Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Перспективы использования культуры тканей растений в биохимии и биотехнологии 12
1.2. Введение в культуру тканей Polyscias filicifolia 17
1.3. Германийорганические соединения: биологическая активность, применение в медицине 19
1.4. Метаболизм белка в растениях 26
1.4.1. Обмен белка в растительных клетках 26
1.4.2. Кругооборот белка у растений при температурном воздействии 32
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Объект исследования и метод культивирования ткани 44
2.2. Выделение цитозольной фракции из культивируемых клеток 44
2.3. Энзиматические методы 45
2.3.1 Определение активности каталазы 45
2.3.2. Определение активности пероксидазы 45
2.3.3. Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) 46
2.4. Определение германия в клетках полисциас LX-5 46
2.5. Количественный анализ нуклеиновых кислот 47
2.6. Определение содержания карбонильных групп в белках 48
2.7. Оценка степени фрагментации окисленных белков 49
2.8. Определение железо-зависимого образования битирозина 50
2.9. Электрофоретические методы 51 2.9Л. Диск-электрофорез в ПААГ 51
2.9.2. Электрофорез в 10 % ПААГ с DS-Na 51
2.10. Радиоизотопные методы 52
2.10.1.Определение параметров обмена общего белка в клетках культуры ткани, выращенной на стандартной и обогащенной германийорганическим соединением средах 52
2.10.2. Изучение влияния температурного шока на обмен общего белка 52
2.11. Аналитические методы 53
2.12. Статистическая обработка результатов эксперимента 54
Глава 3. Результаты экспериментов 55
3.1. Обмен внутриклеточного белка в культурах ткани полисциас Polyscias filicifolia и Polyscias filicifolia LX-5, выращенных в стандартных условиях культивирования 55
3.1.1. Динамика прироста биомассы и общего белка в культуре ткани Polyscias filicifolia и Polyscias filicifolia LX-5 55
3.1.2. Параметры кругооборота внутриклеточного белка в культуре ткани Polyscias filicifolia и Polyscias filicifolia LX-5 58
3.1.3.Количественное содержание нуклеиновых кислот в культуре ткани Polyscias filicifolia и Polyscias filicifolia LX-5 59
3.1.4. Оценка антиоксидантного и прооксидантного статуса культуры ткани Polyscias filicifolia и Polyscias filicifolia LX-5 61
3.1.5. Оценка протеинового спектра внутриклеточных белков в клетках культур ткани Polyscias filicifolia и Polyscias filicifolia LX-5 66
3.1.6. Фотохимический анализ культуры ткани Полисциас 68
3.2. Биохимическая оценка метаболизма общего белка в культуры ткани полисциас Polyscias filicifolia и Polyscias filicifolia LX-5 в условиях высоко- и низкотемпературного шоков 70
3.2.1. Динамика содержания общего белка и параметры кругооборота в культуре ткани исходного и селективного штаммов полисциас при воздействии теплового шока и низких температур 70
3.2.2. Исследование протеиновых спектров вігутриклеточньїх белков в клетках культуры ткани полисциас при воздействии теплового шока и низких положительных температур 74
3.2.3. Антиоксидантный статус культуры ткани полисциас Polyscias filicifolia Bailey и Polyscias filicifolia LX-5 Bailey в условиях темппературного шока и воздействии низких положительных температур 76
3.2.4. Пролиферативная активность культивируемых клеток полисциас при высоко- и низко температурных воздействиях 82
Глава 4. Обсуждение результатов 83
Выводы 107
Список цитируемой литературы 108
- Перспективы использования культуры тканей растений в биохимии и биотехнологии
- Кругооборот белка у растений при температурном воздействии
- Динамика прироста биомассы и общего белка в культуре ткани Polyscias filicifolia и Polyscias filicifolia LX-5
- Оценка антиоксидантного и прооксидантного статуса культуры ткани Polyscias filicifolia и Polyscias filicifolia LX-5
Введение к работе
Актуальность темы. Растения вида Poliscias folicifolia (полисциас папоротниколистиый) произрастают в трошиеских странах, где издавна используются как ценное лекарственное сырье. Штамм тропического растения Polyscias filicifolia был введен от интактного оранжерейного растения в культуру изолированных тканей in vitro в Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии в 1972 году (Слепян Л.И. и соавт., 1975). Полученный в СПХФА штамм полисциас Polyscias filicifolia был зарегистрирован во ВСККК-ВР под номером 24, как обладающий адаптогенным и иммуномодулирующим эффектами (Михайлова Н.В., 1981) .Дальнейшие исследования показали, что фармакологические препараты, полученные из биомассы данной культуры ткани, обладают высокой биологической активностью, в частности, тонизирующей, иммуномодулирующей и стресспротекторной. (Трилис Я.Г. и соавт., 1995; Рябков А.Н. и соавт., 2004).
