Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
Генерация АФК дыхательной цепью митохондрий 8
Генерация АФК в комплексе 1 9
Генерация АФК в комплексе III 12
Механизмы адаптации к окислительному стрессу 15
Влияние АФК на сигнальные каскады и клеточную гибель 18
Морфология митохондриалыюго ретикулума 23
Белки, участвующие в слиянии митохондрий 24
Модель слияния митохондрий 31
Фрагментация митохондрий 34
Взаимодействие белков участвующих во фрагментации митохондрий 36
Регуляция белков участвующих во фрагментации митохондрий 39
Фрагментация митохондрий при апоптозе 40
Избирательное уничтожение митохондрий («митоптоз») 42
Избирательное уничтожение митохондрий в процессе дифференцировки 44
а) Участие 15-липоксигеназы 44
б) Убиквитирование и АТФ зависимый протеолиз 45
в) Аутофагия и экзоцитоз митохондрий 46
Избирательное уничтожение митохондрий при патологиях 48
Избирательное уничтожение митохондрий в процессе запрофаммированной гибели клеток 49
Аутофагия 52
Механизм формирования аутофагосом 56
Аутофагия при патологиях 58
Маркеры, определяющие специфичность аутофагии митохондрий 60
Объекты и методы исследования 62
Объект исследования 62
Замораживание и размораживание клеток 62
Трансфекция клеток 62
Регистрация дыхания клеток 63
Визуализация митохондрий, аутофагосом и цитоскелета 64
Определение клеточной гибели 64
Электронная микроскопия 66
Сканирующая электронная микроскопия 66
Измерение продукции АФК и мембранного потенциала 66
Измерение концентрации пероксида водорода 67
Результаты исследования 68
Характеристика клеток линии HeLa 68
Индукция гибели клеток HeLa пероксидом водорода 69
Пероксид водорода стимулирует митохондриальную продукцию АФК 73
Участие митохондриальных АФК в передаче апоптозного сигнала между клетками 75
Окислительный стресс вызывает фрагментацию митохондриального ретикулума 82
Деградация поврежденных митохондрий при окислительном стрессе 84
Обсуждение 99
Выводы 114
Список литературы 116
- Генерация АФК дыхательной цепью митохондрий
- Механизмы адаптации к окислительному стрессу
- Замораживание и размораживание клеток
- Характеристика клеток линии HeLa
Введение к работе
В настоящее время термин «окислительный стресс» используется для обозначения широкой группы разнообразных взаимосвязанных явлений, включающих повышенную продукцию активных форм кислорода (АФК) и окислительное повреждение молекулярных компонентов клетки. Взаимоотношения между этими явлениями остаются не до конца выясненными, но, вероятно, большую роль при этом играет окислительное повреждение митохондрий, автокаталитически приводящее к усилению генерации ими АФК. Механизмы образования АФК митохондриями в условиях окислительного стресса до сих пор остаются не ясными. Многочисленные данные, полученные в экспериментах с выделенными митохондриями и субмитохондриальными частицами, указывают на то, что главными супероксид-образующими компонентами дыхательной цепи являются NADH: убихиноноксидоредуктаза (комплекс I) и убихинон-цитохром с редуктаза (комплекс III). Однако, не ясно, какой именно компонент комплекса I служит одноэлектронным донором для восстановления кислорода. Более того, в физиологических условиях в клетках поддерживается высокий уровень NADH, который может препятствовать образованию супероксида комплексом I. Вероятно, по этой причине эксперименты на культурах клеток дают противоречивые результаты о роли комплекса І в генерации АФК. Ингибирование активности комплекса І в культуре клеток может приводить как к увеличению, так и к снижению уровня АФК в зависимости от типа клеток и стимула, вызывающего окислительный стресс. Подобная неоднозначность указывает на сложность механизмов генерации АФК митохондриями в физиологических условиях.
