Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Активные кислородные метаболиты 10
2.2. Система антиоксидантной защиты и характеристика основных антиоксидантов 11
2.2.1. Характеристика основных ферментов-антиоксидантов 13
2.2.1.1. Супероксиддисмутаза 13
2.2.1.2. Каталаза 16
2.2.1.3. Глутатионпероксидаза 17
2.2.1.4. Глутатионредуктаза 20
2.2.1.5. Глутатионтрансферазы 21
2.2.2. Характеристика основных неферментных антиоксидантов 22
2.3. Особенности онтогенеза АОЗ у млекопитающих 26
3. Экспериментальная часть 37
3.1. Материалы и методы исследования 37
3.1.1. Экспериментальные животные и условия опытов 37
3.1.2. Приготовление тканевых гомогенатов 39
3.1.3.Специальные методы исследования 40
3.2. Результаты собственных исследований 49
3.2.1. Экспериментальное исследование антиоксидантной системы органов и тканей крыс на этапах онтогенеза 49
3.2.1.1. Исследование перекисного окисления липидов в органах и тканях крыс на этапах онтогенеза 49
3.2.1.2. Исследование неферментного звена антиоксидантной системы органов и тканей крыс на этапах онтогенеза 51
3.2.1.3. Исследование активности ферментов антиоксидантной системы органов и тканей крыс на этапах онтогенеза 55
3.2.2. Онтогенетические аспекты толерантности к развитию
окислительного стресса при токсическом воздействии кадмия 64
3.2.2.1. Изменение биохимических показателей плазмы крови крыс при токсическом воздействии 64
3.2.2.2. Изменение показателей ПОЛ и АОС печени и слизистой тонкого кишечника крыс при токсическом воздействии 66
3.2.2.3. Изменение показателей ПОЛ и АОС плазмы и эритроцитов крыс при токсическом воздействии 69
3.2.2.4. Изменение показателей ПОЛ и АОС в тканях миокарда и аорты крыс при токсическом воздействии 71
3.2.2.5. Изменение содержания селена в тканях и концентрации восстановленных тиолов плазмы крови крыс при токсическом воздействии 74
3.2.3. Экспериментальное исследование антиоксидантной системы различных органов крыс на этапах онтогенеза при алиментарном воздействии 79
3.2.3.1. Изменение биохимических показателей плазмы крови крыс при алиментарном воздействии 79
3.2.3.2. Изменение показателей АОС печени и тонкого кишечника крыс при алиментарном воздействии 83
3.2.3.3. Изменение показателей АОС плазмы и эритроцитов крыс при алиментарном воздействии 91
3.2.3.4. Изменение показателей АОС миокарда и аорты крыс при алиментарном воздействии 93
3.2.4. Оценка адаптации системы АОЗ к алиментарному и токсическому воздействию 103
4. Заключение 108
5. Выводы 123
6. Список литературы 125
- Система антиоксидантной защиты и характеристика основных антиоксидантов
- Характеристика основных неферментных антиоксидантов
- Исследование неферментного звена антиоксидантной системы органов и тканей крыс на этапах онтогенеза
- Изменение содержания селена в тканях и концентрации восстановленных тиолов плазмы крови крыс при токсическом воздействии
Введение к работе
Начало использования кислорода в качестве уникального химического источника энергии послужило толчком в эволюции живых организмов, сделало возможным появление эукариот, многоклеточных организмов и освоение ими материковых поверхностей [Скулачев В.П., 2001; Зенков Н.К. и др., 2001]. Параллельно с совершенствованием механизмов дыхания и обмена веществ появилась необходимость нейтрализации продуктов ряда биохимических реакций - активных метаболитов кислорода, то есть необходимость формирования системы антиоксидантнои защиты. В процессе эволюции сложилась многоуровневая система антиоксидантнои защиты живых организмов с участием ферментных и неферментных механизмов, обеспечивающих возможность сохранения постоянства внутренней среды при использовании в окислительно-восстановительных реакциях химически лабильного и токсичного кислорода.
Как часть живого организма, антиоксидантная система находится в постоянной зависимости от внешней среды (в частности, от поступления микроэлементов, содержащихся в активных центрах антиоксидантных ферментов — железа, цинка, меди, марганца, селена и серы) [Спиричев В.Б., 1996; Тутельян В.А. и др., 2000; Benzie I., 2003], а в настоящее время также подвергается массивному антропогенному влиянию, зачастую критическому для эволюционно сложившихся биохимических систем. Наряду с развитием дефицита микронутриентов, резко возрастает интенсивность внешних прооксидантных воздействий (радиационных и ультрафиолетовых излучений, ксенобиотиков). Поэтому исследование состояния и адаптивных возможностей системы антиоксидантнои защиты в онтогенетическом аспекте представляется актуальным, так как нарушения антиоксидантного статуса особенно ярко проявляются в критические периоды онтогенеза: ранний постнатальный и пубертатный периоды [Torres L., 2004; Turgut М, 2004; Cherian S., 2004; Kelly N, 2004; Konduri G., 2004; Harrison C, 2005].
