Введение к работе
Актуальность проблемы
Гриппозная инфекция занимает значительное место в инфекционной патологии человека. По данным ВОЗ, грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) достигают 95% всех случаев инфекционных заболеваний (Frank е.а., 1970; Baker, 1987) При обычных ежегодных эпидемиях гриппом болеет до 20% населения земного шара, а во время пандемий это число может возрастать в 3-4 раза В развитых странах грипп является основной причиной смертности от инфекционных заболеваний (Nicholson, 2003). В России ежегодно регистрируют от 27,3 до 41,2 млн. случаев заболеваемости гриппом и другими ОРВИ (Карпухин, 1985) Основным средством борьбы с вирусными инфекциями, в том числе и с гриппом, остается вакцинация (Смородинцев, 1949, 1984; Glezen, 1980; Rudenko е.а., 1993; Couch, 2000, Munoz е.а., 2000 и др.). Наиболее перспективными в индукции защитного иммунитета являются живые гриппозные вакцины (ЖГВ) (Александрова, Климов, 1994; Wareing е.а., 2001).
В настоящее время основным субстратом для подготовки как живых, так и инактивированных гриппозных вакцин являются развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ). На состоявшемся в 1995 году в Женеве очередном совещании ВОЗ обсуждались вопросы о целесообразности перевода производства гриппозных вакцин на восприимчивые культуры клеток млекопитающих. Особо отмечалось, что «...в случае возникновения пандемии будет необходимо в кратчайшие сроки существенно увеличить объемы производства вакцин, что трудно осуществить при использовании в качестве субстрата РКЭ, т.к. поставка на производство высококачественных эмбрионов требует заблаговременного планирования...» (Меморандум ВОЗ, 1995) По итогам совещания были вынесены рекомендации разработать в ближайшее время подходящие клеточные системы для подготовки и культивирования гриппозных вакцин. Наиболее перспективными в этом плане клеточными линиями были названы перевиваемые культуры MDCK и Vero.
Многие научные лаборатории и фармацевтические компании мира в настоящее время занимаются разработкой культуральных инактивированных гриппозных вакцин, и вакцины, подготовленные в культурах Vero (Influject, Baxter) и MDCK (Influvac ТС, Solvay) уже лицензированы для сезонной профилактики гриппа в Европе (Whilschut е а., 2006). Не менее актуален перевод производства живой гриппозной вакцины с куриных эмбрионов на клеточные культуры, что позволит нарабатывать большие объемы вакцины для иммунизации всех групп населения.
Штаммы для живых гриппозных вакцин готовят методом реассортации между современным эпидемическим вирусом и хорошо охарактеризованным лабораторным штаммом -донором аттенуации. Доноры аттенуации для отечественной ЖГВ были получены с помощью серийных пассажей эпидемических вирусов гриппа в куриных эмбрионах при пониженной до 25С температуре, в результате чего они приобрели способность, бессимптомно репродуцируясь
4 в верхних дыхательных путях человека, стимулировать выработку противовирусного иммунитета (Alexandrova, Smorodintsev, 1965; Александрова и др, 1968, 1994, 1997). Вакцинный штамм должен наследовать от эпидемического вируса два поверхностных антигена - гемагглютинин и нейраминидазу, а от донора аттенуации шесть внутренних генов (формула генома 6:2) (Меморандум ВОЗ, 1987). Также допускается присутствие в геноме вакцинного штамма третьего гена от эпидемического родителя (формула генома 5:3) (Приказ №156/29 Минздрава РФ, 1998). Если методика подготовки реассортантных вакцинных штаммов в РКЭ описана в литературе достаточно подробно (Александрова, 1977; Полежаев и др., 1974, 1978, 1980; Сох е.а., 1979 и др ), то соответствующая методика подготовки вакцинных реассортантов в культуре клеток на данный момент отсутствует.
Таким образом, в свете всего вышеизложенного, основной целью настоящей работы явилась разработка условий получения реассортантных штаммов для живой гриппозной вакцины в культуре клеток MDCK.
Для решения поставленной цели в задачи исследования входило: 1 Изучение особенностей репродукции эпидемических вирусов гриппа А и В, а также холодоадаптированных доноров аттенуации в культуре клеток MDCK по сравнению с общепринятым субстратом - развивающимися куриными эмбрионами.
Разработка оптимальных условий для скрещивания эпидемических вирусов гриппа А и холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) в культуре клеток MDCK и последующей селекции реассортантных вакцинных штаммов.
Разработка новых, культуральных, маркеров аттенуации для первичного скрининга реассортантов-кандидатов в вакцинные штаммы.
Изучение генетической стабильности «яичных» и «культуральных» вакцинных штаммов после их пассирования в куриных эмбрионах и/или в культуре клеток MDCK.
Изучение эффективности использования культуры клеток MDCK для изоляции вакцинных штаммов ЖГВ от привитых лиц.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Современные эпидемические вирусы A(H3N2), выделенные и накопленные в РКЭ, могут в процессе пассирования в культуре клеток MDCK утрачивать способность активно размножаться в куриных эмбрионах, а также чувствительность к эритроцитам кур. Для эпидемических вирусов гриппа A(H1N1) и В, а также ХА доноров аттенуации такого явления не наблюдалось.