Реакция клетки на окислительный стресс включает целый ряд защитных механизмов. Прежде всего, происходит активация и дополнительная экспрессия многочисленных антиоксидантных систем, часть из которых направлена на защиту митохондрий. Поврежденные митохондрии
представляют значительную опасность для клетки и как источники АФК, и как потребители NAD(P)H и АТФ, поэтому существуют механизмы служащие для уничтожения таких органелл. Наконец, в случае исчерпания всех возможностей защиты, в клетке может запускаться программа гибели (апоптоз), позволяющая избежать распространения стресса в окружающих тканях. Так, в 1998 году В.П. Скулачевым была высказана гипотеза о том, что пероксид водорода, образующийся в процессе гибели клеток, может служить сигналом, вызывающим гибель соседних клеток (Skulachev 1998). Такая передача сигнала может быть одним из механизмов защиты организма от заражения патогенами. К примеру, при локализованной вирусной инфекции вокруг зоны размножения вируса может возникать зона мертвых клеток, предотвращающая распространение инфекции по всему организму. Кроме того, передача сигнала апоптоза играет важную роль в терапии опухолей. Индукция апоптоза в опухоли под действием цитотоксических химиопрепаратов или облучения может затронуть лишь часть клеток, а гибель остальных произойдет под действием перекиси водорода. При этом могут быть уничтожены даже опухолевые клетки, защищенные от апоптоза, вызываемого цитотоксическими препаратами (например, в результате мутаций в сигнальных путях, зависимых от белков р53 или Rb, как в случае клеток HeLa), в то время как апоптоз, индуцированный Н2О2, не требует передачи сигнала по этим путям. Основной механизм гибели клеток в этом случае, вероятно, связан с окислительным повреждением митохондрий под действием внешней Н202, что стимулирует продукцию «вторичных» АФК митохондриями и таким образом вызывает апоптоз клетки. Исследования в этой области представляют большой интерес в связи с тем, что окислительный стресс, сопровождающийся повреждением митохондрий, наблюдается при многих серьезных патологиях, представляющих собой актуальную проблему для здравоохранения, в частности при инфарктах, инсультах, нейродегенеративных заболеваниях. Выяснение роли нарушения биоэнергетических функций митохондрий в индукции окислительного стресса, а также изучение механизмов защиты клетки от повышенной продукции АФК митохондриями позволит более эффективно бороться с этими заболеваниями.
Генерация АФК дыхательной цепью митохондрий
Митохондрии концентрируют в себе большую часть окислительных метаболических путей, и поэтому содержат многочисленные редокс-переносчики и центры, потенциально способные к одноэлектронному восстановлению кислорода до радикала супероксид-аниона, предшественника других АФК. Учитывая относительно умеренный редокс потенциал пары супероксид/Ог (Е =-0,16 V), неудивительно, что реакция одноэлектронного восстановления оказывается термодинамически выгодной для митохондриальных оксидоредуктаз {Turrens 2003). Теоретически, кислород может претерпевать одноэлектронное восстановление до супероксида на любом из комплексов дыхательной цепи, но многочисленные работы по выявлению основных источников АФК в дыхательной цепи позволили установить, что основная генерация происходит в комплексах I и III, причем в последнем случае это происходит, только когда путь электронов в Q-цикле нарушен специфическими ингибиторами (Ksenzenko et al. 1984). Именно генерация АФК в этих двух комплексах и будет в дальнейшем разобрана более подробно.
Кроме дыхательной цепи АФК может генерироваться в цикле трикарбоновых кислот кетоглюторатдегидрогеназой (Starkov et al. 2004, Andreyev et al. 2005) и аконитазой (Vasquez-Vivar et al 2000), расположенными на внешней мембране митохондрий моноаминооксидазами А и Б (Hauptmann et al. 1996), редуктазой цитохрома Ь5 (Whatley et al. 1996), расположенными на внутренней митохондриальной мембране дегидрогеназой дегидрооротата (Loffler et al. 1996), дегидрогеназой альфа-глицерофасфата (Miwa and Brand 2003), сукцинатдегидрогеназой (Liu et al. 2002).
Комплекс I является сложным многокомпонентным белковым комплексом, состоящим из 46 полипептидов, несущих, по крайней мере, 8 индивидуальных редокс-компонентов (FMN, 5-6 железносернистых кластеров, прочно связанный убихинон) (Виноградов А.Д., 2001). Различные компоненты комплекса, участвующие в переносе электронов и сохраненные в процессе эволюции от прокариот до млекопитающих, транспортируют электроны от NADH через группу FeS-центров на восстановленный убихинон, при этом протонная помпа, переносящая Н+ из матрикса наружу внутренней мембраны митохондрий, формирует мембранный потенциал митохондрий (Ay). Эта реакция обратима и сопряжена с трансмембранным переносом протонов, генерирующим электрохимический протонный потенциал, Ацц+ (Skulachev, 1988). Изучение механизма генерации АФК пока еще не привело к выявлению единого, общепризнанного центра генерации АФК в комплексе I.