Актуальным является изучение адаптационного потенциала антиоксидантной системы и в старческом возрасте, так как многочисленные исследования подтверждают зависимость развития дегенеративных заболеваний и самого старения от накопления окислительных повреждений [Ланкин В.З., 2000; Скулачев В.П., 2001; Harman D., 1956; Sohal R., 1995; Forsmark-Andree P., 1995; Yu В., 1996; Wells-Knecht M., 1997; Schleicher E., 1997; Leeuwenburgh C, 1997; Linnane A., 1998; Mecocci P., 1999].
Одним из наиболее информативных подходов в исследовании системного антиоксидантного ответа является моделирование состояний окислительного стресса [Beckman К., 1998]. Наиболее уязвимыми в силу своей химической активности являются сульфгидрильные группы ферментов и неферментных антиоксидантов [Соколовский В.В., 1996; Зенков Н.К. с соавт., 2001; Akerboom Т., 1981;], поэтому моделирование окислительного стресса, направленного на инактивацию сульфгидрильных групп, позволит установить молекулярные механизмы нарушений и оценить характер корригирующих воздействий. Достаточно хорошо воспроизводимыми и отвечающими этим условиям являются модели таких распространенных в популяции состояний, как изменение метаболизма цистеина [Lewis С, 1992; Loscalzo J., 1996; Shimakawa Т., 1997; Fonseca V., 1999] или воздействие тяжелого металла кадмия [Nordberg G., 2004]. Применение этих моделей на различных этапах онтогенеза создает возможность для изучения и прогнозирования адаптационного потенциала антиоксидантной системы органов и тканей, а также для выявления групп риска и основы корригирующих мероприятий.
В формировании адаптационного ответа на любые виды внешнего воздействия значимую роль играют механизмы долговременной адаптации, представленные в системе антиоксидантной защиты ферментным звеном, в частности, селенопротеином глутатионпероксидазой. Поэтому актуальным является исследование биологической активности соединений селена в качестве средства профилактики развития окислительного стресса. Наиболее целесообразным является применение селенорганических соединений, как низкотоксичных доноров микроэлемента. С этой точки зрения представляет интерес исследование корригирующих свойств селенопирана (9-фенилсимметричного октагидроселеноксантена), так как в модельных экспериментах и исследованиях на животных он оказывал выраженное адаптогенное, иммуномодулирующее и антиоксидантное действие [Боряев Г.И.,2001].
Цель и задачи исследования
Цель работы: изучение системы антиоксидантной защиты различных органов крыс на этапах онтогенеза при алиментарном и токсическом воздействии.
Задачи исследования:
• Изучить онтогенетические особенности ферментного звена системы антиоксидантной защиты крыс раннего неонатального, пубертатного, репродуктивного и старческого периода.
• Изучить адаптационные возможности системы антиоксидантной защиты при направленном алиментарном и токсическом воздействии на каждом онтогенетическом этапе.
• Выявить возрастные группы риска по развитию окислительного стресса при токсическом и алиментарном воздействии.
• Выявить взаимосвязь между изменением параметров ферментного и неферментного звена антиоксидантной системы в онтогенезе при токсическом и алиментарном воздействии.
• Изучить адекватность применения селенопирана и его комплекса с витаминами Е и С для коррекции окислительного стресса, вызванного направленным токсическим и алиментарным воздействием.
Научная новизна
Впервые выявлен специфичный характер изменения активности ферментов на этапах онтогенеза, на основании чего была установлена ведущая роль глутатионпероксидазы в обеспечении адаптационных реакций антиоксидантнои защиты клеток. Установлена тканеспецифичность возрастной динамики активности глутатиоредуктазы и супероксидисмутазы. В пубертатном периоде выявлена прямая положительная корреляция активности глутатиопероксидазы и концентрации селена в печени, свидетельствующая о ведущей роли на этом этапе развития алиментарного фактора (обеспеченность селеном). Установлено, что в раннем постнатальном периоде система антиоксидантнои защиты зависит от адекватного функционирования антиоксидантнои системы кормящей самки. Выявлено, что у особей репродуктивного возраста наряду с высоким адаптационным потенциалом антиоксидантнои системы крови, кишечника и печени отмечается функциональная недостаточность механизмов адаптации миокарда и аорты при алиментарно-индуцированном окислительном стрессе. Установлено, что, несмотря на достаточно высокую фоновую активность ферментов в старческом периоде, система антиоксидантнои защиты имеет низкие адаптационные возможности в условиях окислительного стресса и зависит от поступления антиоксидантов с пищей.