В последние годы исследования германийорганических соединений, обладающих широким спектром биологической активности, являются одним из перспективных направлений в современной химии элементорганических соединений. Известно, что германийорганические комплексы характеризуются низкой токсичностью и высокой биологической активностью. Эти соединения не только повышают эффективность применяемых лекарственных средств, но и снижают токсичность или побочные эффекты препаратов (ГарТ.К., Миронов В.Ф.,1982). Германийорганические соединения оказывают специфическое действие на сердечно-сосудистую и центральную нервную системы, вызывают индукцию интерферона, а также обладают иммуномодулирующим, противоопухолевым и антивирусным действиями (Хромова Н.Ю., Гар Т.К., Миронов В.Ф., 1985).
Селективный штамм Polyscias filicifolia LX-5 был введен в культуру в 2003 году при выращивании исходного штамма полисциас на среде, содержащей германийорганическое соединение (LX-5).
В настоящее время культуры растительных тканей становятся объектом промышленной биотехнологии для получения биологически активных соединений для медицины, косметики, пищевой и ряда других промышленностей. В то же время, для более широкого внедрения в промышленность целевых продуктов на основе культур растительных тканей создаваемые биотехнологические производства должны быть способными выдерживать конкуренцию с альтернативными системами получения данных продуктов. Однако перевод клеток растений в культуру может в значительной степени менять морфологию, биохимігческие особенности, а также генотип клетки, поэтому многие аспекты ее существования и развития требуют детального самостоятельного изучения. Таким образом, основные трудности, которые тормозят внедрение растительных культур в промышленное производство, связаны с недостаточным знанием как общей картины изменений, происходящих в культивируемых in vitro клетках, так и контрольных механизмов биосинтеза вторичных продуктов растительного происхождения и рядом других проблем (Бутенко Р.Г., 1991; Бурьянов Я.И., 1999). Поэтому в последние годы во всем мире ведутся интенсивные биохимические исследования на модели культур растительных клеток, которые открывают большие перспективы в изучении молекулярных механизмов метаболических процессов, протекающих в клетке, с целью их практического применения (Носов A.M., 1999). В частности, культуры растительных тканей используются в настоящее время в качестве адекватной модели для изучения на клеточном уровне адаптации растений к различным неблагоприятным воздействиям окружающей среды.
Цель и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы является сравнительное исследование основных биохимических и фотохимических показателей в процессе культивирования клеток исходного и селективного штаммов Polyscias filicifilia (Moore ex Fournter) Bailey (сем. Araliaceae). Изучение влияния температурного шока и низких температур на
белоксинтетическую способность и стабильность культур клеток растения полисциас.
В соответствии с целью работы непосредственными задачами работы являлись:
1. Характеристика динамики прироста биомассы, содержания ДНК и РНК, а также белоксинтезирующей способности клеток исходного полисциас и селективного полисциас LX-5 штаммов
2. Изучение динамики уровня активности ферментов-антиоксидантов
(пероксидазы, каталазы и СОД) в процессе роста культивируемых
растительных клеток двух штаммов полисциас
Определение основных фотохимических показателей биомассы клеток исходного и селективного штаммов полисциас
Оценка влияния различных температур на пролиферативную активность, белоксинтезирующую способность и состояние трех исследуемых ферментов-антиоксидантов в культурах растительных клеток
5. Исследование элементного состава и внутриклеточного
распределения германия в культуре селективного штамма полисциас
Научная новизна работы. Основным достижением данной работы представляется проведенное впервые в сравнительном аспекте комплексное исследование основных биохимических и фотохимических показателей в процессе выращивания исходного и селективного штаммов тропического растения полисциас.
Получены новые данные, расширяющие и углубляющие современные представления о метаболизме белков в растительных клетках при экстремальных температурных воздействиях. В результате проведенных исследований впервые была оценена белоксинтезирующая способность и рассчитаны параметры кругооборота вігутриклеточного белка в культивируемых клетках полисциас и полисциас LX-5.
Установлена избирательная чувствительность важнейших ферментов антиоксидантной системы - СОД, каталазы и пероксидазы - к воздействию различных температур, что проявляется в усилении или ослаблении уровня их каталитической активности. Отмеченный колебательный характер изменения активности трех основных ферментов антиоксидантной системы коррелировал с ростовыми процессами (накопление биомассы и внутриклеточного белка) и с изменением митотической активности (по содержанию ДНК).