Результаты экспериментов с изолированным комплексом I и с субмитохондриальными частицами указывают на то, что генерация АФК происходит между флавином и ротенонсвязывающим участком, и что в этой области может быть несколько супероксид генерирующих центров (Kang et al 1983). В работе А.Д. Виноградова и В.Г. Гривенниковой (Виноградов А.Д. и Гривенникова ВТ., 2005) предполагается, что одноэлектронное восстановление кислорода комплексом I происходит в том центре связывания NAD, где происходит его энергозависимое восстановление (центр R на рис. 1). Есть все основания считать, что непосредственно с кислородом реагирует восстановленный FMN или его семихинон. Во-первых, восстановленные, не связанные с белками флавины FMNH2 и FADH2 (стандартные редокс-потенциалы для свободных нуклеотидов около 280 мВ (Clark, I960)) аутооксидабельны и быстро окисляются молекулярным кислородом (Dixon 1971а, Ь, с). Во-вторых, специфические ингибиторы комплекса І ротенон и пиерицидин препятствуют образованию убисемихинона при сопряженном {состояние 4) окислении NADH {Kotlyar et al. 1990) и стимулируют скорость образования 02 {Виноградов А.Д. и Гривенникова В.Г., 2005). В-третьих, трансгидрогеназная реакция с участием центров F и R (рис. 1) катализируется лишь небольшим фрагментом комплекса I, так называемым флавопротеидом {Hatefi and Galante 1977), содержащим один, сильно модифицированный железосернистый центр.
Механизмы адаптации к окислительному стрессу
В живых клетках и тканях существуют механизмы восстановления окислительно-восстановительного баланса в случае временного повышения уровня активных форм кислорода (АФК). Накопление АФК в клетке может стимулировать экспрессию генов, участвующих в антиоксидантном ответе. Основной механизм поддержания окислительно-восстановительного баланса основан на стимуляции активными формами кислорода экспрессии антиоксидантных белков, либо ускорению транспорта цистеина, который участвует в биосинтезе глутатиона. Кроме того, учитывая, что белки (не системы антиоксидантной защиты) проявляют меньшую антиоксидантную активность по сравнению с эквивалентной концентрацией аминокислот, входящих в их состав, то протеолиз поврежденных белков также можно отнести к механизму поддержания окислительно-восстановительного баланса.
Наиболее хорошо охарактеризованным компонентом АФК чувствительной системы в дрожжах является транскрипционный фактор Yaplp, который регулирует уровень транскрипции многих генов, кодирующих белки антиоксидантной защиты. Обработка клеток пероксидом водорода приводит к накоплению Yaplp в ядре и изменению уровня транскрипции приблизительно 70 генов, среди которых гены, кодирующие тиоредоксин редуктазу, цитоплазматическую каталазу, тиоредоксин 2, цитоплазматическую супероксидисмутазу, цитохром-с-пероксидазу, а также ферменты, участвующие в синтезе глутатиона (Gasch et al. 2000, Моуе-Rowley 2002)
Концентрация Yaplp в ядре, в основном, регулируется изменением скорости его выхода. В нормальных условиях, без окислительного стресса, Yaplp выходит из ядра за счет взаимодействия со специальным белком Crmlp, который значительно облегчает его выход в цитоплазму. Обработка клеток Н202 приводит к окислению двух остатков цистеина (С598, СЗОЗ) белка Yaplp и формированию дисульфидной связи, которая мешает связыванию Yaplp с Crmlp, тем самым, препятствуя его выходу из ядра. Однако Н2О2 вызывает окисление остатков цистеина Yaplp не прямо, а посредством пероксиредоксина Gpx3p, который содержит остаток цистеина (С36), высоко чувствительный к непосредственному действию Н2О2. Окисление цистеина С36 белка Gpx3p стимулирует образование дисульфидной связи между цистеинами С598 (Yaplp) и C36(Gpx3p). Далее происходит восстановление Gpx3p с образованием внутримолекулярной дисульфидной связи между цистеинами С303-С598 белка Yaplp. Таким образом, в дрожжевой клетке именно Gpx3p является первичным сенсором для Н2О2.
