Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Краткая характеристика возбудителя 12
1.2. Методы лабораторной диагностики и мониторинга природных очагов крымской геморрагической лихорадки 21
Глава 2. Собственные исследования материалы и методы 33
2.1. Вирусные штаммы, используемые в работе 33
2.2. Сбор, учет, хранение и доставка полевого материала 33
2.2.1. Сбор доставка и хранение проб клещей 33
2.3. Сбор, обработка и хранение сывороток крови людей 34
2.4. Исследование материала методом ИФА 35
2.4.1. Подготовка проб для исследований 35
2.4.2. ИФА на выявление вирусных антигенов 35
2.5. Исследование материала с помощью полимеразной цепной реакции 36
2.5.1. Подготовка проб для исследований 36
2.5.2. Проведение ПЦР 37
2.5.3. Получение рекомбинантного положительного контрольного образца 42
2.6. Методы статистической обработки результатов 46
Глава 3. Создание и совершенствование тест-системы для выявления рнк вируса крымской-конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР 47
3.1. Выбор олигонуклеотидных праймеров на основе анализа генома вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки
3.2. Разработка оптимальных условий ПЦР
3.3. Разработка схемы подготовки проб для ОТ-ПЦР
3.4. Создание положительного контрольного образца
3.5. Характеристика тест-системы для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразнои цепной реакции 57
Глава 4. Определение диагностической ценности тест-системы для выявления рнк вируса ккгл методом обратной транскрипции и полимеразнои цепной реакции 62
4.1. Программа комиссионных испытаний 63
4.2. Лабораторных контроль серий препарата и исследование вирусных штаммов и материала, искусственно инфицированного вирусом ККГЛ 64
4.3. Обследование полевого материала 69
4.4. Исследование сывороток крови больных КГЛ 69
4.5. Оценка тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР 73
Глава 5. Применение разработанной тест-системы для выявления рнк вируса ккгл методом от-пцр при мониторинге природных очагов КГЛ 75
5.1. Апробация тест-системы в ходе мониторинга природных очагов КГЛ 75
5.2. Использование тест-системы для изучения циркуляции вируса ККГЛ 19
Заключение 84
Выводы 88
Список использованной литературы 89
- Методы лабораторной диагностики и мониторинга природных очагов крымской геморрагической лихорадки
- Сбор, обработка и хранение сывороток крови людей
- Характеристика тест-системы для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразнои цепной реакции
- Оценка тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР
Введение к работе
Актуальность проблемы. В Российской Федерации в последние годы отмечается ухудшение эпидемиологической ситуации по арбовирусным природно-очаговым инфекциям, что обусловлено резкой активизацией эпизоотического процесса в природных очагах, вторжением человека в неосвоенные или малоосвоенные регионы, а также уровнем организации и эффективности эпидемиологического надзора (Онищенко Г.Г. и др., 2000, 2005).
Глубокие экологические трансформации (потепление климата, сокращение лесного фонда и земель сельскохозяйственного назначения, восстановление степных ландшафтов в Северо-Западном Прикаспии и т.д.), наблюдавшиеся в течение последних лет на юге России, в том числе в регионе Нижнего Поволжья, привели к изменению видового состава и удельного веса отдельных носителей и переносчиков арбовирусов (Платонов А.Е., 2006). Это послужило предпосылкой для расширения ареала возбудителей ряда арбовирусных инфекций и формирования новых природных очагов. При этом произошло особенно резкое ухудшение эпидемиологической обстановки по Крымской геморрагической лихорадке (КГЛ). Возникновение вспышек этого заболевания в 1999-2006 гг. было отмечено не только на эндемичных территориях, но и в тех районах, где циркуляция вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) ранее не наблюдалась (Волгоградская область, Республики Калмыкия, Ингушетия, Дагестан) (Бутенко A.M., Ларичев В.Ф., 2004, Онищенко Г.Г. и др., 2005). За эти годы на юге европейской части России (в Астраханской, Волгоградской, Ростовской областях, Ставропольском крае и других регионах) было зарегистрировано 769 случаев заболеваний людей КГЛ. Высокая летальность,
тяжелое клиническое течение, социальная значимость болезни определяют необходимость совершенствования методов ее лабораторной диагностики и мониторинга природных очагов КГЛ.