Практическая значимость работы
Результаты работы позволяют рекомендовать разработанные модели токсического и алиментарного окислительного стресса для научных исследований, так как они предоставляют возможность прогнозировать эффективность и индивидуализировать методы алиментарной антиоксидантнои коррекции с учетом онтогенетического этапа. Данные об онтогенетических особенностях антиоксидантнои системы могут быть использованы в научно-исследовательской работе, медицинской и педагогической практике, а также при разработке новых видов биологически активных добавок к пище антиоксидантного действия.
Апробация работы
Апробация работы проведена на межлабораторной конференции ГУ НИИ питания РАМН. Материалы диссертационной работы доложены на 3-й Международной Конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003), заочной Конференции молодых ученых «От фундаментальной науки - к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2003), Международном Симпозиуме «Second international symposium # on trace Elements and minerals in medicine and biology" (Мюнхен, 2004), 4-й национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск,2005).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 2 статьи в научных рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, включает 26 таблиц и иллюстрирована 13 рисунками. Указатель литературы включает 43 отечественных и 300 зарубежных источников.
Система антиоксидантной защиты и характеристика основных антиоксидантов
По определению, антиоксидантом называется любое вещество, способное предотвращать или значительно замедлять окисление [Halliwell В, 1999; Strain J., 1999], что может быть достигнуто предотвращением генерации или инактивацией АКМ. Вероятно, первыми антиоксидантными механизмами были простые физические барьеры [Bilinski Т., 1991]: внутриклеточная секвестрация фоточувствительных пигментов (хлорофилла), ультрафиолетовые экраны, компартментализация уязвимых клеточных структур. С появлением более сложной организации, дополнительно к максимальному ограничению поступления и неконтролируемого восстановления кислорода, важным направлением эволюции стало формирование системы антиоксидантной защиты путем накопления молекул антиоксидантов, поступающих из внешней среды, или синтеза собственных соединений с антирадикальной активностью. Среди неферментых факторов антиоксидантной защиты в эволюционном плане наиболее приемлемыми оказались аскорбиновая кислота и а-токоферол [Halliwell В., 1996]. Подчиняясь общим принципам эволюции, ориентирующимся на ведущую роль макромолекул, наиболее эффективным путем элиминации АКМ стал ферментный катализ.
В группу ферментов антиоксидантной защиты входят супероксиддисмутаза (СОД), катализирующая реакцию дисмутации супероксид-анион радикала в пероксид водорода, каталаза, его разлагающая, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионтрансферазы (ГТ), инактивирующие органические пероксиды [Зенков Н.К. с соавт., 2001; Wendel А., 1988]. Ферментативные антиоксиданты характеризуются высокой специфичностью действия, направленного против определенных форм АКМ; специфичной клеточной и органной локализацией; специфичностью использования в активных центрах металлов, к которым относятся медь, цинк, марганец, гемовое и негемовое железо и селен [Зенков Н.К. с соавт., 2001; Wendel А., 1988; Sies Н., 1991]. Выделяют автономные молекулы ферментов, к которым относятся СОД и каталаза, не нуждающиеся в кофакторах, поскольку катализируемые ими реакции экзотермичны, и интегрированные с другими клеточными структурами глутатионзависисмые ферменты. Для работы глутатионпероксидазы, к примеру, необходим восстановленный глутатион, который синтезируется преимущественно в печени глутатионсинтетазой или восстанавливается глутатионредуктазой [Кулинский В.И., 1990; Зенков Н.К. с соавт., 2001; Kidd Р., 1997]. Уровень ферментативных антиоксидантов находится под генетическим контролем. Принцип такой регуляции наиболее хорошо изучен у бактерий, для которых показана активация транскрипции генов, запускающих синтез каталазы, ГР, Мп-СОД, НАДФ-зависимой щелочной гидропероксидазы в ответ на повышение внутриклеточной концентрации Н202 и ОГ2 [Зенков Н.К. с соавт., 2001; Gruer М., 1994; Gaudu Р., 1996; Nunushiba Т., 1996; Fridovich I., 1998;]. В настоящее время известно, что активация белков-регулонов синтеза ферментов-антиоксидантов является адаптивным ответом не только на внутриклеточную продукцию 0 2, но и обеспечивает защиту от других оксидантов [Зенков Н.