Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение биологической активности веществ, независимо от последующей цели их использования, как правило, на первом этапе предполагает оценку их токсичности. Методы оценки токсичности, альтернативные классическим тестам на экспериментальных животных, а именно, модели с использованием культур клеток находят все более широкое применение в биохимико-токсикологических исследованиях. [Маіег, 1988; Митрохин и др., 1991; Balls, Fentem, 1992; Лукьянов и др., 1996; Clemcdson et а!., 19%, 1998]. Такие методы позволяют помимо решения этических проблем, связанных с массовым использованием и гибелью экспериментальных животных, значительно удешевить и сократить сроки предварительного исследования новых химических препаратов прежде всего на стадии их доклинических испытаний.. Еще одно преимущество моделей in vitro заключается в возможности работы непосредственно на культурах клеток человека, что делает полученные данные более адекватными при их проекции на организм человека. Кроме того, использование культур клеток позволяет установить характер биологической активности изучаемых соединений непосредственно на клеточном уровне и учесть сложные спнсргнчсские и/или разнонаправленные эффекты смесей химических соединений [Митрохин и др., 1991].
Несмотря на широкое развитие и признание альтернативных методов в мире [Березовская, Митрохин, 1990; Walum, Ekwall, 1996, 2000; Clemedson ct al., 1996, 1998. 2000], у нас в стране они пока не получили должного распространения. Так, при анализе материалов I съезда токсикологов России (1998) можно обнаружить, что из около 300 представленных сообщений только 35 так или иначе связаны с моделями in vitro, из которых на культурах клеток человека выполнено лишь 6 работ. Отдельные методы экспресс-тестирования in vitro, которые к настоящему времени утверждены Минздравом, Госкомсаиэпиднадзором и Госстандартом Российской Федерации [ ред. Подунова и др., 1999], являются недостаточно точными и специфичными и одновременно трудоемкими. Отсюда видно, насколько велика потребность в развитии подобных методов для отечественной науки и практики.
Широкое внедрение биохимико-токсикологического тестирования in vitro требует адаптации к условиям клеточных культур биохимических методов, первоначально разработанных для исследования биологических жидкостей, гомогенатов тканей и других объектов на макроуровне [Donato et al.. 1998; Garcia-Alfonso ct ah, 1998], что явилось важной самостоятельной задачей нашей работы.
Модуляция биологической активности ряда препаратов внутренней срсдоіі организма [Minion cl al., 1982; Morgan йа 1 aJgj$iJios, 1989; Пєіітіок, 19951 делает актуальными исследінЙМІЯ^шьШ^дцростаЬляющих, прежде
о» ті
всего сыворотки крови и отдельных сывороточных белков на специфическую, например, антимикробную активность, и на токсичность препаратов. В связи с этим большой интерес представляют исследования на одной и той же модели in vitro цитотоксичности препарата, а также его антимикробного действия, включая биоцидный и антиадгезивный эффекты.
В настоящее время широко признается, что в основе комплекса ответных реакций клеток, имеющих защитный характер и обеспечивающих адаптацию к меняющимся условиям в ответ на воздействие различных неблагоприятных факторов, в том числе и токсических агентов, лежат единые фундаментальные механизмы, приводящие к сходным изменениям на морфологическом и молекулярном уровнях [Александров, 1985; Котелевцев и др, 1986; Herbennan et al., 1986; Браун, Моженок, 1987; Барабой и др., 1992J. Такой универсальный характер стрессовых реакций на клеточном уровне в ответ на разнообразные внешние воздействия делает перспективным применение моделей in vitro и стандартных биохимических критериев оценки жизнеспособности и метаболических изменений клеток не только при действии химических препаратов, но и физических (электромагнитных полей различной частоты и интенсивности) и биологических факторов (вирусов, тканевых жидкостей от больных с различными типами патологии).
Цель исследования. Основная цель настоящей работы состояла в разработке модели тестирования токсичности на культурах клеток с помощью комплекса биохимических методов оценки на клеточном уровне состсяния мембран, устойчивости клеток к окислительному стрессу, их систем детоксикации и общей интенсивности метаболизма. Предполагалось показать, что даннач модель может быть использована для решения самых разнообразных задач в области токсикологии и клеточной биологии, а именно, для изучения ряда представляющих практический интерес потенциальных или уже использующихся в практике фармакологических препаратов, физических и биологических воздействий на клеточные культуры.
Задачи исследования.
1. Адаптировать к условиям культур клеток ряд биохимических
методов с целью использования полученных с их помощью показателей в
качестве критериев жизнеспособности и метаболизма клеток in vitro .