В настоящее время для лабораторной диагностики КГЛ используются методы, отличающиеся высокой чувствительностью, специфичностью и позволяющие проводить анализ большого количества образцов за непродолжительное время (Карань Л.С. и др., 2003, Смирнова С.Е., 2003). В первую очередь это различные модификации ИФА. Существенным недостатком ИФА является необходимость исследования парных сывороток крови взятых у больного в динамике заболевания, что значительно снижает диагностическую ценность метода. Кроме этого, чувствительность и специфичность ИФА ниже, чем методов генодиагностики, и, в частности, ПЦР. Создание и практическое внедрение ПЦР-тест-системы, предназначенной для выявления РНК вируса ККГЛ, будет способствовать решению многих актуальных задач - быстрой постановке предварительного диагноза, эффективной детекции возбудителей в биологическом материале и объектах внешней среды, что позволит адекватно оценить сложившуюся эпидемиологическую ситуацию и своевременно проводить противоэпидемические мероприятия.
Цель работы - разработка и внедрение в практику эпидемиологического обследования тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР.
Основные задачи исследования:
Разработать тест-систему для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР.
Провести апробацию тест-системы на полевом и клиническом
материалах.
Разработать нормативную документацию к тест-системе (фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению, внутренняя и внешняя маркировки, пояснительная записка).
Провести Государственные испытания тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ.
Сконструировать рекомбинантный положительный контрольный образец к созданной тест-системе.
Изучить возможность использования ПЦР-анализа при обследовании территорий с целью выявления циркуляции вируса ККГЛ и мониторинга природных очагов КГЛ.
Научная новизна работы
Впервые разработана тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом
ОТ-ПЦР «ГенКонго». Чувствительность тест-системы 5x103 ГЭ/мл,
специфичность - 100 %, воспроизводимость результатов -100%. Проведена ее апробация на полевом и клиническом материалах, определена диагностическая ценность в сравнении с ИФА и вирусологическими методами. Продемонстрирована эффективность использования ПЦР-анализа в ходе эпизоотологического обследования природных очагов КГЛ для детекции вируса ККГЛ у основных носителей и переносчиков (клещей родов Hyalomma, Rhipicephalus, Dermacentor и др.).
Практическая значимость работы
Проведены Государственные приемочные испытания разработанной тест-системы для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки
методом ОТ-ПЦР. Результаты Государственных испытаний одобрены на ученом совете ГИСК им. Л.А. Тарасевича (протокол № 14 от 19.10.04). Получены рекомендации комитета МИБП о регистрации препарата «Тест-система для выявления РНК вируса Крымской- Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР» в Российской Федерации и внедрении его в практику здравоохранения (протокол № 5 от 28.07.05).
На тест-систему для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом ОТ-ПЦР разработана нормативно-техническая документация (фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению, внутренняя и внешняя маркировки, пояснительная записка).
В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (г. Саратов) депонирован генетически модифицированный штамм Е.соН TGI (pCCHF), на основе которого был сконструирован положительный контрольный образец к разработанной ПЦР-тест-системе и стандартный образец предприятия (СОПк+), используемый при контроле чувствительности и специфичности диагностического препарата в условиях производства.
ПЦР-тест-система апробирована при обследовании территории Саратовской области с целью выявления циркуляции вируса ККГЛ, а также при мониторинге природных очагов КГЛ в Волгоградской и Астраханской областях.
Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах подготовки и усовершенствования специалистов по особо опасным инфекциям в РосНИПЧИ «Микроб» и на курсах повышения квалификации «ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов».
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы - «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы, по договорам с ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (г. Москва) «Выявление и анализ специфичных участков геномов вирусов Западного Нила и Конго-Крымской геморрагической лихорадки, создание ПЦР-тест-систем, разработка нормативной документации» и «Сертификация ОТ-ПЦР-тест-систем для выявления РНК вирусов Крымской-Конго геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила. Разработка сиквенс-систем и алгоритма комплексной лабораторной диагностики Крымской геморрагической лихорадки и лихорадки Западного Нила».
Основные положения, выносимые на защиту
На основе праймеров Wkgl и Wkg2, фланкирующих фрагмент размером 138 н.п. гена, отвечающего за синтез белка, входящего в состав нуклеопротеина, и локализованного в области консервативного участка S-сегмента разработана тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР.
Разработанная ПЦР-тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ характеризуется чувствительностью 5х103 ГЭ/мл, специфичностью - 100 %, воспроизводимостью результатов - 100 % и позволяет детектировать возбудителя КГЛ в биологическом материале и объектах внешней среды.
На основе рекомбинантной плазмиды pCCHF штамма Е. coli TGI (pCCHF) разработан положительный контроль к тест-системе и стандартный образец предприятия (СОПк+).