К. с соавт., 2001; Liochev S., 1994]. Не исключено, что аналогичный тип регуляции характерен и для эукариот, однако экспрессия антиоксидантных ферментов клетками млекопитающих регулируется как часть координированного тканевого ответа опосредованно цитокинами, а не прямым действием прооксидантов на отдельные клетки [Зенков Н.К. с соавт., 2001; Sies Н., 1991; Stralin Р., 1994]. У животных и в культурах клеток, в условиях гипоксии, гипероксии или введения эндотоксина, усиливающих образование АКМ, повышается содержание внутриклеточных АО ферментов, что является фактором устойчивости к окислительным поражениям [Меерсон Ф.З., 1992; Зенков Н.К. с соавт., 2001; Fridovich I., 1989; Forman Н., 1990; Bryan С, 1992; Das S., 1992; Dhaunsi G., 1993]. На уровне целого организма активность ферментных антиоксидантов изменяется в зависимости от гормонального статуса. В частности, изменения уровня гормонов надпочечников, щитовидной железы, инсулина, влияли на активность Cu-Zn-СОД, Мп-СОД, каталазы, глутатионпероксидазы и на продукцию гидропероксида [Зенков Н.К. с соавт., 2001]. диффузией объеме. Фермент широко представлен в аэробных клетках и сохраняет стационарный уровень О 2 в пределах 10" моль л [Imlay J., 1991].
СОД имеет несколько изоферментных форм, отличающихся строением активного центра. Нативные ферменты высокоустойчивы и выдерживают нагревание до 100 С, колебания рН в широком диапазоне и воздействие 86% этанола [Зенков Н.К. с соавт., 2001]. Подобного рода устойчивость к внешним воздействиям обеспечивается наличием в структуре ферментов стабилизирующего металла, в частности цинка. Выразительной иллюстрацией стабильности Cu-Zn-СОД является сохранение ее структуры и ферментативной активности в мозге мумии возраста более 3 тысяч лет [WeserU., 1989].
Cu-Zn-содержащая СОД является чувствительной к цианиду, содержит цинк и медь в активном центре. Медь в процессе катализа меняет свою валентность, тогда как цинк в данном случае играет структурную роль и обеспечивает стабильность молекулы [Klotz L., 2003]. Фермент обнаруживается в цитозоле, ядрах, пероксисомах, межмембранном матриксе митохондрий у эукариотов, периплазме грамотрицательных бактерий и пластидах растительных клеток. Цитозольная фракция представляет собой гомодимер [Tainer J., 1982], молекулярной массой 31 Ша. Медь и цинк соединены с имидазольным мостиком, реакция дисмутации протекает в 2 стадии: одна молекула 0 2 восстанавливает Cu(II) с разрывом имидазольного мостика, после чего восстановленный дериват окисляется другой молекулой субстрата [Murphy Н., 1997, цит. по Fridovich I., 1998]:
Экстрацеллюлярная высокомолекулярная форма СОД (Э-СОД) является Cu-Zn-содержащим гликопротеином, гомотетрамером, каждая субъединица которого имеет молекулярную массу около 30 кДа [Marklund S., 1982; Tibell L., 1993]. Э-СОД является главным изоэнзимом межклеточных жидкостей (плазмы, лимфы, синовиальной жидкости) и в небольших количествах порядка 1-2% от всей активности СОД, обнаруживается практически во всех тканях. Экспрессия Э-СОД локализована преимущественно в фибробластах и клетках глии, экспрессия стимулируется интерфероном-у, стимулируется или подавляется интерлейкином-1а, подавляется фактором некроза опухоли и рост-трансформирующим фактором р [Зенков Н.К. с соавт., 2001; Marklund S., 1984; Marclund S., 1990; Marclund S., 1992]. Кроме того, дефицит в пище цинка вызывает резкое снижение активности Э-СОД, тогда как на активность внутриклеточной Си-Zn-СОД почти не влияет [Зенков Н.К. с соавт., 2001; Olin К., 1995]. Предположительно, функция Э-СОД у млекопитающих заключается в локальной защите эндотелиоцитов, без вмешательства в процесс генерации АКМ гранулоцитами [Fridovich I., 1989; Marklund S., 1990]. Цианидрезистентная марганецсодержащая форма (Мп-СОД) локализована в митохондриях и матриксе хлоропластов эукариот, а также обнаруживается у бактерий [Поберезкина Н.Б., 1989; Wendel А., 1988], имеет молекулярную массу около 40 кДа и является димером или тетрамером. Фермент содержит один ион марганца на субъединицу [Wagner U., 1993]. Характерной особенностью Мп-СОД является ее резистентность к действию гидропероксида, индуцибельность (увеличение экспрессии и стабильности фермента под воздействием радиации), а также значительная роль в процессе выживания клетки. Мыши, не способные синтезировать митохондриальную Мп-СОД, погибали в течение нескольких дней после рождения [Li Y., 1995], тогда как лишение животных возможности синтеза Cu-Zn-СОД не имело столь драматических последствий [Reaume А., 1996; Kondo Т., 1997].
