Введение к работе
1. 1.1. Актуальность работы
Перспективным направлением, которое основывается на современных успехах в молекулярной биотехнологии, является разработка вакцин с использованием методов генной инженерии. Возможности дальнейшего совершенствования традиционных вакцин, если не исчерпаны, то весьма ограничены. С начала 90-х гг. научные лаборатории начали все активнее разрабатывать ДНК-вакцины против многих инфекционных (ВИЧ, бешенство, ЛДР, малярия и др.) и онкологических болезней (C.N. Baxevanis, 2010; N.G. Commander, 2010). Поскольку ДНК-вакцины обеспечивают синтез иммунногенных белков клетками самого организма, они способствуют формированию как гуморального, так и клеточного иммунитета (G. Lorenzo, 2010). Усиленно развивается и генная терапия.
Как при создании ДНК-вакцин, так и для целей генной терапии требуется разработка стратегии и тактики введения ДНК в клетки. Плазмидная ДНК поглощается клетками животных в небольшом количестве (0,1-0,2%), а большая ее часть быстро разрушается (Ю.З. Гендон, 1975; Б.Г. Орлянкин, 1998; В.Д. Солодовник, 1980), т.к. в условиях in vivo чужеродная ДНК нестабильна из-за быстрой деградации нуклеаза-ми (D.D. Dunlap, 1997) - ферментами, расщепляющими нуклеиновые кислоты. Поэтому многочисленные научные исследования в этой области посвящены разработке систем доставки ДНК в клетку. По своей природе они делятся на микробиологические (аденоассоциированные, ретровирусные, вирус осповакцины, бактериальные) и искусственные системы переноса генетического материала (физические и химические).
Наиболее безопасным и перспективным подходом для повышения эффективности доставки генов к разнообразным клеткам-мишеням является конструирование химическими методами искусственных комплексов ДНК с какими-либо носителями. Появление новых полимеров открыло широкие возможности конструирования синтетических систем переноса генов с заданными характеристиками (H.L. Davis, 1993; A. Lanzavecchia, 1993).
В последнее десятилетие интенсивно изучается возможность и перспективы применения биодеградируемых биосовместимых микросфер как эффективной сис-
темы доставки вакцин (М.С. De Oliveira, 2001; Н. Baumler, 2005; D.W. Pack, 2005; Emir Baki, Denkbas, 2006; C.J. Park, 2009).
Таким образом, значительное появление в последние годы работ в области вакцинологии и многочисленные исследования, направленные на разработку методов микрокапсулирования, свидетельствуют об актуальности и перспективности данного направления.
1.2. Степень разработанности проблемы
Разработке методов микрокапсулирования белков посвящены работы Г.Б. Су-хору кова (1998 г., 2005 г.), Д.В. Володькина (2004 г.), Т.Н. Бородиной (2008 г.). Авторами предложен метод послойной адсорбции полиэлектролитов для формирования мембраны микрокапсул. В работе Т.Н. Бородиной (2008 г.) показана принципиальная возможность иммобилизации ДНК в полиэлектролитные микрокапсулы. Однако, не изучены вопросы эффективности сорбции карбонатно-кальциевыми частицами геномной и плазмидной ДНК при формировании микрокапсул, деградации микрокапсул in vivo, кинетики синтеза антител при введении инкапсулированной плазмидной ДНК, зависимости иммунного ответа от способа введения и полиэлектролитного состава микросфер.
1.3. Цель и задачи исследований
Целью данной работы является разработка системы доставки генетического материала в виде полиэлектролитных биодеградируемых микросфер (микрокапсул) в клетки макроорганизма, оценка биологических свойств микрокапсулированной ДНК и возможности применения этого метода в ветеринарии.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
определить эффективность сорбции ДНК различного молекулярного веса и структуры на микрочастицах карбоната кальция;
подобрать биосовместимые и биодеградируемые полиэлектролиты, позволяющие получать мембрану микрокапсул на поверхности сферических микрочастиц карбоната кальция методом послойной адсорбции (Layer-by-Layer).