Использовать разработанную модель для анализа закономерностей цитотоксичности ряда мономерных и полимерных антисептиков, используемого в хирургии костного цемента, некоторых противовирусных препаратов и цитопатогенного действия вирусов, растительных экстрактов, биологических жидкостей, полученных от больных с различными формами патологии.
Провести сравнительное изучение антимикробной активности и токсичности модельных антисептиков, в отношении клеток в культуре.
4. Исследовать на культурах клеток механизм антиадгезивной
активности модельных антисептиков и отдельных сывороточных белков.
5. Исследовать пролиферативный и метаболический ответ клеток в
культуре на воздействие электромагнитных полей различной частоты и
интенсивности.
6. Оценить в условиях острой токсичности in vitro и in vivo защитный
эффект ряда антигипоксических и антиоксидантных препаратов и их
комбинаций.
Научное значение и новизна работы.
В ходе исследования установлен однотипный харгктер метаболического ответа клеток в культуре на различные повреждающие воздействия - токсические химические агенты, физические факторы, биологические жидкости от больных с разными формами патологии и экспериментальных животных, вирусы, выражающийся в повреждении клеточных мембран, усилении процессов перекисного окисления мембранных липидов (ПОЛ), подавлении активности ряда клеточных дегидрогеназ и ферментов обмена глутатиона. Показано, что универсальность этой реакции проявляется вне зависимости от химической структуры токсического вещества, метода оценки цитотоксичности и очень слабо зависит от тканевого и видового происхождения культивируемых клеток.
- Детально исследован эффект метаболической активации клеток в
культуре при воздействии минимальных эффективных концентраций
изученных веществ. Подтвержден универсальный характер фазы активации.
В связи с этим расширены и детализированы представления о механизмах
стресса на клеточном уровне.
Уточнен и детализирован токсический эффект in vitro и in vivo костного цемента, используемого в операциях эндопротезирования, за который ответствен несвязавшийся мономер метилметакрилата (ММА). Показано, что существенным моментом неблагоприятного действия ММА на клетки является развитие окислительного стресса и клеточной гипоксии.
- Изучено действие в условиях острой токсичности in vitro ряда
антигипоксических и антиоксидантных препаратов и их комбинаций.
Впервые показано, что комбинированное применение антигипоксанта
мафусола и антиоксидантов а-токоферола, СОД, унитиола, глутатиона
вызывает повышение защитного эффекта препаратов.
Выявлен защитный эффект сыворотки крови и ее отдельных белков на цитотоксичность in vitro модельных антисептиков (катамина АВ, катапола и полисепта).
- Впервые продемонстрирован разнонаправленный характер влияния
сыворотки крови на антимикробную активность, включая биоцидный и
антиадгезивный эффекты, полимерных катионных антисептиков различной
химической структуры: снижение эффективности катапола и повышениг - у
полисепта.
Показано, что антиадгезивная активность иммуноглобулинов в отношении S aureus, препятствующая фиксации патогена на клетках-мишенях и колонизации тканей хозяина, не зависит от их антигенной специфичности..
Впервые исследован пролиферативный ответ и устойчивость к индуцированному перекисному окислению липидов фибробластов человека в культуре под действием электромагнитных полей геомагнитного уровня различной частоты и конфигурации, а также видимого света различных частотных диапазонов.
Научно-методическое и практическое значение работы.
Ряд биохимических методов: оценка индуцированного перекисного окисления липидов, активностей лактатдегидрогеназы, ДТ-диафоразы, глутатион-в-трансферазы, глутатионредуктазы, общего содержания клеточных белков, связывания клетками ионов Са2+ - был адаптирован к условиям культур клеток.
Предложен способ комплексной оценки острой токсичности in vitro, состоящий в последовательном изучении среды инкубации клеток, мембранных дегидрогеназ и лишь на заключительном этапе внутриклеточных ферментов. Это позволяет определять на одном образце клеточной культуры до 4-х биохимических показателей с сохранением жизнеспособности монослоя, что существенно сокращает количество используемого клеточного материала и длительность тестирования токсичности препаратов, а также позволяет повысить точность и эффективность определения порогов токсических концентраций веществ. Разработанная модель обладает более высокой чувствительностью, чем традиционные морфологические методы исследования и может быть рекомендована для широкого 'применения в предварительной фазе тестирования на токсичность, а также в скрининге цитопротекторньгх препаратов [Патент РФ № 2079130 от 10.05.1997].