Характеристика основных неферментных антиоксидантов
Помимо ферментов, антиоксидантные функции в организме выполняют также низкомолекулярные соединения - перехватчики радикалов и АКМ. В настоящее время не существует общепринятой классификации антиоксидантов. Общим признаком очень многих антиоксидантов является их способность выступать в качестве донора протона функциональной группы. По строению функциональной группы антиоксиданты можно разделить на содержащие SH-группы и ОН-группы.
Тиоловые соединения как биологические антиоксиданты В свете современных данных становится все более очевидной ведущая роль тиоловых соединений в механизме антиоксидантной защиты. К такому заключению приводят несколько обстоятельств [Соколовский В.В., 1996]. Во-первых, основная часть функциональных компонентов АОС представлена веществами тиоловой природы. Так, в состав неферментного звена входят низкомолекулярные тиолы (глутатион, тиоредоксин и др.) и тиолсодержащие белки, которые по некоторым данным [Park Е., 1989] даже более реактивны по отношению к АКМ, чем глутатион. К тиоловым компонентам сыворотки крови млекопитающих относятся альбумины, представляющие собой важные внеклеточные антиоксиданты [Halliwell В., 1988]. Ферменты, принимающие участие в противоокислительной защите, либо относятся собственно к числу тиоловых энзимов, либо нуждаются в присутствии тиолов для проявления каталитической активности. Во-вторых, уникальные химические свойства тиолов наделяют их высокой антиокислительной способностью. В этой связи заслуживают упоминания: зависимость скорости реакции окисления SH-групп от их радикального окружения в молекуле, что позволяет выделить из множества тиоловых соединений особую группу легкоокисляющихся веществ, выполняющих специфические функции антиоксидантов; обратимость реакции окисления сульфгидрильных групп в дисульфидные, обеспечивающая возможность выгодного поддержания гомеостаза тиоловых антиоксидантов в клетке без активации их биосинтеза; способность тиолов проявлять как антирадикальное, так и антиперекисное действие; обусловленную спецификой молекулярной структуры способность тиоловых соединений проявлять преимущественно гидрофильные, либо липидофильные свойства, с чем связана возможность создания достаточно высоких концентраций того или иного тиола в водной или липидной фазе клетки и, соответственно, возможность защиты от окислительного повреждения молекул ферментов и других белков, нуклеиновых кислот и иных биологически активных веществ [Соколовский В.В., 1996].
Тиоловые соединения являются важным компонентом поддержания окислительно-восстановительного гомеостаза в клетках и тканях. При различных стрессовых воздействиях и патологических состояниях наблюдается обратимая окислительная модификация SH-групп, приводящая к увеличению дисульфидных связей, что является неспецифической реакцией организма на экстремальные воздействия [Соколовский В.В., 1988; Биленко М.В., 1989]. Такая модификация изменяет состояние клеточных мембран, их проницаемость и адгезивные свойства, влияет на активность ферментов и клеточную пролиферацию [Соколовский В.В., 1988; Кулинский В.И., 1990], вызывает нарушения структуры цитоскелета [Orrenius S., 1988], способствует высвобождению цинка из металлотионеинов [Maret W., 1994; Maret W., 1995]. Поэтому тиол-дисульфидное соотношение, так же как и буферная емкость тиоловых групп является важным критерием неспецифической резистентности организма [Соколовский В.В., 1996].
К SH-содержащим соединениям-антиоксидантам относят глутатион. Глутатион представляет собой трипептид, существующий в двух активных формах: восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG). Структурно GSH пред-ставляет собой низкомолекулярный тиол - Ь-у-глутамил-L-цистеинилглицин. [Kidd Р., 1997]. Концентрация общего глутатиона в цитозоле различных клеток колеблется от 1 до 10 мМ [Кулинский В.И., 1990]. При этом почти полностью он представлен восстановленной формой. Образование GSH происходит в глутамильном цикле, преимущественно в печени, и в определенной степени зависит от поступления цистеина с пищей. Основной антиоксидантный эффект глутатиона реализуется посредством его участия в работе ферментативных антиоксидантов. Будучи субстратом для ГПО и ГТ, глутатион выступает донором атомов водорода для восстановления перекиси водорода и липидных перекисей [Hirayama К., 1989; Кулинский В.И., 1990]. Вместе с тем, глутатион, как и другие тиолы, является ингибитором АКМ и стабилизатором мембран [Биленко М.В., 1989; Udupi V., 1992]. Внутриклеточный глутатион эффективно связывает ионы меди, препятствуя их вовлечению в реакцию Фентона [Freedman J., 1989].