4. ПЦР-анализ может быть использован при эпидемиологическом
обследовании территорий с целью изучения ареалов вируса ККГЛ и для мониторинга природных очагов КГЛ.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены и обсуждены на ежегодных
1. - - - ТЛ . ЛТТГПТТТІ 1 f г~ ҐГЛ r\f\f\f\ ґ\Є\Г\л лллл ллл^
научных конференциях гиелтічуі «микрии» (параши, zuuu, zuui, імкіі., zuut, 2005, 2006 гг.) и на научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» - Астрахань, 2006 г., а также представлены на 1-й Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций», Саратов, 2000 г.; научно-практической конференции «Актуальные аспекты природноочаговых болезней», посвященной 80 - летаю Омского НИИПИ.- Омск, 2001.; Юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского НИПЧИ. - Ставрополь, 2002.; VIII съезде Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2002 г.; 5-ой Всероссийской научно - практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней». - Москва, 2004 г..; VI Межгосударственной научно - практической конференции государств -участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств - участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях». - Волгоград, 2005 г.; VII Российском съезде инфекционистов «Итоги и перспективы диагностики и лечения инфекционных больных». - Нижний Новгород, 2006 г.
12 Публикации
Основные положения диссертации отражены в 8 опубликованных научных работах, в том числе в 2 изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации и 4 - в сборниках материалов Международных и Всероссийских конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего ПО отечественных и 45 зарубежных источников. Общий объем работы составляет 112 страниц компьютерного текста, иллюстрированного 9 таблицами и 8 рисунками.
Методы лабораторной диагностики и мониторинга природных очагов крымской геморрагической лихорадки
Диагностика Крымской геморрагической лихорадки строится на сочетании эпидемиологических (наличие природного очага инфекции на определенной территории, сезонность, укус клеща и т.д.) и клинических данных (лихорадка, геморрагические проявления и т.д.). Б связи с тем, что симптомы геморрагических лихорадок часто очень схожи между собой, диагностировать КГЛ на основе клинических признаков весьма затруднительно. Наиболее сложными для диагностики КГЛ являются с третьего по пятый дни болезни. Клинические проявления в предгеморрагическом периоде и изменения состава периферической крови еще неспецифичны и могут наблюдаться при заболеваниях разной инфекционной природы (Смирнова С.Е., 2003). В связи с этим большое значение имеют методы лабораторной диагностики. Лабораторная диагностика КГЛ основана на выявлении вируса или его структурных компонентов, исследовании динамики титра антител и проводится с использованием вирусологических, иммунологических и молекулярно-генетических методов (Львов Д.К. и др. 1989). 1. Вирусологические методы Одним из основных вирусологических методов является изоляция вируса из клинического материала, с последующей идентификацией. Вирусологические исследования проводятся в специальных лабораториях, оснащенных необходимым оборудованием.
Это наиболее дорогостоящие и трудоемкие исследования. Окончательный результат может быть дан только через 10-14 дней. Однако, до настоящего дня вирусологические методы остаются «золотым стандартом» и являются наиболее достоверными (Львов Д.К. и др., 1989, Вышемирский О.И. и др., 2001). Материалом для выделения вируса ККГЛ является цельная кровь, плазма, сгусток крови, собранные в ранние сроки от начала заболевания (до 7 дня), то есть в период вирусемии. Эффективность выделения вируса в этот период очень высока и приближается к 100 %. Вирусемия у человека наблюдается на протяжении всего лихорадочного периода болезни (до 5 дней). При нормализации температуры тела возможность выделения вируса резко снижается, а при появлении в крови вирусспецифических иммуноглобулинов класса G (10-14 день от начала болезни), становится невозможной. У погибших людей вирус ККГЛ выявляли в головном мозге, костном мозге, лимфатических узлах, печени, селезенке и других органах (Львов Д.К. и др., 1989). Одним из самых эффективных способов выделения вируса ККГЛ является метод интрацеребрального заражения новорожденных белых мышей (нбм) или крыс биологическим материалом (Бутенко A.M., 1970, Львов Д.К. и др., 1989, Смирнова С.Е., 2003). Во время эпидемической вспышки 2000 г. в Ставропольском крае с использованием этого метода, из проб крови 3 больных, взятой в лихорадочный период на 3-5 день от начала заболевания были выделены 3 штамма вируса ККГЛ: LEIV 29209 Ст, LEIV 29219 Ст и LEIV 29225 Ст (Колобухина Л.В. и др., 2001). Летом 2000 г. в Волгоградской области от больного, умершего от ККГЛ, был выделен штамм вируса ККГЛ, получивший название LEIV 29175 Vlg (Вышемирский О.И. и др, 2001). Вирус ККГЛ также можно выделять с использованием различных клеточных культур животного происхождения: Vero - Е6, CER или LLC-MK2. Но эффективность такого выделения является более низкой, чем при использовании с этой же целью нбм.