В диссертационной работе впервые изучена динамика содержания ДНК и РНК в клетках двух штаммов культуры полисциас в процессе их культивирования. Установлено, что характер изменения содержания РНК сходен с таковым для ДНК. Впервые были получены новые данные о пролиферативной активности культивируемых клеток полисциас при высоко- и низкотемпературных воздействиях, а также изучена пролиферативная активность клеток in vitro при воздействии активных форм кислорода.
При оценке влияния германийорганических соединений на метаболизм белков было установлено, что выращивание культуры полисциас на селективных средах не только увеличивает содержание нуклеиновых кислот и внутриклеточного белка, но и повышает в исследуемых клетках уровень активности ферментов-антиоксидантов по сравнению с исходным штаммом.
Кроме того, в работе был проведен фотохимический анализ содержания основных биологически активных соединений (суммы гликозидов, углеводов и микроэлементов), а также изучено внутриклеточное распределение германия в клетках селективного штамма. Установлено, что максимальное содержание германия (до 54-55%) локализовано в водорастворимой фракции культивируемых клеток, а примерно 30% общего количества данного элемента остается в шроте, после ювлечения липофильных веществ и суммы гликозидов.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе данные расширяют и углубляют наши представления о биохимическом состоянии переведенных в культуру растительных клеток. Полученные результаты дополняют уже известную информацию о биологической роли германия, в частности, о возможном участии германийорганических соединешш в биологических процессах в растительной клетке.
Работа носит экспериментально-теоретический характер. Однако полученные результаты характеризуются практической направленностью для биотехнологии и медицины. В частности, в работе было установлено, что добавление в питательную среду германийорганического соединения, оказывало положительное влияние на основные ростовые и биохимические показатели культуры ткани полисциас. Учитывая высокую биологическую активность гермаїшйоргаїшческих соединений (Хромова Н.Ю., 1983), можно полагать, что препараты (настойки, экстракты и т.п.) из биомассы модифицированного штамма полисциас будут иметь более широкий спектр фармакологического действия по сравнению с исходной культурой полисциас, что открывает большие перспективы в использовании германийорганических соединений в биотехнологии растительных тканей.
Полученные результаты будут использованы при оформлении паспортов на исходный и селективный штаммы культуры Polyscias filicifolia. Материалы данного исследования используются в учебном процессе на кафедре биохимии для студентов Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии.
Основные положения, выносимые на защиту.
Биохимические исследования влияния германийорганического соединения на основные ростовые и биохимические показатели культуры ткани полисциас.
Радиоизотопные исследования скорости биосинтеза и времени функционирования общего белка, а также биохимические исследования
11 активности ферментов-антиоксидантов (СОД, каталазы и пероксидазы) в растительных клетках, выращенных в стандартных условиях и при воздействии неблагоприятных температур.
3. Изучение пролиферативной активности культивируемых клеток полисциас при высоко- и низкотемпературных воздействиях, а также при воздействии in vitro активных форм кислорода.
Апробация работы. Материалы работы были апробированы на 60-ой региональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2005), IX Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт - Петербург, 2005), Юбилейной конференции «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности » (Санкт - Петербург, 2005), 61-ой региональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2006), IX Международной конференции молодых ботаников (Санкт -Петербург, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 128 страницах, содержит 5 таблиц и 25 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, которая включает 201 наименование на русском и английском языках.
Перспективы использования культуры тканей растений в биохимии и биотехнологии
Изучение молекулярных механизмов жизнедеятельности организмов составляет одну из основных задач современной молекулярной биологии. Большие перспективы в изучеіши широкого круга биологических проблем открывает метод культуры in vitro изолированных органов, тканей и клеток высшего растения.
Процесс формирования каллуса, т.е. феномен трансформации покоящихся клеток в активно делящиеся был описан в конце 19 века. В 1893 г. Рехингер (Rechinger С, 1893) осуществил первые попытки получения каллуса на основе эксплантатов га различного растительного материала. Принципы клеточной культуры были сформулированы 9 годами позже Габерландтом, который, работая с отдельными клетками палисадной паренхимы листа ряда покрытосеменных растений, использовал в качестве питательной среды раствор Кнопа с добавлением сахарозы, аспарагина и пептона. В результате проведенных исследований Габерландт выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки растения. (Haberlandt G., 1902).
К настоящему времени метод культивирования растительных клеток и тканей достиг достаточно высокого технического уровня, и пригодность его для решения ряда биологических и медицинских проблем не вызывает сомнения (Носов А.М., 1999).
В культурах тканей растений, выращенных в строго контролируемых условиях, имеется возможность оценить потенции изолированных из целого организма тканей и клеток, а также исследовать молекулярные механизмы обменных процессов растений на клеточном уровне. При использовании возможности реконструкции органов и целого растения из тканей и отдельных клеток для исследователей открываются новые перспективы в изучении биохимии морфогенеза и биохимической регуляции этих процессов. Генетический аспект такой реконструкции имеет практический выход, а именно, возможность получения новых растительных форм для селекции.