Активация Yaplp может происходить и независимо от СрхЗр под действием N-этилмалеимида, 4-гидроксиноненаля или диамида, которые ковалентно связываются с цистеинами (С598, С620, и С629) С-конца Yaplp, что приводит к накоплению этого белка в ядре (Kuge et al. 2001, Azevedo et ah 2003). Тем не менее, накопление Yaplp в ядре не гарантирует устойчивости клетки к окислительному повреждению. Так, мутация в С-концевой части молекулы Yaplp приводит к значительному увеличению количества этого белка в ядре и повышает устойчивость клетки к диамиду, но, в тоже время, значительно снижает устойчивость к Н2О2. Вероятно, формирование дисульфидных связей между различными цистеинами С-концевой части молекулы определяет специфичность Yaplp к промоторным участкам различных генов, определяющих устойчивость клетки к различным прооксидантам. При снижении окислительного стресса Yaplp должен инактивироваться. Анализ in vitro показал, что восстановленный тиоредоксин может восстанавливать дисульфидные связи в белках Yaplp и Gpx3p, что приводит к их инактивации (Wood et al. 2004). Авторегуляция активности Yaplp происходит из за того, что Yaplp контролирует синтез тиоредоксина 2 и тиоредоксин редуктазы (Moye-Rowley 2002), активность которых приводит в восстановлению тиоредоксина в клетке. Окислительное повреждение активирует Yaplp, который включает систему антиоксидантной защиты, что приводит к повышению количества тиоредоксина, его восстановленности и, соответственно, к инактивации Yaplp.
Сигнальные пути, активируемые в ответ на окислительный стресс, у млекопитающих похожи на таковые у S. Cerevisiae. Но так как макрофаги и нейтрофилы при воспалительных процессах в тканях генерируют большое количество АФК, то клетки высших организмов должны обладать повышенной устойчивостью к окислительному стрессу по сравнению с одноклеточными организмами типа S. Cerevisiae. К примеру, лимфоциты, которые работают в самом центре воспалительного участка, должны обладать повышенной устойчивостью к АФК, для того чтобы выжить в этих условиях.
В лимфоцитах тиоредоксин оксидоредуктаза является одним из ферментов, экспрессия которого повышается в ответ на окислительный стресс (Sachi et al. 1995, Matsui et al. 1996). Вместе с глутатионом, тиоредоксин играет ключевую роль в поддержании окислительно-восстановительного баланса у высших организмов. Гены, кодирующие тиоредоксин, имеют в своем составе участки связывания с транскрипционными факторами АР-1 и NF-kB (Nakamura et al. 1994, Nakamura et al. 1997).
Замораживание и размораживание клеток
Митохондрии в живых клетках окрашивали с помощью митотрэкера зелёного (Molecular Probes), специфического флуоресцентного красителя, окрашивающего митохондрии независимо от мембранного потенциала. Аутофагосомы выявляли с помощью монодансилкадаверина (0,05 мМ, 10 мин при 37С) (Sigma), лизосомы окрашивали с помощью лизотракера желтого (0,5 мкМ, 15 мин при 37С) (Molecular Probes). Для окраски с помощью антител клетки фиксировали в 3,7% формальдегиде, приготовленном на фосфатном буфере 15 мин и пермеабилизировали с помощью 0,5% тритона Х-100 10 мин Далее клетки инкубировали с моноклональными антителами к цитохрому С (Pharmingene), к I субъединице цитохромоксидазы (Pharmingene), тубулину (Sigma) или с поликлональными антителами к белку Вах (Pharmingene). Затем после отмывки клетки окрашивали с помощью вторичных антител, конъюгированных с красителями Oregon green и Texas Red-X (Pharmingene). Для окрашивания актиновых филаментов использовали фаллоидин, меченый TRITC (Sigma). Клетки на покровных стеклах заключали в среду Vectashield (Vector, США). Препараты анализировали с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии, используя конфокальные микроскопы Nikon Eclipse TE2000-U, LSM 510 (Carl Zeiss), а также флуоресцентный микроскоп Axiovert 200M (Carl Zeiss)
Определение клеточной гибели
Для определения конденсации и фрагментации хроматина, происходящих в клетках при апоптозе, использовали флуоресцентный краситель Hoechst 33342 - (2 -[4-этоксифенил]-5-[4-метил-1-пиперазинл]-2, 5 -би-1Н-бензимидазол). Краситель, в концентрации 1 мкг/мл, добавляли к живым или фиксированным клеткам на 25 мин Фиксированные 3,7%-ным раствором формальдегида клетки промывали фосфатным буфером (PBS) и заключали в среду Vectashield. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Axiovert 200М, Carl Zeiss) при длине волны возбуждающего света 365 нм.