разработать высокоэффективный способ получения микрокапсулированной ДНК на основе микрочастиц карбоната кальция методом послойной адсорбции полиэлек-
тролитов;
изучить эффективность доставки в клетки микрокапсулированной геномной ДНК вируса болезни Ауески в условиях in vitro и in vivo;
исследовать кинетику синтеза вирус-специфических антител на введение микро-капсулированных плазмид;
оценить влияние микрокапсулированных препаратов на содержание иммунорегу-ляторных лимфоцитов СД4+ и СД8+ в селезенке цыплят;
изучить влияние различного композиционного состава микросфер на иммунный ответ;
изучить биодеструкцию микрокапсул in vivo.
1.4. Научная новизна результатов исследований
Разработан способ доставки ДНК в макроорганизм путем введения иммобилизованной ДНК в биодеградируемые и биосовместимые микросферы, мембрана которых состоит из природных модифицированных полисахаридов. Впервые в России гистологическими методами установлено, что микрокапсулы состава (ДЕАЕ-dextran/Car)3 сохраняются в организме до 23 суток (срок наблюдения). Показано, что микрокапсулы, содержащие плазмиды, кодирующие гены NP и НА вируса гриппа А, при введении в организм являются иммунологически безвредными, поскольку не вызывают патологических изменений в структуре популяции регуляторных (СД4+ и СД8+) лимфоцитов. Впервые в России установлено, что полиэлектролитный состав микрокапсул влияет не только на уровень синтеза, но и на кинетику синтеза специфических антител. Новизна исследований подтверждена патентом на изобретение № 2409384.
1.5. Практическая значимость работы
Разработаны «Методические рекомендации по иммобилизации плазмидной ДНК в полиэлектролитные микрокапсулы», которые рассмотрены, одобрены на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН и утверждены секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 24.10. 2009 г.
1.6. Апробация работы
Результаты исследований, выполненных по теме диссертационной работы
представлены, заслушаны и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВ-ВиМ Россельхозакадемии (Покров 2006-2009гг.), Международном конгрессе биоорганической химии (Москва, 2008г.), Международных научно-практических конференциях ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (Покров, 2008г.), ФГУ ВНИИЗЖ (Владимир, 2008г.), УГСХА (Ульяновск, 2008-2009гг.), а также представлены на XY International Workshop on Bioencapsulation, 2007,Vienna, Austria и The XVI International Conference on Bioencapsulation (Dublin, Ireland 2008). 1.7. Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите
В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, занимающейся проблемами противовирусного иммунитета, инфекционности вирусов, разработкой мер и средств предупреждения вызываемых вирусами заболеваний, включающей область исследований: стратегию вирусного генома; разработку мер предупреждения, терапии и иммунопрофилактики вирусных инфекций, в диссертационной работе проведены исследования инфекционной активности вируса болезни Ауе-ски, вирусологическими методами подтверждено специфическое развитие инфекционного процесса при инокуляции микрокапсулированной ДНК в опытах in vivo и in vitro, серологическими методами выявлены вирус-специфические антитела в сыворотках крови животных, инокулированных препаратами плазмидной ДНК. Используя стратегию вирусного генома возбудителя болезни Ауески, была разработана лабораторная модель для оценки эффективности переноса ДНК вируса болезни Ауески в эукариотические клетки.
В соответствии с формулой специальности 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии), охватывающей область науки об использовании живых организмов и биологических процессов в производстве с целью получения полезных продуктов в ветеринарии, включающей область исследований: сгущение биомассы, выделения, очистки, контроля и хранения конечных продуктов; иммунологические исследования в прикладной вирусологии и цитологии; иммунную биотехнологию; биотехнологию препаратов для животноводства, в диссертационной работе проведено накопление, выделение и очистка плазмидной и геномной ДНК, разработаны методы иммобилизации генно-инженерных конструкций (плазмидных ДНК) в макропористые микрочастицы СаС03 и доставки их в клетки макроорганизма с сохра-
нением их биологических свойств, исследован иммунный ответ на введение натив-ных и микрокапсулированных ДНК, изучены процессы биодеструкции микрокапсул in vivo и in vitro.
Полученные соискателем научные результаты соответствуют пунктам 3, 7, 10 паспорта специальности 03.02.02 Вирусология и пунктам 1, 4, 7, 9, 11 паспорта специальности 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии).
1.8. Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получен 1 патент.
1.9. Структура и объем диссертации