Таким образом, необходимо отметить и возможности практического использования выращенных in vitro клеток и тканей растений. В частности, метод культуры растительных клеток и тканей имеет большое значение для оздоровления растений от вирусов, так как меристемы корней и ветвей даже заражеішого растения не обнаруживают присутствия вируса и при их культивировании дают здоровые растения (Morel G., 1963). Метод культуры тканей позволяет проводить исследования одной из важнейших биологических проблем - проблемы закономерностей злокачественного роста и борьбы с ним (Бутенко Р.Г., 1964).
Перспективным является возможность использования культуры растительных тканей для выделения специфических продуктов растительного происхождения - ценных лекарственных субстанций, синтез которых еще не доступен химически in vitro.
В последние десятилетия интенсивно ведутся работы для повышения содержания важных в практическом отношении вторичных метаболитов в культуре клеток и тканей растений. К настоящему времени уже достигнуты определенные успехи - получены клеточные суспензии, в которых скорость биосинтеза необходимого продукта не уступает таковому у исходного растения. Например, с помощью селекции выведены культуры тканей, содержащие такие важные лекарственные соединения, как серпентин и аймалин (Katharantus roseus) (Zenk М.Н. et al., 1977), виснагин (Ammi visnaga) (Kaul B. et al., 1965), аймалин (Rauwolfia serpentina) (Воллосович H.E. и соавт., 1976) и другие. Другими исследователями, при обработке этиленамином биомассы каллусных клеток Rauwolfia serpentina, была получена клеточная линия - продуцент индольных алкалоидов гипотензивного действия, отличающейся высоким содержанием антиаритмического алкалоида аймалина (Воллосович Н.Е. и соавт., 1976). В настоящее время метод культуры клеток, тканей и органов растений является составной частью биотехнолопш растений. Биологическая система клеток, тканей или органов высших растений, выращенных вне целого организма на искусственных питательных средах в стандартных и строго контролируемых условиях, позволяет исследователям всесторонне исследовать рост, клеточігую дифференцировку и развитие растительного организма, а также создавать принципиально новые клеточные технологии для промышленности, медицины и сельского хозяйства.
Выращивание клеток вне организма вызывает в них появление целого ряда признаков, отличающих их от клеток интактного растения. Выше указанные признаки, усиленные исследователями созданием биохимических мутантов, позволяют ученым вникать в молекулярные механизмы тех процессов, которые происходят в исходном, интактном растении. В настоящее время на основе культивируемых in vitro растительных тканей и органов уже созданы промышленные технологии с целью получения экономически важных целевых продуктов. (Teeri Т., Tormala Т., 1990; Смолов А.П., 1990; Воллосович А.Г., 1992; Симоненко Ю.В. и соавт., 1999).
Необходимо отметить, что культивируемые in vitro растительные клетки имеют целый ряд преимуществ по сравнению с исходными растениями. Например, изолированность от влияния различных факторов внешней среды, освобождение больших площадей для сельскохозяйственных культур, более высокий выход и качество продукции, четкость системы производства, применение принципов непрерывного культивирования, выпускающего продукты в заданные сроки и в необходимых количествах для обеспечения рынка. (Teeri Т., Tormala Т., 1990; Жеребцов Ф.Ф. и соавт., 1990; Бурьянов Я.И., 1999; Носов A.M. 1999).
Культура клеток как источник целевых продуктов растительного происхождения имеет особый интерес для промышленности и медицины по двум основным характерным для нее особенностям: способностью образовывать клеточную биомассу, содержащую экономически важные продукты клеточного метаболизма при выращивании в аппаратуре, применяемой в микробиологической промышленности; возможностью экспериментально реализовывать информацию о программах развития растительных клеток, а также производить растения-регенеранты от индивидуальной культивируемой in vitro клетки. (Жеребцов Ф.Ф. и соавт., 1990; Носов A.M., 1999).
Выше перечисленные особенности культуры растительных тканей используются в настоящее время при работе с каллусными и суспензионными культурами, и они же определяют возможности промышленного получения важных продуктов растительного происхождения, а также создания принципиально новых целевых продуктов и производство ценных продуктов растений с помощью биотрансформации из дешевых растительных предшественников. (Бутенко Р.Г., 1986; Бурьянов Я.И., 1999).
Как показали исследования последних лет, большая вариабельность генома культивируемых клеток, превосходящая видовую изменчивость исходных растений, позволяет рассматривать культивируемые клетки не только как альтернативное сырье для получения специфических (традиционных) продуктов, но и как системы, способные к синтезу новых химических соединений. С использованием культур растительных тканей и клеток, выращенных в строго контролируемых условиях, появилась возможность более полного анализа видовых свойств растений для решения ряда фундаментальных теоретических проблем.