Антиоксидантная роль глутатиона заключается также в его способности реагировать с органическими свободными радикалами, в частности белковой природы, или восстанавливать дисульфидные мостики до свободных SH-групп в неэнзиматических реакциях, или путем ферментативного катализа с участием глутатион-трансгидрогеназы [Mieyal J., 1995]. Кроме того, накоплено достаточно большое количество данных о защитном S-глутатионилировании (образовании с глутатионом смешанных дисульфидов) белка в условиях окислительного стресса [Gilbert Н., 1984; Ziegler D., 1985; Thomas J., 1995; Cotgreave I., 1998]. S-глутатионилирование белка участвует в стабилизации клеточных и внеклеточных белков, защите функциональной SH-группы цистеина от необратимого окисления. Глутатион может также конвертировать S-нитрозированные остатки цистеина и сульфенаты в достаточно стабильные смешанные дисульфиды. Деглутатионилирование протеинов в последующем достигается путем как неферментного восстановления, так и энзиматическим разрушением дисульфидов с участием тиоредоксина, глутаредоксина и/или протеин-дисульфид-изомеразы [Jung С, 1996].
Фенольные соединения, имеющие в своей структуре ароматическое кольцо с несколькими ОН-группами, также являются мощными перехватчиками радикалов, эффективность которых возрастает в зависимости от количества гидроксильных заместителей в цикле.
Важную роль в защите клеток, и главным образом, их мембран от окислительных повреждений играют токоферолы, антиоксидантное действие которых реализуется двумя путями. Во-первых, токоферолы способны стабилизировать мембраны за счет хорошей растворимости в фосфолипидах и взаимодействия с их жирнокислотными цепями, что увеличивает плотность упаковки фосфолипидов в мембране и снижает вероятность их окисления. Вторым проявлением антиоксидантных свойств токоферолов является их способность перехватывать АКМ и ингибировать ПОЛ, в результате чего образуются малоактивные токоферильные радикалы, которые легко восстанавливаются аскорбиновой кислотой, убихиноном или мочевой кислотой, что обеспечивает регенерацию витамина Е [Зенков Н.К. с соавт., 2001; Burton G., 1986].
Исследование неферментного звена антиоксидантной системы органов и тканей крыс на этапах онтогенеза
Существование организмов с аэробным дыханием напрямую зависит от использования кислорода как конечного акцептора электронов в дыхательной цепи, где происходит окисление большинства поступающих с пищей энергетических субстратов. Большая часть кислорода, потребляемая клеткой-аэробом, восстанавливается цитохром-с-оксидазой до воды без образования интермедиатов. Но примерно 0,1-2% кислорода восстанавливается до супероксид-анион-радикала, образующего другие радикальные продукты и перекиси (гидроксил-радикал, пероксид водорода) и запускающего цепные реакции с вовлечением остатков жирных кислот и образованием липоперекисеи, конъюгированных диенов, альдегидов и кетонов [Скулачев В.П., 2001; Fridovich I., 1999]. Образование липоперекисеи тесно связано с процессами поступления липидов с пищей, их окисления и синтеза. Поступление липидов в пищеварительный тракт в раннем постнатальном периоде происходит с молозивом и молоком матери и напрямую зависит от количества их в ее рационе, т.к. к молочной железе пищевые триглицериды и холестерин поступают в составе хиломикрон и ЛПОНП непосредственно из кишечника кормящей самки [Климов А.Н., 1999]. Данные, представленные в таблице 3.2.1.1. свидетельствуют, что в плазме крыс раннего поснатального периода содержание общего холестерина и триглицеридов было наивысшим по сравнению с другими подгруппами, с преобладанием во фракционном составе ХС ЛПНП. При этом концентрация МДА плазмы также была максимальной среди исследованных подгрупп - как в относительных, так и абсолютных величинах. Наличие высокой положительной корреляции между этими показателями (г=0.973, р 0,05) указывает на то, что большая часть окисленных жирных кислот находится в составе ХС ЛПНП. Вместе с тем содержание ДК„л крыс раннего постнатального периода было наименьшим (0,632±0,034 мкмоль/л) и относительное содержание ДК (0,012±0,001%) статистически значимо отличалось (р 0.05) от ДКПЛ крыс пубертатного периода.
