых экспрессировал зеленый флуоресцентный протеин (GFP). Через две недели после трансплантации клеток костного мозга в гломерулах были обнаружены GFP-позитивные клетки, которые одновременно коэкспрессировали десмин [217]. Кроме того, in vitro эти клетки, подобно мезангиальным клеткам, сокращались при стимуляции ангиотензином II [217]. Используя химерных крыс, Ито с коллегами показали [56], что при остром антиhyl-гломерулонефрите 2% мезангиальных клеток имели костномозговое происхождение. В тоже время авторы не смогли продемонстрировать восстановление гломерулярного эндотелия за счёт клеток костного мозга [56]. В дальнейшем Масуа с коллегами показали [112], что предшественниками мезангиальных клеток являются ГСК костного мозга. Для этого . выделенную и культивированную популяцию Lin(-)Sca-l(+)c-kit(+)CD34(-) rCK, меченую усиленным зеленым флуоресцентным белком (EGFP), они вводили летально облучённым мышам и спустя 2 месяца обнаруживали EGFP(+)-raieTKH в гломерулах. Клетки, экспрессирующие EGFP, обладали морфологическими характеристиками мезангиальных клеток и сокращались в ответ на ангиотензин II [112]. Также на модели острого антиhyl-гломерулонфрита Кунтер с коллегами [223] сумели показать, что введение МСК ведёт к 2-х кратному снижению мезангиолизиса, усилению пролиферативного ответа и более быстрому восстановлению мезангиума.
При этом не удалось показать, что восстановление клубочка происходило за счёт трансдифференцировки МСК, т.к. не было обнаружено ни мезангиальных, ни эндотелиальных клеток донорского происхождения [223]. Кроме того, in vitro МСК продуцировали большое количество VEGF и TGF-b 1, что вместе с описанными выше данными позволяет сделать вывод, что МСК участвуют в процессах регенерации почки за счёт паракринных воздействий [223]. В работе под руководством Рукмакера впервые было показано, что после острого анти-Тпу-1-гломерулонефрита клетки костного мозга участвуют в восстановлении не только мезангиальных клеток, но и гломерулярных эндотелиальных клеток [58]. По всей вероятности, различия в полученных результатах у Рукмакера [58] и Ито [56] связаны со степенью эндотелиального повреждения при моделировании острого гломерулонефрита. Весьма неоднозначна работа Икараши и его коллег [53]. Подобно многим другим они создавали крыс-химер, костный мозг которых экспрессировал EGFP. Крысы были поделены на 2 группы: на крысах 1 группы моделировали острый антиhyl-гломерулонефрит, а на крысах 2 группы - прогрессирующий антиhyl-гломерулонефрит. С помощью иммуногистохимического окрашивания было показано, что в почках крыс из обеих групп имеются клетки, коэкспрессирующие EGFP с маркёрами эндотелиальных клеток (РЕСАМ-1) и EGFP с маркёром мезангиальных клеток (ОХ-7) [53]. Причём количество EGFP(+)PECAM-l(+)-KneTOK значительно превосходило количество EGFP(+)OX-7(+)-KneTOK. На основании полученных данных логично сделать вывод, что клетки костного мозга участвуют в восстановлении эндотелиальных и мезангиальных клеток при остром и прогрессирующем ГН. Результатом же данного исследования стало то, что костномозговые эндотелиальные клетки-предшественницы (ЭКП) участвуют в восстановлении гломерулярного эндотелия [53]. Мы считаем, что делать такой вывод не корректно. Для того чтобы сказать, что ЭКП участвуют в восстановлении мезангиальных и эндотелиальных клеток, необходимо изучать поведение клеток именно этой фракции, а не цельного костного мозга. Эндотелиальные клетки-предшественницы - это очень небольшая популяция клеток, происходящая из ГСК и часто рассматриваемая как ещё
Гистологические и иммуногистохимические методы исследования
Депарафинирование парафиновых срезов проводили в двух сменах толуола (экспозиция 5 мин), двух сменах абсолютного этанола (экспозиция 5 мин) и двух сменах 96% этанола (экспозиция 5 мин). Из второй смены 96%) этанола препараты переносили в дистиллированную воду на 5-10 мин для регидратации [12]. Парафиновые срезы нефробиоптатов больных ГН окрашивали гематоксилином Вейгерта, выдерживая в нём 3-5 минут, после чего прополаскивали в двух порциях водопроводной воды. Далее окрашивали в пикрофуксине 2-3 минуны и снова прополаскивали в воде в течение 15 сек. Проводили через 96 спирт, повторно наливая, и выдерживали в нём 3 минуты. После этого, просветляли в карбол-ксилоле, обрабатывали ксилолом и заключали в бальзам [12]. Парафиновые срезы биоптатов почек больных ГН окрашивали антителами к PCNA (клон PC 10, DAKO, Denmark; разведение 1:100), к а-ГМА (клон 1А4, DAKO, Denmark; разведение 1:50). Окрашивание проводили стрептавидин-биотиновым методом [9]. После депарафинирования и регидратации срезы инкубировали 20 мин с 1% раствором перекиси водорода в физиологическом растворе, забуференным Трис-НО буфером (ТБС), промывали в ТБС, удаляли лишнюю жидкость вокруг срезов и раскапывали первичные антитела. Инкубировали 45 мин с первичными антителами. После инкубации трижды по 3 мин промывали в ТБС и инкубировали 30 мин с биотинилированными вторыми антителами (Link, DAKO LSAB+Kit Peroxidase). Далее вновь трижды по 3 мин промывали в ТБС и инкубировали со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (Streptavidin, DAKO LSAB+Kit Peroxidase), в течение 20 мин. Затем препараты промывали так же, как после инкубации с первичными и вторичными антителами. В качестве субстрата пероксидазной реакции использовали раствор аминоэтилкарбазола и перекиси водорода в 0,1 М ацетатном буфере (рН=5,0).