Кругооборот белка у растений при температурном воздействии
В последние годы термин «стресс» (от английского напряжение) стал использоваться не только по отношению к человеку и животным, но и к высшим и низшим растениям и даже микроорганизмам. Канадский физиолог Г. Селье, который в 30-е годы XX века ввел такое обозначение, показал, что способность организма к адаптации связана с концентрацией и напряжением его защитных сил (Селье Г., 1972). В настоящее время показан близкий характер ответных реакций на стресс у самых древних обитателей Земли -бактерий и современных представителей эукариот (Чернядьев И.И., 2005). В 70-х годах было высказано предположение, что в основе повышения теплоустойчивости клеток, происходящей при тепловой закалке, лежит стабилизация внутриклеточных белков, а также их комплексов с другими макромолекулами. Так, некоторые различия в теплоустойчивости кислой фосфатазы и инвертазы наблюдали в экстракте из корней чубастика, выращенного при 45 и 10С (Delmer D.P., 1974).
В дальнейшем было установлено, что в ответ на резкое повышение температуры среды происходит глобальная перестройка метаболизма растительной клетки, включающая в себя замедление или прекращение синтеза обычных клеточных белков и индукцию синтеза белков, получивших название белки теплового шока (БТШ) или стрессовые белки. Синтез многих видов БТШ происходит и в ответ на другие стрессы, такие как аноксия, обработка этанолом, солями тяжелых металлов и др. (Nover L.et al., 1984). Кроме того, некоторые БТШ синтезируются в растительных организмах при физиологических (обычных) температурах на определенных этапах их развития, в частности, на раїших этапах онтогенеза. Полагают, что накопление данных белков при эмбриогенезе способствует повышению термостабилыюсти зародышей растений. (Josu-Estanyol М., Puigdombnech Р., 1998).
Все БТШ, как правило, подразделяют на два больших класса -высокомолекулярные (от 60 -110 кД) и низкомолекулярные (до 30 кД). Принадлежность БТШ к одному из классов указывает на то, что в состав данного белка входят субъединицы, имеющие молекулярные массы или ниже ЗОкД, или выше 60 кД.
Показано, что индукция БТШ происходит чрезвычайно быстро, уже через 3-5 минут после начала воздействия супероптимальных температур, и через 10-15 минут исследователи могут фиксировать появление стрессовых белков в растительных клетках. (Harrington Н.М., Aim D.M., 1988). Установлено, что высокомолекулярные БТШ стабилизируют белки на стадии их свертывания и таким образом предотвращают их необратимую денатурацию. Эти БТШ принимают участие также в сборке молекул белка и их транспорте через мембраны. Низкомолекулярные БТШ растений, в отличие от прокариот и животных организмов, обнаружены в ядрах, митохондриях, хлоропластах, рибосомах, внутриклеточных мембранах растительных клеток. Они образуют в цитоплазме клеток агрегаты (10-20 S и больше), причем в составе этих гранул были найдены мРНК. Предполагают, что низкомолекулярные БТШ предотвращают повреждения мРНК (Vierling Е., 1991). Так, например, с помощью электрофоретических, иммунохимических и полярографических методов в митохондриях кукурузы, после 3-х часового теплового стресса 42С, идентифицировали два низкомолекулярных белка (28 и 29 кДа), локализованных внутри данных органелл, и три белка (22,20 и 19 кДа) на их поверхности. Предполагается, что БТШ наружной и внутренней поверхностей мембран митохондрий играют существенную роль в защите последних от повреждений при гипертермии. По данным ряда авторов низкомолекулярные БТШ (16 кД-18 кД) являются мембранными серии- или гистидинпротеинкиназами. (Parsell D.A., Lindquik S., 1994; Leung S.M., Hightower L.E., 1997).