Рассматривая возрастную динамику содержания промежуточных и конечных продуктов липопероксидации в плазме, можно отметить прогрессирующее с возрастом повышение относительного содержания ДКПЛ и статистически значимое снижение концентрации МДАпл (к старческому периоду МДА в липидах плазмы было в 2 и 3 раза меньше, чем в репродуктивном и раннем поснатальном периоде соответственно).
Содержание ОХ и ХС ЛОНП снижается до репродуктивного периода и статистически значимо повышается у старых крыс. Вместе с тем, ХС ЛПНП прогрессивно снижается с возрастом, а концентрация ХС ЛВП, напротив, возрастает. Изменение МДАПЛ коррелирует с изменением концентрации ДК и МДА в эритроцитах (г=0.976, р 0.05 и г=0.987, р 0.05 соответственно), МДАМИ0К (г=0.999, рО.001). Выявленное понижение содержания продуктов ПОЛ в сердечной мышце с возрастом может определяться интенсивностью ее работы (частотой сердечных сокращений в минуту, максимальной в раннем постнатальном периоде) и связанным с этим расходованием энергии и потреблением кислорода.
С точки зрения детерминированности ключевых биохимических процессов в клетках, интересна выявленная идентичность онтогенетических сдвигов в содержании продуктов ПОЛ в гепатоцитах и эпителии слизистой оболочки тонкого кишечника (таблица 3.2.1.2.) . Так, отмечается статистически значимое повышение содержания ДКпеч и ДК щ на каждом последующем этапе от 21 дня до 24 месяцев, причем эти изменения взаимосвязаны (г=0.994, р 0.01). Динамика концентрации МДА иная. Его содержание повышается в пубертатный период в 8 раз в печени и в 1,5 раза в кишечнике по сравнению с ранним постнатальным периодом и снижается на последующих этапах (в репродуктивном и старческом периодах). Интересно, что в печени концентрация ДК положительно коррелирует с содержанием ХС ЛВП (г=0.974, р 0.05) и отрицательно - с ДКМИ0К (г= -0.955, р 0.05), что подтверждает данные исследований антиоксидантной протекции ЛВП в отношении сердца, осуществляемой с помощью транспорта окисленных эфиров ХС и захвата ЛВП гепатоцитами [Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1999].
Ранее проведенные исследования указывают на высокую степень процессов липопероксидации в раннем постнатальном онтогенезе, что связано с адаптацией к атмосферному воздуху [Lemeshko V., 1987; Kolesnikov М, 2002], в связи с чем, мы наблюдали наиболее высокое содержание продуктов ПОЛ в эритроцитах и миокарде у животных раннего постнатального периода. В то же время, у них по сравнению с другими возрастными группами, в органах пищеварения интенсивность ПОЛ была наименьшей, т.е. в данном случае, большое значение имеет характер питания, на что указывают и другие исследователи [Gomi F., 1998].
Таким образом, выявленные закономерности позволяют предположить, что интенсивность процессов липопероксидации тесно связана с интенсивностью потребления кислорода, поступлением липидов с пищей, синтезом и транспортом липидов и липопротеидов в различные периоды онтогенеза, а также филогенетически детерминированными функциями рассмотренных органов.
Изменение содержания селена в тканях и концентрации восстановленных тиолов плазмы крови крыс при токсическом воздействии
Исследование плазмы и эритроцитов показало, что применение экспериментальной диеты привело к характерным прооксидантным изменениям в показателях ПОЛ и АОС (таблица 3.2.3.5.).