Стандартная схема реассортации, позволяющая эффективно изолировать в системе куриных эмбрионов реассортанты с вакцинной формулой генома, является неэффективной при получении вакцинных штаммов ЖГВ в культуре клеток MDCK. Модификация данной методики, а именно увеличение соотношения инфекционных титров скрещиваемых вирусов
до 10000000 (донор аттенуации) . 1 (эпидемический вирус) позволило регулярно получать
реассортанты с вакцинной формулой генома в культуре клеток 3. Четкие различия в проявлении фенотипических свойств между эпидемическими и
холодоадаптированными вирусами гриппа в культуре клеток MDCK позволяют
использовать данные особенности в качестве культуральных маркеров аттенуации при
первичном скрининге вакцинных штаммов для ЖГВ. 4 Вакцинные штаммы ЖГВ, подготовленные в куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK,
являются генетически стабильными после их пассирования в РКЭ или в культуре клеток не
только при оптимальной, но и при повышенной температуре инкубации.
Научная новизна работы
Впервые показано, что современные вирусы гриппа A(H3N2) в процессе пассирования в культуре клеток MDCK утрачивают способность активно репродуцироваться в системе РКЭ, а также сродство к куриным эритроцитам. Вирусы гриппа A(H1N1), В, а также ХА доноры аттенуации сохраняют эти свойства при пассировании в клеточном субстрате.
Разработаны условия получения в культуре клеток MDCK вакцинных реассортантов, наследующих все гены, кодирующие внутренние белки вириона, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).
Впервые получены данные о проявлении в культуре клеток MDCK температуроустойчивого (non-ts) фенотипа эпидемических вирусов гриппа А и В, чувствительных к повышенной температуре инкубации в системе куриных эмбрионов (ts фенотип).
Показано, что культура клеток MDCK является более чувствительной системой по сравнению с куриными эмбрионами для выявления температурочувствительности донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Ts фенотип донора аттенуации В/СССР/60/69 определяется в равной степени в РКЭ и культуре клеток MDCK. Свойство культуры клеток MDCK выявлять различия в температурочувствительности эпидемических и ХА вирусов гриппа позволяет рекомендовать его в качестве нового ts маркера аттенуации.
Впервые показана стабильность фенотипических признаков и сохранность кодирующих мутаций у вакцинных штаммов ЖГВ, пассированных в куриных эмбрионах и/или культуре клеток MDCK не только при оптимальной, но и при повышенной температуре.
Впервые изучена эффективность использования культуры клеток MDCK для выделения вакцинных штаммов от лиц, привитых отечественной живой гриппозной вакциной
Практическая значимость работы
Предложенная в работе методика получения реассортантных штаммов для культуральной живой гриппозной вакцины может быть использована в области практического здравоохранения для производства этого препарата.
Представленные культуральные ts и са маркеры аттенуации могут быть использованы как факторы отбора вакцинных штаммов для живой гриппозной вакцины, производимой в культуре клеток, а также на развивающихся куриных эмбрионах.
Высокая чувствительность культуры клеток MDCK позволяет адекватно оценивать приживляемость вакцинных штаммов у лиц, привитых живой гриппозной вакциной, ее генетическую стабильность и трансмиссивность.
Штаммы А/17/Калифорния/04/6(НЗ^) и А/17/Малайзия/04/11 (H3N2), полученные на развивающихся куриных эмбрионах в ходе выполнения работы, были переданы для производства живой гриппозной вакцины в НПО «Микроген», г. Иркутск.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы представлены на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), Международной конференции «The second European Influenza Conference» (St. Julian, Malta, 2005), Конференции молодых ученых, посвященной 115-летию ГУ НИИЭМ РАМН (Санкт-Петербург, 2005), 5-й Научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006), Научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Вчені майбутнього» (Одесса, 2006), Межвузовской научной конференции «XXXIV неделя науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2006).
Диссертационная работа была апробирована на заседании научной конференции отдела вирусологии им. акад. А.А. Смородинцева ГУ НИИЭМ РАМН 27 декабря 2006 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 статей и 7 тезисов докладов. Поданы заявки на 2 патента Российской Федерации.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4-х глав), описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 121 странице машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками и 24 таблицами. Список литературы содержит 229 наименований, в том числе 57 отечественных и 172 зарубежных.
Личный вклад автора заключается в непосредственном участии в выполнении всех разделов данного исследования - изучении фенотипических характеристик эпидемических и холодоадаптированных вирусов гриппа в куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK, получении ряда реассортантов вирусов гриппа в культуре клеток MDCK и определении состава их генома методом ПЦР-рестрикционного анализа, исследовании генетической стабильности вакцинных штаммов ЖГВ, выделении и типировании вакцинных изолятов от детей, привитых живой гриппозной вакциной, проведении статистической обработки и анализе полученных
7 данных. Автор признателен д.б.н. Киселевой И.В. за предоставление материалов по составу генома реассортантов, подготовленных в развивающихся куриных эмбрионах, к.б.н. Ларионовой Н.В за помощь в изучении фенотипических характеристик ряда эпидемических вирусов гриппа.