Принимая во внимание жизненно важные функции белков шаперонов, некоторые авторы поддерживают точку зрения, что все БТШ, образующиеся при воздействии на организм различных стрессорных факторов, являются шаперонами, и в их функции входит предотвращение слипания денатурированных стрессом белков, а также восстановление нормального функционирования белков в клетках (Humphreys D.T. et al., 1999). Другие авторы к шаперонам относят отдельных представителей семейства БТШ 60,-70 и -90 (Войников В.К. и соавт., 1994; Soto A. et al, 1999). Некоторые авторы связывают защитную биологическую функцию указанных выше белковых семейств, прежде всего, с их участием в репарации возникающих клеточных повреждений, а также их торможением активной деятельности клетки в период "пережидания" неблагоприятных условий. БТШ, являясь термостабильными белками, своим присутствием препятствуют диффузии термолабильных глобулярных белков и тем самым повышают их термостабильность (Войников В.К. и соавт., 1994; Struglics A., Hakansson G., 1999). В качестве подтверждения можно привести появление БТШ-60, обеспечивающего нормальный фолдинг фермента рибулозобифосфаткарбоксилазы в строме хлоропластов (Кислюк И.М. и соавт.; 2004; Чернядьев И.И., 2005). Внутриклеточные белки растений существенно различаются по своей чувствительности к различным температурам. Так, чувствительность различных белков, локализованных в одной и той же клетке, к нагреву может различаться в несколько градусов. Показано, что при 10-ти минутном нагреве in vitro нитратредуктаза пшеницы инактивируется на 50% при 37С, а пероксидаза - на 66% при 66С (Фельдман Н.Л. и соавт., 1981). По-видимому, дифференциальная чувствительность различных белков характерна не только к повышенным температурам, но и другим денатурирующим агентам и неблагоприятным факторам внешней среды.
Рядом авторов было продемонстрировано, что в процессе температурного закаливания листьев различных растеїшй, такие ферментативные белки как уреаза, пероксидаза, амилаза, кислая фосфатаза, глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа и некоторые другие становятся более термостабильными. В некоторых случаях повышение стабильности фермента сопровождалась частичным снижением его каталитической активности. Однако при действии высоких температур было также отмечено повышение устойчивости данных белков и к другим воздействиям, например, сдвигу рН в кислую стороігу, к воздействию протеиназ и др. Дальнейшие исследования показали, что при срабатывании механизма тепловой закалки к супероптимальным температурам в растительных клетках происходит стабилизация как термостабильных, так и термолабильных белков. (Фельдман Н.Л. и соавт., 1984; Колупаев Ю.Е. и соавт., 2005).
Показано, что под действием различных внешних неблагоприятных воздействий в клетках очень быстро изменяется экспрессия генов. В качестве наиболее удобной модели для изучения регуляции активности генов исследователями было выбрано воздействие на организм супероптимальных температур (низко- и высокотемпературные шоки). Дальнейшие исследования показали, что между так называемой "шщуцированной толерантностью" различных организмов к супероптимальным температурам и БТШ существует прямая связь. Установлена корреляция между временем развития терморезистентности клеток всех живых организмов и появлением в них БТШ. (Parsell DA., Libdquik S., 1994; Sabehat A. et al, 1996).
Динамика прироста биомассы и общего белка в культуре ткани Polyscias filicifolia и Polyscias filicifolia LX-5
Культуры тканей высших растений, которые выращиваются на искусственных питательных средах, позволяют всестороіше исследовать рост и развитие растительного организма, а также создавать принципиально новые клеточные технологии. Имеются многочисленные данные о сохранении геномом растительной клетки генетической активности в условиях дедифференцированного роста (Кунах В.А., 1999), поэтому культуры растительных тканей являются адекватной моделью для изучения тех процессов, которые протекают в любой клетке независимо от функішонируюших механизмов контроля или имеют автономную систему регулирования (Бутенко Р.Г., 1986; Носов A.M., 1999).
Проводимые в настоящее время биохимические исследования на культурах растительных тканей открывают большие перспективы в изучении молекулярных механизмов метаболических процессов, протекающих в клетке, с целью их практического применения (Бутенко Р.Г., 1991; Teeri Т., Tormala Т., 1990). Данные исследования представляют огромный интерес для более глубокого понимания многих сторон процесса обмена веществ у растений, что в дальнейшем может быть использовано для создания теоретической основы для усовершенствования и расширения масштабов биотехнологии культуры тканей растений.
В данной работе исследовали белоксинтезирующую способность и основные биохимические показатели в культуре ткани Polyscias filicifolia, выращенной в стандартных условиях и при температурном воздействии.
Длительность культивирования тканей растений, как известно, может вызывать заметные изменения как в росте и морфологии клеток, так и их биохимических показателей. Нами было установлено, что рост культуры ткани полисциас после многократных пассажей идет по обычной S-образной кривой с 5-ти дневной "лаг"-фазой (рис. 1-2). В течение 45 суток роста культивируемой ткани проводили анализ прироста сырой и суховоздушной биомассы. Как видно го рисунка 1, интенсивный прирост биомассы каллуса полисциас начинается с 15-х и заканчивается к 35-м суткам. Селективный штамм полисциас LX-5 в значительной степеїш отличался от исходного штамма как по относительному приросту сырой, так и суховоздушной биомассы клеток каллуса (рис. 2), а именно: добавление в среду культивирования германийорганического соединения увеличивало прирост сырой биомассы каллусной культуры на 10-15%, а суховоздушной -на 20-25%.