Кроме того, вирус ККГЛ не вызывает в вышеперечисленных клеточных культурах выраженного цитопатического действия, а его накопление происходит после длительною периода адаптации в условиях in vitro (Львов Д. К. и Др., 1989). Вышемирский О.И. с соавт. (20016) в своей работе предложили использовать для изоляции вируса ККГЛ культуру клеток SW-13, которые происходят от клеток аденокарциноми надпочечника человека и высоко чувствительны к ряду вирусов. Авторами показано, что вирус ККГЛ может быть успешно выделен на клетках этой линии и оказывает на них цитопатогенное действие. 2. Иммунологические методы Иммунологические методы в лабораторной диагностике КГЛ используют для выявления антител и антигенов в сыворотках крови людей и КРС, органах, а также для первичной идентификации выделенных штаммов вируса ККГЛ. Для идентификации штаммов чаще всего используют электронно-микроскопические исследования, реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию непрямой гемагглютинации (РИГА) и иммуноферментный анализ (ИФА). Так же ИФА использовали при идентификации штаммов вирусов, выделенных в Ставропольском крае (Василенко Н.Ф., 2003) и Волгоградской области (Вышемирский О.И. и др., 2001). Для выявления антигена в настоящее время применяют метод флуоресцирующих антител (МФА), РИГА и ИФА.
Сбор, обработка и хранение сывороток крови людей
Кровь для исследования брали асептически из локтевой вены в объеме 5-Ю мл и помещали в стерильные маркированные пробирки, замораживали, при этом сыворотку крови отделяли от сгустка. Пробы, взятые на исследование, хранились в течение 24 ч. при температуре 4 С. При более длительном хранении пробы замораживали при температуре минус 20-40 С. После однократного размораживания дальнейшему хранению сыворотки не подвергались. Всего было исследовано 31 образец сыворотки крови людей с подтвержденным диагнозом «Крымская геморрагическая лихорадка» и 238 образцов сывороток крови людей с заболеваниями вирусной природы. 2.4. Исследование материала методом ИФА 2.4.1. Подготовка проб клещей Клещей, сгруппированных в пулы, промывали однократно в 70 этанолом, дважды - в растворе Хенкса с антибиотиками и растирали в охлажденных фарфоровых ступках с добавлением среды Хенкса. Полученные 10 % суспензии центрифугировали при 4 С в течение 10 мин при 2000 об/мин. 2.4.2. ИФА на выявление вирусных антигенов Анализ суспензий клещей и сывороток крови людей на присутствие вирусного антигена выполнялись согласно
Инструкции по применению коммерческих диагностических наборов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, РАМН (г. Москва). Оптическую плотность раствора в лунках определяли на фотометре Мультискан (Россия). Пробу считали положительной, если значение ее оптической плотности было в 2,1 раза больше, чем значение оптической плотности отрицательного контроля. ИФА на выявления иммуноглобулинов класса G в сыворотках крови людей Образцы сывороток людей исследовали на наличие специфических IgG - антител к вирусу ККГЛ. После выполнения основных этапов, включающих сенсибилизацию и блокировку, в лунки планшета вносили специфические антигены в объеме 100 мкл. Сорбцию вирусных антигенов проводили в течение 1,5 ч при 37 С. После этапа промывания планшета, в лунки добавляли исследуемые сыворотки больных в разведениях 1:100 с последующей двухчасовой инкубацией в термостате. Затем лунки промывали 6 раз, после чего в них вносили пероксидазный конъюгат - прошв IgG человека. Дальнейшие процедуры, связанные с регистрацией реакции, рассмотрены выше. Положительными контролями служили сыворотки крови, содержащие IgG в разведениях, соответствующих разведениям исследуемых сывороток. Для постановки отрицательных контролей использовалась сыворотка, не содержащая специфических антител. Пробу считали положительной, если значение ее оптической плотности было в 2,1 раза большим, чем значение оптической плотности отрицательного контроля. 2.5. Исследование материала с помощью полимеразной цепной реакции При исследовании проб на наличие РНК вируса ККГЛ применяли обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР). 2.5.1. Подготовка проб для исследований Штаммы вирусов Для исследования чистых культур вирусных штаммов, содержащихся в мозговой ткани мышей-сосунков, образцы головного мозга животных весом 1 г помещали в пластиковые микропробирки с завинчивающимися крышками объемом 1,5 мл, добавляли 1мл 0,9 % раствора натрия хлорида.