Для определения некроза к нефиксированным клеткам добавляли флуоресцентный краситель пропидий йодид (PI), в концентрации 1 мкг/мл. Процент апоптозных и некрозных клеток определяли с помощью подсчета числа клеток с фрагментированным ядром (с помощью красителя Hoechst 33342) и клеток, проницаемых по пропидий йодиду, соответственно.
Кроме того, клеточную гибель определяли методом проточной цитометрии с использованием аннексина V, меченного флуоресцентной краской FITC, и пропидия йодида в качестве индикаторов клеточной гибели. Принцип метода основан на способности аннексина V связываться с фосфотидилсерином. Фосфатидилсерин располагается в мембране ассиметрично, основное его количество, находится на внутренней стороне плазматической мембраны. В процессе апоптоза фосфотидилсерин окисляется и переходит на внешнюю поверхность плазматической мембраны, где способен связываться с аннексином V. Некрозные клетки также окрашиваются аннексином V вследствие нарушения проницаемости плазматической мембраны, но, в отличие от апоптозных клеток, они окрашиваются и пропидий йодидом. Таким образом, апоптозными являются клетки, окрашивающиеся аннексином V, но не пропидий йодидом.
Для определения гибели, клетки снимали с подложки смесью трипсина с версеном, центрифугировали, после чего суспензировали в 100 мкл буфера, содержащего 10 мМ HEPES; 140 мМ NaCl и 2,5 мМ СаС12 (рН 7,4), добавляли аннексии V (разведение 1:100) и пропидий йодид (1 мкг/мл), инкубировали в темноте 10-15 мин и анализировали на проточном цитофлуориметре (Partec PAS-HI).
Электронная микроскопия
Для электронной микроскопии клетки фиксировали в 3,7% формальдегиде, приготовленном на фосфатном буфере (рН 7,4) при 4С в течении 2 часов, затем фиксировали 1% тетроксидом осмия в течении 1,5 часов. Далее препарат дегидратировали в этиловом спирте. Затем препарат заключали в Ероп-812 и делали ультратонкие срезы с помощью ультрамикротома. Срезы контрастировали цитратом свинца по Рейнольду. Полученные препараты анализировали с помощью электронного микроскопа HU-1 IB (Hitachi, Япония).
Сканирующая электронная микроскопия Клетки фиксировали 30 мин 2,5% глютаровым альдегидом, приготовленном на среде Хенкса (рН 7,2), не содержащей ионы Са2+, Mg2+, далее дополнительно фиксировали тетрахлоридом осмия в 0,1 % кокадилатном буфере (рН 7,3). Клетки дегидратировали с использованием ацетона и высушивали с помощью аппарата фирмы «Balzers». Далее на препараты напыляли смесь золота с палладием и проводили анализ с помощью сканирующего электронного микроскопа - Hitachi 405А, 15 kV.
Измерение продукции АФК и мембранного потенциала Для определения продукции активных форм кислорода (АФК) использовали флуоресцентные красители DCF-DA (2 ,7 дихлородигидрофлуоресцеин диацетат) или его аналог 5-(и-6)-хлорметил-2 ,7 -дихлородигидрофлуоресцеин диацетат ацетиловый эфир (СМ-H2DCFDA) (Molecular Probes) в концентрации 4 мкМ. Эти красители накапливаются в клетке и увеличивают интенсивность своей флуоресценции, при взаимодействии с АФК (в основном, при взаимодействии с Н2О2). Для измерения мембранного потенциала использовали флуоресцентный краситель тетраметилродамин (TMRM) в концентрации 200 нМ, который способен электрофоретически накапливаться в митохондриях пропорционально величине их мембранного потенциала. Красители добавляли в питательную среду на 15 мин, далее питательную среду меняли на свежую, затем клетки анализировали с помощью флуоресцентной или конфокальной микроскопии, а также с помощью проточного цитофлуориметра (Partec PAS-ПІ).