Обнаружение наиболее значительного защитного эффекта в условиях острой токсичности in vitro при комбинации антигипоксических (фумарат) и антиоксидантных (СОД, тиоловые соединения, а-токоферол) препаратов позволяет рекомендовать данный комбинированный подход для поддерживающей терапии в тех случаях, когда применение токсичных препаратов неизбежно. Указанное сочетание препаратов нашло применение в клинике при операциях эндопротезирования крупных суставов с использованием костного цемента [Патент РФ № 2159089 от 20/11/2000].
Выявленный благоприятный пролиферативный и
метаболический ответ клеток человека в культуре на действие циклотронного электромагнитного поля геомагнитного уровня позволяет рекомендовать его для клинических испытаний с целью ускорения заживления ран и переломов.
Модификация сывороткой крови бактериостатического и антиадгезивного эффекта, а также цитотоксичности исследованных
антисептиков показывает необходимость проведения исследований на культурах клеток в условиях, как можно более полно имитирующих внутреннюю среду организма.
Основные положения, выносимые на защиту.
Предложенная модель тестирования токсичности in vitro с помощью комплекса биохимических методов оценки на клеточном уровне состояния мембран, устойчивости клеток к окислительному стрессу, их систем детоксикации и общей интенсивности метаболизма демонстрирует высокую эффективность при решении самых разнообразных задач в области клеточной токсикологии.
Вне зависимости от конкретной химической структуры соединений, а также метода оценки цитотоксичности, все исследованные ксенобиотики вызывают качественно сходный острый токсический ответ клеток в культуре, существенной чертой которого является фаза активации метаболических процессов минимальными эффективными концентрациями веществ.
Ряд препаратов с антигипоксическими и антиоксидантными свойствами при их использовании в концентрациях, адекватных применяемым в клинике, защищают клетки в культуре от токсического действия исследованных практически значимых ксенобиотиков, причем максимальный цитопротекторный эффект наблюдается при комбинации антигипоксанта мафусола (фумарат Na) с одним из антиоксидантов (а-токоферол, СОД, тиоловые препараты).
Сыворотка крови и отдельные сывороточные белки снижают токсичность ' in vitro исследованных антисептиков и оказывают разнонаправленное действие на антимикробный эффект препаратов различной структуры.
Антиадгезивная активность иммуноглобулинов в отношении патогенных микроорганизмов не зависит от их антигенной специфичности.
Циклотронное и постоянное электромагнитные ноля геомагнитного уровня оказывают значимое влияние на процесс пролиферации клеток в культуре и вызывают характерный фазный ответ их устойчивости к индуцированному ПОЛ. Световое излучение различных частоныых диапазонов также приводит к разнонаправленным сдвигам метаболизма и скорости пролиферации клеток в культуре.
Инкубация культур клеток с лаважной жидкостью, полученной от экспериментальных животных на блеомициновой модели фиброза легких, вызывает типичную токсическую реакцию, сопровождающуюся окислительным стрессом и повреждением клеточных мембран.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на 12 конференциях и конгрессах, в том числе на 7-ми международных: на Всероссийских научных конференциях «Биология клетки в культуре», С.Петербург в 1995 и 1998 г.; 1-ом международном конгрессе по биологической медицине, Израиль, 1994 г.; II междунар. научн.-практ. конф. « Биологич. активны; вещества и новые
продукты в косметологии», Москва, 1997; VI Всеросс. съезде анестезиологов и реаниматологов, Москва, 1998; международной коференции «Механизмы цитотоксичности in , Рим, Италия, 1999; 7-ом конгрессе французского общества клеточной фармако-токсикологии, Нанси, Франция, 1999; 37-ом и 38-ом европейских токсикологических конгрессах «Евротокс'99», Осло, Норвегия, 1999 и «Евротокс'2000», Лондон, Великобритания; III и IV всемирных конгрессах по альтернативам использованию лабораторных животных в медико-биологич. экспериментах, Болонья, Италия, 1999 и Новый Орлеан, США, 2002; меж.нар. конференции «Свободнорадикальные процессы: экологич., фармакол. и клинич. аспекты», С.Петербург, 1999; Всеросс. конф. «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиол., диагностики гриппа и др. вирусных инфекций», С.Петербург, 2001; 2-ом съезде токсикологов России, Москва, 2003.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 34 печатные работы и два патента на изобретение.
Структура диссертации. Работа изложена на 356 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 10-ти глав (каждая из которых содержит литературную предпосылку, специфические методы, результаты исследования и их обсуждение), заключения, выводов и списка литературы, включающего 673 наименования, в том числе 209 на русском языке и 464 на иностранных. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 55 рисунками.