Плотно закрывали крышки пробирок и тщательно перемешивали на вортексе до получения гомогенной суспензии. Затем суспензии центрифугировали при 12000 об/мин в течение 2 мин. Из надосадочной жидкости по 0,1 мл переносили в микропробирки объемом 1,5 мл. Оставшийся материал хранили при температуре не выше минус 70 С в течение 1 года. Пробы клещей Пробы клещей растирали в охлажденной стерильной фарфоровой ступке с 0,5- 1,0 г охлажденного стерильного стеклянного порошка, добавляли 1-2 мл охлажденного 0,9 % раствора натрия хлорида. Затем переносили по 1,0 мл жидкой фазы в пластиковые микропробирки объемом 1,5 мл. Подготовленные образцы центрифугировали в течение 5 мин при 12000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали для выделения РНК, для чего отбирали 0,1 мл образца. Суспензию хранили при температуре минус 70 С в течение 1 года.
Характеристика тест-системы для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразнои цепной реакции
В результате проделанной работы нами был разработан метод детекции вируса ККГЛ с помощью ПЦР и предложена «Тест-система для выявления РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции «ГенКонго». Раствор №1- лизирующий раствор, содержащий 6 М гуанидинтиоцианат («Sigma», США), трис-(оксиметил)-аминометан («ICN», США), этилендиаминотетрауксусной кислоты динатриевая соль («Sigma», США), тритон Х-І00 («Serva», Германия). Раствор №2 - раствор для отмывки сорбента, содержащий 4 М гуанидинтиоцианат и трис-(оксиметил)-аминометан. Раствор №3 - раствор для отмывки сорбента, содержащий 70 % этанол, трис-(оксиметил)-аминометан, натрия хлорид. Сорбент - водный раствор силики («Sigma», США). Ацетон. DEPC - Н20 - РНК-элюент - 0,1 % диэтилпирокарбонат («Sigma», США). 2. Комплект для постановки реакции обратной транскрипции: Ревертаза - M-MLV-обратная транскриптаза в буферном растворе («Promega», США). 2хБ - 2-х кратный буферный раствор для проведения обратной транскрипции со случайными гексануклеотидами («Sigma», США). DEPC - Н20 - РНК-элюент 0,1% диэтилпирокарбонат («Sigma», США). Н20 - вода бидистиллированная стерильная для разведения ДНК. 3. Комплект для постановки ПЦР: Праймеры Wkgl и Wkg2 - водные растворы двух олигонуклеотидных праймеров, синтезированных в автоматическом ген-синтезаторе ДНК (ЗАО «Синтол», Россия). ЮхБ - 10-кратный буферный раствор. дНТФ - водный раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (ООО «Лаборатория Медиген», Россия). Thermostar-ДНК полимераза - термостабильная ДНК-полимераза для горячего старта в буферном растворе (ЗАО «Синтол», Россия).
Положительный контроль - фрагмент ДНК размером І38 н.п., фланкированный нуклеотидными последовательностями, комплементарными праймерам Wkg 1 и Wkg 2, клонированный в векторной плазмиде pGEM («Promega», США). Н20 - вода бидистиллированная стерильная. Масло - масло вазелиновое стерильное. 4. Комплект для электрофоретической детекции продуктов ПЦР: 50хТАЕ буфер - концентрированный буферный раствор для приготовления 1 хбуфера для проведения электрофореза. Агароза - для приготовления геля («Sigma», США). Лидирующий краситель - ЮхБ для нанесения проб на гель. Тест-система предназначена для проведения 100 определений, включая контрольные образцы, надежна при хранении и транспортировке. Для проверки чувствительности и специфичности разработанной ПЦР тест-системы в зависимости от сроков и условий хранения было скомпоновано 3 набора.