У крысят раннего постнатального периода было обнаружено повышение концентрации ДК в 4,6 раза при снижении концентрации МДАпл в 1,3 раза, ДКЭр и МДАэр повышались в 1,4 и 4,5 раз соответственно. Активность ферментов изменялась следующим образом: ГРэр снижалась на 32%, ГПОэр - на 9% (р 0,001), а СОДэР повышалась на 20% по сравнению с контролем. В пубертатный период в 4,4 раза увеличивалось содержание МДАэр, и снижалась активность СОД,р на 38%. У животных репродуктивного возраста повышалось содержание продуктов ПОЛ в плазме - ДКПЛ в 1,9 и МДАПЛ в 1,6 раза, а значимых изменений со стороны активности ферментов не было выявлено. Показатели старых животных в-основном характеризовались отсутствием изменений, кроме активности ГПОэр, которая повышалась на 60%. Концентрация биоантиоксидантов в плазме и эритроцитах (таблица 3.2.3.6.) менялась следующим образом. У крысят в постнатальном раннем периоде отмечали статистически значимое снижение концентрации общего и восстановленного глутатиона на 26% и 47% соответственно, и соотношения GSH/GSSG3p в 1,6 раза. В пубертатном возрасте концентрация восстановленного глутатиона повышалась на 12%, при этом увеличивалось соотношение GSH/GSSG3p в 2,3 раза. У животных репродуктивного периода количество общего глутатиона статистически значимо снижалось на 64%, но повышалось соотношение GSH/GSSG3p в 7,2 раза. У старых крыс было обнаружено снижение количества общих тиолов плазмы на 35%. Применение экспериментальной диеты отразилось на концентрации селена в плазме у крыс пубертатного периода, она снижалась на 17%. Применение ВМК, содержащего селен, витамин Е и витамин С параллельно с экспериментальной диетой, реализовалось разнонаправленными изменениями вышеописанных параметров. Так, содержание витамина Е (таблица 3.2.3.6.) в плазме крысят раннего постнатального периода повышалось на 15% по сравнению с контролем, а у животных пубертантного возраста снижалось на 32%. Содержание селена в плазме во всех возрастных группах было статистически значимо выше, чем в группе "М". Отмечали повышение концентрации восстановленных тиолов плазмы у животных раннего постнатального, пубертатного и старческого периодов. Концентрация общего глутатиона эритроцитов повышалась на 51% по сравнению с контролем у крысят раннего постнатального периода, но снижалась у животных репродуктивного периода на 75%. Концентрация GSBjp была выше контрольных значений у крыс раннего постнатального и пубертатного периодов, но снижалась у крыс репродуктивного и старческого возраста. Соотношение GSH/GSSG3p повышалось в 3 раза у крыс раннего постнатального периода, в 4 раза у крыс пубертатного периода, в 1,5 раза в репродуктивном возрасте, и снижалось в 2 раза у старых крыс. Содержание МДАпл (таблица 3.2.3.5.) по сравнению с группой "М" статистически значимо уменьшалось у животных пубертатного, репродуктивного и старческого возраста. Было обнаружено повышение концентрации ДКщ,в пубертатный период. Содержание ДКэр было на уровне контроля у крысят раннего постнатального периода и повышалось у животных репродуктивного возраста. При введении ВМК активность ГРэр у крыс в раннем постнатальном периоде была статистически значимо выше, чем в группе "М", но отмечалось снижение активности ГПОэр ниже уровня в группе «М». В пубертатном периоде активность ГПОэр снижалась по сравнению с группой "М", а у старых животных возрастала выше группы "М", и это различие было статистически значимым. Наблюдали также повышение активности СОДэр у животных репродуктивного и старческого возраста. Заслуживают внимания результаты, полученные при расчете индекса АОИ крови — на рисунке 3.5. видно, что применение диеты с высоким содержанием метионина привело к существенному снижению показателя у животных раннего постнатального, пубертатного и репродуктивного периода, в основном за счет повышения содержания продуктов ПОЛ и снижения активности ГРэр и ГПОэр. Несколько неожиданным оказался результат у старых животных - значение индекса не изменилось. В противоположность органам пищеварения, введение ВМК благоприятно подействовало на значение АОИ крови у животных пубертатного возраста — он стал даже выше, чем в контроле благодаря снижению концентрации МДАпл и МДАэр- Тенденция к повышению индекса отмечалась у животных репродуктивного и старческого периодов по той же самой причине. Парадоксальное изменение интегрального показателя в этот раз было отмечено в раннем постнатальном периоде. Значение индекса оставалось на уровне группы «М» (т.е. в несколько раз ниже контроля) за счет снижения активности ГПОэр и увеличения концентрации МДАПЛ.
В миокарде и аорте животных группы «М», как и в других тканях, отмечалась прооксидантная разбалансировка (таблица 3.2.3.7. и таблица 3.2.3.8.). Так, у крыс раннего постнатального и старческого периода повышалось содержание ДКмиок на 12% и 25% соответственно. У животных репродуктивного возраста повышалась концентрация ДКаорты на 67%. У них же отмечалось снижение активности ГРМИОк и ГПОа0рты на 330% и 53% соответственно, в раннем постнатальном периоде - снижение активности ГРМиок на 18%, а у крыс пубертатного периода - падение активности ГПОмиок и ГПОаорты на 23% и 38% соответственно. В раннем постнатальном возрасте также отмечалось снижение активности СОДмиок на 19%.