Интенсивность окрашивания (продукт реакции красного цвета) контролировали под микроскопом. После прекращения иммуногистохимической реакции срезы промывали в ТБС, ядра подкрашивали квасцовым гематоксилином (окраску дифференцировали 10 мин в водопроводной воде), препараты заключали в глицерин-желатину [9]. Окрашивание парафиновых срезов биоптатов почки больных ХГН с антителами против CD34 (клон QBEnd/Ю, фирма Novokastra, 1:50) и CD31 (клон 1А10, фирма Novokastra, 1:50) проводили также стрептавидин-биотиновым методом [9]. Отличие данной процедуры окрашивания от описанной выше заключалось в том, что данные антигены могли быть выявлены только после предварительной демаскировки методом HIAR (Heat-Induced Antigen Retrieval) [83]. Срезы кипятили в течение 30 мин в 0,01 М цитратном буфере (ЦБ, рН=6,0), затем выдерживали в том же буфере ещё 15-20 мин и переносили в ТБС [12]. Инкубацию проводили согласно протоколу производителя. Далее окрашивание проводили по протоколу, приведённому в предыдущем разделе. Парафиновые срезы почек крыс окрашивали антителами к HLA-ABC (клон W6/32-HL, фирма Novokastra; разведение 1:160). Окрашивание проводили коммерческим набором Catalyzed Signal Amplification (CSA) System (катализированная амплификация сигнала), основанным на стрептавидин-биотиновом методе [9] с небольшими модификациями, позволяющими выявлять слабые антигены.
После депарафизации и регидратации проводили демаскировку методом HIAR [205]. Далее срезы инкубировали 5 мин с блоком пероксидазы (Peroxidase block), а после троекратного промывания в ТБС по 3 мин инкубировали 5 мин с протеиновым блоком (Protein block, Dako, Denmark), разведённым в ТБС. Затем без промывки срезы инкубировали с антителами против HLA-ABC в течение 15 мин. После трёхкратного промывания в ТБС проводили 15 минутную инкубацию с кроличьими антителами к иммуноглобулинам мыши (Link, DAK О, Denmark), после чего вновь трижды по 3 мин промывали в ТБС и инкубировали 15 мин со стрептавидин-биотиновым комплексом (Streptavidin -biotin complex, DAKO, Denmark). Затем препараты трижды промывали в ТБС и инкубировали 15 мин с амплифицирующим реагентом (Amplification reagent, DAKO, Denmark), в результате на искомом антигене оседали молекулы биотинилированного фенолсодержащего соединения, многократно усиливая первичный сигнал. Снова проводили трёхкратную по 3 мин промывку в ТБС, после чего в течение 15 мин инкубировали со стрептовидином, конъюгированным с пероксидазой (Streptavidin-HRP, DAKO, Denmark). В качестве субстрата пероксидазной реакции использовали раствор аминоэтилкарбазола, после чего ядра докрашивали гематоксилином, препараты заключали в глицерин-желатину [9]. Полуколичественную оценку выраженности экспрессии CD34 и CD31 в клубочках на серийных срезах проводили три независимых морфолога . Выраженность экспрессии каждого маркёра выражали в баллах (таблица 1). На серийных срезах исследовали как минимум 5 клубочков, и по результатам оценки, проведённых тремя морфологами вычисляли среднее значение активности экспрессии CD34 и CD31 для каждого среза.
Преобладание экспрессии CD34 над CD31 на 1 балл и более свидетельствовало о наличие СБ34(+)/СБ31(-)-клеток, рассматриваемых нами как гемопоэтические CD34(+)-клетки. Подсчёт проводили при помощи морфометрической окулярной сетки на микроскопе Микмед-5 при увеличении х400. Статистический анализ результатов морфометрических исследований проводили с помощью статистического графического пакета Microsoft Excel. Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стъюдента, уровень достоверности р 0,05. Оценку связи между качественными непараметрическими признаками проводили с использованием критерия «хи-квадрат». Регенеративная медицина - это новое направление в медицине, ориентированное на стимуляцию репаративной регенерации повреждённых органов и тканей. В нефрологии, на данную терапию возлагаются огромные надежды в отношении лечения почечного склероза, являющегося конечной стадией многих заболеваний почки, в том числе ХГН. В литературе уже имеются работы, демонстрирующие, что трансплантация клеток костного мозга в начале развития мезангиального склероза замедляет его прогрессию [106], а введение клеток до начала заболевания предотвращает его развитие вообще [184]. На основании этих данных можно предположить, что трансплантация гемопоэтических стволовых клеток может стать альтернативой единственно возможному, но подчас невыполнимому способу лечения таких больных -трансплантации почки. Перед тем как разрабатывать тактику лечения конкретной патологии мы считаем необходимым изучить участие собственных гемопоэтических клеток в регенерации органа. Ведь именно эти данные необходимы для того, чтобы судить о целесообразности трансплантации стволовых клеток в целом. Для определения присутствия гемопоэтических клеток в почечных клубочках, было проведено иммуногистохимическое окрашивание 64 нефробиоптатов больных ХГН антителами против CD34 и CD31. CD31[44, 171, 188, 211] является стабильным гликопротеином эндотелия, a CD34 помимо эндотелиальных клеток, располагается на клетках-предшественницах гемопоэза [64,68,91,109,172,188].