Исследование проводилось с использованием тех же контрольных штаммов, с которыми работали ранее при отработке параметров полимеразной цепной реакции. Подготовку проб выполняли в соответствии с п. 2.5.1. главы 2 "Материалы и методы" настоящей работы. Экспериментальные исследования показали, что при проверке специфичной активности и чувствительности тест-системы, хранившейся в течение 1, 3, 6, 9, 12 месяцев при температуре минус 20 С чувствительность снижалась через 9-12 месяцев. Специфичность сохранялась на протяжении всего срока наблюдения (12 месяцев) и составляла 100 %. Диагностический препарат стабильно сохранял свои свойства в течение 6 месяцев (табл. 2.). Таким образом, нами была сконструирована тест-система «ГенКонго» для выявления РНК вируса ККГЛ методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, отработаны методы подготовки образцов для исследования и параметры реакции, а также определены сроки и условия ее хранения.
Оценка тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР
В результате проделанной работы показано, что одним из преимуществ тест-системы по сравнению с вирусологическими методами является скорость получения результатов при исследовании вирусных штаммов и проб биологического материала. Продолжительность ПЦР-анализа составила 6 часов при работе с вирусными штаммами и 10 часов - для проб биологического материала. Это занимает гораздо меньше времени, чем 18-24 - часовое выращивание вирусов на культуре клеток и заражение биопробных животных, за которыми ведут наблюдение в течение 5-Ю суток. После получения вирусных штаммов необходимо проводить их первичную идентификацию, что значительно увеличивает сроки получения результата. Таким образом, было показано, что сконструированная тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР обеспечивает высокий уровень диагностических исследований и может быть использована для проведения эпизоотологического мониторинга природных очагов КГЛ и как один из методов лабораторной диагностики. Отчет о проведенных Государственных приемочных испытаниях рассмотрен на Ученом Совете ГИСК им. Тарасевича (протокол №14 от 19.10.04) и утвержден Комитетом МИБП (протокол №5 от 28.07.05). Предыдущие главы диссертации посвящены вопросам разработки ПЦР-тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ « ГенКонго» и этапам Государственных приемочных испытаний этого диагностическою препарата в ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Для внедрения разработанной тест-системы в практику необходимо провести ее апробацию и проверить эффективность при исследовании полевого и клинического материала. 5.1. Апробация тест-системы в ходе мониторинга природных очагов КГЛ Диагностическую ценность тест-системы «ГенКонго» определяли при исследовании полевого материала, собранного на территориях, эндемичных по КГЛ -в Волгоградской области и Астраханской областях. Материал тестировали в ПЦР с разработанной тест-системой «ГенКонго» и в ИФА с использованием тест-системы для выявления антигенов вируса ККГЛ (производства НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН). Всего было исследовано 2408 клещей, объединенных в 316 проб. Сбор материала проводили на флаг и очесывали с грызунов и КРС. Пробы формировали в соответствии с видом, местом сбора, упитанности клещей. Обработку проб и выделение РНК проводили по методике, описанной в главе 2 «Материалы и методы». Результаты исследований представлены в таблице 6. При исследовании методом ОТ-ПЦР 368 экземпляров клещей, собранных на территории Волгоградской области и объединенных в 49 проб, было выявлено 14 положительных (28,6+6,5 %), содержащих специфическую РНК вируса ККГЛ. Тестирование этого же материала в ИФА позволило выявить 11 образцов, содержащих антиген вируса ККГЛ (22,4+6,0 %).
Всего методами ПЦР и ИФА было выявлено 17 (34,7%) позитивных проб. Антиген и РНК одновременно были обнаружены в 8 образцах (16,3 % от общего количества проб). В 3 случаях (6,2 %) был выявлен только антиген, а в 6 (12,5 %) - только РНК вируса. Все положительные пробы были представлены только клещами Н. marginatum. В материале от клещей, полученном из Астраханской области, в 5 (1,9+0,8 %) пробах методом ИФА был выявлен антиген вируса ККГЛ. Такое же количество положительных проб было получено и в ОТ-ПЦР. При этом совпадение результатов ИФА и ПЦР составило 100 %. Маркеры вируса ККГЛ были обнаружены в клещах, относящихся к виду Н. marginatum. Таким образом, было показано, что сконструированная тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР обеспечивает высокую точность анализа и может быть использована для проведения эпизоотологического мониторинга природных очагов КГЛ. Однако, для получения наиболее достоверных результатов необходимо использовать оба метода диагностики. Исследование клинического материала Данный этап работы проводился на базе лаборатории биологии и индикации НИИ вирусологии РАМН (г. Москва). Методами ОТ-ПЦР с использованием тест-системы «ГенКонго» и ИФА с тест-системой для выявления антигена вируса ККГЛ (производства НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН) исследовали сыворотки крови людей, полученные из детского отделения Астраханской областной клинической больницы.