Характеристика клеток линии HeLa
Окислительный стресс в клетках HeLa вызывали добавлением Н2О2 в концентрациях 100 - 200 мкМ. Клетки HeLa рассаживали с низкой плотностью, при которой клетки образовывали небольшие несвязанные между собою островки (конфлюэнтность 30-40%). Многочисленные опыты показали, что гибель клеток от Н202 находится в сильной зависимости от плотности клеток, поэтому для воспроизводимости результатов этот параметр необходимо было тщательно контролировать. Пероксид водорода в концентрации 100 мкМ вызывал гибель 20-30% клеток через 17 часов после добавления. Эффект пероксида значительно усиливался, если клетки преинкубировали с ингибиторами дыхания пиерицидином или миксотиазолом (рис. 11). Это позволило предположить, что окислительный стресс, вызванный пероксидом водорода, стимулирует продукцию АФК в митохондриях, которая значительно усиливается при ингибировании дыхательной цепи.
Клеточная гибель, как под действием Н2С 2, так и в случае комбинации Н202 с ингибиторами дыхания, характеризовалась транслокацией белка ВАХ в митохондрии и выходом цитохрома С в цитозоль (рис. 12). Транслокация этих белков является одним из наиболее ранних проявлений апоптозной программы. С другой стороны, инкубация клеток с Н2Ог в комбинации с пиерицидином или миксотиазолом приводила к появлению большого количества клеток, окрашивающихся пропидий йодидом, который окрашивает ядра клеток только в случае, если целостность их плазматической мембраны нарушена. Нарушение целостности плазматической мембраны клеток является характерным признаком некроза. Для определения типа гибели в наших условиях мы использовали ингибитор каспаз zVAD-fmk. Учитывая, что апоптоз является процессом клеточной гибели, зависимым от активности каспаз, то их ингибирование должно тормозить гибель клеток при условии, что она идет по механизму апоптоза. Как видно на рисунке 12, zVAD-fmk эффективно блокировал гибель клеток, вызванную добавлением Н2С 2 в комбинации с ингибиторами дыхания. Таким образом, некроз в наших условиях был каспаз-зависимым. Вероятно, клетки окрашиваются пропидий йодидом уже на поздней стадии апоптоза, что может быть связано с интенсивным окислительным стрессом, вызванным комбинацией Н2Ог и ингибиторов дыхания, в результате которого может нарушаться целостность плазматической мембраны.
Роль митохондрий в окислительном стрессе, вызванном Н2О2, проверяли с помощью митохондриально MHTOQ ф ОН s направленного антиоксиданта MHTOQ. ЭТО НСО н,со ОН 13 Структура молекулы MumoQ вещество состоит из хинонового остатка коэнзима Q, конъюгированного с катионом рис децилтрифенилфосфония, что позволяет ему 71 электрофоретически накапливаться в митохондриях (Kelso et al. 2001, Kelso et al. 2002).
Катионная часть молекулы MHTOQ представляет собой производное катиона фосфония (рис. 13), который был предложен в 1969 г Либерманом и др. для измерения мембранного потенциала митохондрий (Liberman et al. 1969, Liberman and Skulachev 1970). MHTOQ 1000-кратно накапливается в митохондриях и эффективно восстанавливается дыхательной цепью. Исследование действия MHTOQ на клетки HeLa показало, что он не является токсичным в концентрациях до 5 мкМ (не показано). В опытах с индукцией пероксидом водорода клеточной гибели, мы использовали MHTOQ В концентрации 20 нМ, так как в более высоких концентрациях он был менее эффективен, а начиная от 500 нМ, MHTOQ усугублял действие пероксида водорода.
Было показано, что предварительная инкубация клеток с MHTOQ В концентрации 20 нМ практически полностью подавляла апоптоз, вызванный пероксидом водорода. Если инкубация клеток с MHTOQ проводилась в присутствии разобщителя, то защитный эффект MHTOQ на апоптоз, вызванный Н2О2, не +MMTOQ проявлялся (рис. 14).