Содержание внутриклеточного белка в исследуемой каллусной культуре полисциас, выращенной на стандартной и модифицированной средах, менялось на протяжении роста ткани незначительно (рис. 4). Ранее другие авторы также отмечали достаточно стабильный уровень концентрации внутриклеточного белка в процессе культивирования различных видов растительных тканей (Раймерс Ф.Э., Хавкин Э.Е., 1970).
Характерно, что селективный штамм полисциас LX-5 в значительной степени отличался от соответствующего исходного штамма полисциас не только по относительному приросту сырой и суховоздушной биомассы, но и уровню содержания и динамики накопления внутриклеточного белка. Полученные данные, по-видимому, обусловлены влиянием германий органических соединений на геном растительных клеток, которые выращивались на селективных средах. (Гар Т.К., Миронов В.Ф., 1982).
Известно, что белоксинтезирующая способность клеток опосредованно влияет на все стороны обмена веществ. Расчет скорости биосинтеза внутриклеточного белка в растительных тканях проводили на основе данных, полученных с помощью радиоизотопного метода (Schimke R.T., Bradly М.О., 1975; Arias I.M. et al., 1969). При использовании этого метода для определения скорости синтеза белка необходимы данные о скорости изменения его радиоактивности, удельной радиоактивности аминокислоты-предшественника и скорости спонтанного распада белка. Оценку скорости синтеза и распада внутриклеточного белка в растительных культивируемых клетках проводили в интервале от 1-х до 6-ти суток после внесения радиоактивной метки. Кривые распада внутриклеточного белка в клетках культур ткани Polyscias filicifolia и Polyscias filicifolia LX-5 представлены на рисунке 5. Из полученных экспериментальных кривых были рассчитаны константы скоростей биосинтеза и деградации внутриклеточного белка, а также время его функционирования (табл. 1).
Таким образом, при изучении кругооборота внутриклеточного белка в исследуемых культурах штаммов полисциас нами было установлено, что время функционирования внутриклеточного белка в культивируемых клетках исходного штамма равнялось 6,86 суток, а в селективном штамме имело несколько меньшее значение - 6,42 суток (табл. 1). По-видимому, это связано как с различиями в самих объектах (различная степень дифферешшровки ткани и др.), так и с условиями функционировшшя генома, которые оказывают влияние на скорость обновления и распада внутриклеточных белков.
Оценка антиоксидантного и прооксидантного статуса культуры ткани Polyscias filicifolia и Polyscias filicifolia LX-5
Доказательство аккумуляции перекиси водорода в растительных клетках при тепловом шоке на свету было описано для суспензионной культуры (Doke N. et al, 1994) и проростков (Foyer С.Н. et al., 1997) табака. Прямое доказательство взаимосвязи между окислительным и тепловым стрессом было получено при использовании комбинированного светового и теплового шоков. (Bowler С. et al., 1992; Курганов Л.Н. и соавт., 1997). Кроме того, было показано, что тепловой шок может приводить к аккумуляции прооксидантов в растениях и в темноте. (Dat J.F. et al., 1998). В ряде работ было также установлено, что уже через несколько минут после воздействия низких температур в темноте на проростки и котиледоны различных растений (маиса, кукурузы, пшеницы и др.), уровень перекиси водорода в клетках повышался в 3 и более раз. (Prasad Т.К. et al., 1994).
Учитывая приведенные выше данные литературы, а также наши результаты о резком падении активности основных ферментов антиоксидантной защиты (СОД, каталазы и пероксидазы) в культуре ткани полисциас при воздействии неблагоприятных температур, можно с уверенностью говорить о смещении прооксидантно-антиоксидантного равновесия в сторону прооксидантов в культивируемых клетках, подвергнутых воздействию различных температур. Избыточное количество активных радикалов кислорода может взаимодействовать с различными биомолекулами, нарушать их структуру и функции, что способствует развитию окислительного стресса в клетках и, как следствие, вызывает множественные первичные нарушения в живых системах, в том числе и нарушение структуры ДНК. Активные формы кислорода повреждают ДНК во время атаки пуриновых и пиримидиновых оснований, за счет разрывов сахарофосфатных связей в биомолекулах, а также образования ковалентных сшивок между ДНК и белками и между соседними пиримидиновыми и пуриновыми основаниями. (Шинкоренко Н.В., 1986; Halliwell В, 1994; ПескинА.В., 1997). Известно, что при окислительном повреждении ДНК происходит остановка деления клеток (Пескин А.В., 1997), что и наблюдалось в проведенных нами экспериментах по влиянию неблагоприятных температур на клеточную пролиферацию in vitro. Кроме того, нами было показано, что степень повреждения ДНК (по содержанию которой можно судить о пролиферативной активности клеток) и общего пула РНК зависело и от вида повреждающего фактора (низкие температуры оказывали более повреждающее воздействие) и длительности воздействия повреждающего фактора (3 часа и 24 часа при 45С).
В доступной нам литературе имеется мало сведений, касающихся особенностей деградации ДНК в растительных клетках при стрессе и о возможной регуляторной роли, постоянно образующихся олигонуклеотидных фрагментов ДНК, у растений при воздействии неблагоприятных факторов внешней среды. Гораздо больше работ посвящено изучению особенностей деградации различных классов РНК в ходе развития и старения клеток и тканей, а также при воздействии на растения различных неблагоприятных факторов. В первую очередь это относиться к мРНК, скорость деградации которых зависит от структуры, их локализации, активности РНКаз и наличием в клетке белковых стабилизирующих или дестабилизирующих факторов. Стрессиндуцированные мРНК отличаются относительно малым временем функционирования (Tan B.C., Liang H.G., 1991; Тарчевский И.А., 1993). Олигонуклеотидные антисмысловые РНК могут вмешиваться в транскрипцию за счет образования трехсгшральных блоков на ДНК, за счет гибридизации с одной из нитей ДІЖ, за счет гибридизации с молекулой РНК, находящейся в процессе элонгации, а также за счет создания препятствия скольжения рибосомы вдоль молекулы мРНК. (Helene С, Toulme J.J., 1990). Таким образом, необходимо отметить, что вопросы, связанные с изучением катаболизма основных носителей генетической информации и регуляторной роли олигинуклеотидных интермедиантов деградации нуклеиновых кислот, требуют дальнейшего углубленного изучения. Особенно это касается метаболизма нуклеиновых кислот в клетках растений при воздействии неблагоприятных биотических и абиотических факторов внешней среды.
В последние годы многими учеными высказывается мнение о том, что механизмы, связанные с повреждающим действием активных форм кислорода, эволюционно закреплены (Foyer С.Н. et а!., 1997; Лю Б.И., 2001). Были найдены гены, имеющие отношения к регуляции редокс-состояния клетки, балансу генераторов кислородных радикалов и антиоксвдантных защитных механизмов. Предполагают, что в условиях окислительного сдвига активированная клетка, вступившая в клеточный цикл, может не подвергаться пролиферации (Kamata Н., Hirata Н., 1999), что, по-видимому, мы и наблюдаем при длительном воздействии in vitro низких и высоких неблагоприятных температур на культуру клеток полисциас (рис. 21).
Долгое время в литературе доминировало мнение, что активные формы кислорода действуют лишь как разрушители и не имеют никаких регуляторных функций в организме. Однако в настоящее время физиологическое значение окислительного стресса или сдвига тканевого баланса антиоксидантов и прооксидантов в сторону последних является у биохимиков предметом острой дискуссии. Считают, что активные формы кислорода играют значительную роль в обеспечении нормальной физиологической активности клеток, участвуют в синтезе ряда биологически активных метаболитов, являются активаторами митогенеза, клеточной пролиферации, дифференциации и эмбриогенеза. (Burdon R.N., 1994; Дубинина Е.Е., 2001; Турпаев К.Т., 2002; Ванюшин Б.Ф. и соавт., 2003). Активные метаболиты кислорода могут индуцировать транскрипцию ряда генов, в частности, в растениях они могут выступать в качестве вторичных внутриклеточных посредников, участвующих в активации фактора транскрипции NF-xB, вызывающего экспрессию генов, кодирующих некоторые цитокинины. (Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., 1993).
Таким образом, активные формы кислорода могут являться важными сигнальными молекулами в регуляции различных клеточных процессов. В связи с этим в данной работе были поставлены эксперименты по изучению влияния in vitro кислородных радикалов на пролиферацию клеток культуры ткани полисциас. В работе использовали различные концентрации перекиси водорода и феназина метасульфата (генератор супероксидных радикалов) на пролиферацию культивируемых in vitro растительных клеток. Было установлено, что при культивировании каллусов полисциас в среде, содержащей перекись водорода в концентрации 5 мкмоль, содержание ДНК в клетках повышалось на 22%. При концентрации перекиси водорода в 10 мкмоль содержание ДНК в клетках оставалось на уровне контрольных значений. Увеличение концентрации перекиси водорода до 20 - 500 мкмоль приводило к снижению пролиферативной активности клеток на 18-20%. Присутствие в среде культивирования феназина метасульфата оказывало следующее влияние на пролиферацию клеток in vitro: при концентрации 2, 4 и 8 мкмоль препарата наблюдали увеличение содержания ДНК в клетках, соответственно, на 18%, 20% и 58%.
