Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Современные представления о структурной организации и свойствах ряда ферментов, важных для биохимического анализа 14
1.2. Общие принципы иммобилизации ферментов и свойства супрамолекулярных ферментных систем 39
1.3. Межфазная тензиометрия модельных растворов и биологических жидкостей 55
1.4. Супрамолекулярные ферментные системы в биосинтезе жирных кислот и их влияние на особенности жирнокислотного состава молока в норме и при патологических состояний животных 66
1.5. Методы формирования и исследования моделей биомембран и перспективные направления их применения 80
Собственные исследования 99
ГЛАВА 2. Структурная организация и свойства супрамолекулярных ферментных систем и биоматериалы на их основе 99
2.1. Фундаментальные аспекты гидролиза триглицеридов и новых липидоподобных субстратов в монослоях под действием липаз 100
2.2. Изучение взаимодействия липазы с поверхностно активными веществами и его влияния на процессы ферментативного гидролиза на границе раздела фаз 114
2.3. Исследование двухкомпонентных комплексов с липазами из различных источников и влияния условий среды на их ферментативную активность 134
2.4. Трехкомпонентные комплексы из двух полиэлектролитов и фермента 149
ГЛАВА 3. Супрамолекулярные системы на основе белков и липидов в исследовании биологических жидкостей животных и совершенствовании биохимических методов анализа 164
3.1. Изменения ряда биохимических параметров крови собак в зависимости от возраста и при хронической сердечной недостаточности 164
3.2. Межфазная тензиометрия в исследовании белок-липидных систем и крови животных 181
3.3. Сравнительное исследование жирнокислотного состава молозива и молока в первые недели лактации у коров черно-пестрой породы 215
3.4. Влияние биологически активных добавок на биохимические показатели биологических жидкостей животных 232
ГЛАВА 4. Многофункциональные супрамолекулярные системы в моделировании биомембран и создании био- и наноматериалов 247
4.1. Выделение и исследование различных типов липидов, их смесей с белками реакционных центров в монослоях 247
4.2. Исследование супрамолекулярных систем липидов с белками (пептидами) и их взаимодействия с катионами металлов для моделирования процессов молекулярного узнавания в биомембранах 271
4.3. Сравнительное исследование монослоев мембранных фракций клеток с разным содержанием П-гликопротеина 288
4.4. Супрамолекулярные системы на основе новых мембранно- активных соединений, липидоподобных мономеров и полимеров 298
Выводы 316
Сведения о практическом
Использовании и
Рекомендации по использованию
Результатов исследования 320
Список литературы
- Межфазная тензиометрия модельных растворов и биологических жидкостей
- Изучение взаимодействия липазы с поверхностно активными веществами и его влияния на процессы ферментативного гидролиза на границе раздела фаз
- Межфазная тензиометрия в исследовании белок-липидных систем и крови животных
- Исследование супрамолекулярных систем липидов с белками (пептидами) и их взаимодействия с катионами металлов для моделирования процессов молекулярного узнавания в биомембранах
Введение к работе
1. Актуальность проблемы. Проблема создания, изучения и применения супрамолекулярных биохимических систем (СБС) с заданными свойствами, представляющих собой высокоорганизованные комплексы белков, липидов и других биологически активных соединений (БАС), является современной и находится «на стыке» биологической и биоорганической химии; био- и нанотехнологии; фундаментальной медицины и ветеринарии. Решение фундаментальных и прикладных аспектов этой комплексной проблемы имеет важное значение для биохимических исследований биологических жидкостей животных, моделирования биомембран, создания бионаноматериа-лов и т.д. [Афонский СИ., 1966; Овчинников Ю.А., Иванов ВТ. и др., 1974; Березин И.В., 1985; Friedrich P., 1986; Kuhn H., Moebius D„ 1993; Лен Ж.-М, 1998; Lvov Y., Moehwald H., 2000-2006 и др.].
Среди СБС наибольшее значение имеют комплексы на основе белков, прежде всего - ферментов, применяющиеся в медицине, сельском хозяйстве, ветеринарии, а также в промышленности: пищевой, фармацевтической, косметической, текстильно-кожевенной. К настоящему времени накоплен значительный экспериментальный материал и сформулированы теоретические представления о методах иммобилизации различных ферментов [Mosbach К., 1976; Березин И.В. и др., 1987; Кабанов В.А. и др., 1987; Вудворд Дж., 1988; Варфаломеев С.С. и др., 1999; Штильман М.И., 2006 и др.], однако исследований по направленному изменению ферментативной активности липаз в трехкомпонентных комплексах на основе двух противоположно заряженных полимеров до начала наших работ не проводилось. Многие ферменты, детектируемые в плазме крови и широко применяемые для диагностики физиолого-биохимического статуса животных, можно рассматривать как «эндогенные» СБС высоких уровней организации, поскольку они состоят из нескольких полипептидных цепей (субъединиц), которые, комбинируясь различными способами, образуют четвертичную структуру фермента. Так, лактатдегидрогеназа (ЛДГ) состоит из 4 субъединиц 2 типов (Н и М); креатиншназа (КК) - из 2 субъединиц 2 типов (Ви М). Более того, у животных обнаружено 5 изоформ ЛДГ и 3 изофор-
МЫ КК. Все ЭТИ ферМеНТЫ И ИХ ИЗОфОрМЫ В КРОВИ ЖИВОТНЫХ СОСТЭВ-
ляют характерный набор («ферментные» СБСФ или «ферментный профиль»), который зависит от патологических изменений органов и тканей животных, что явилось нашей базовой моделью для био-
химических исследований крови животных и совершенствования биохимических методов анализа. Новыми «интегральными» характеристиками не только плазмы крови, но и других биологических жидкостей являются данные по их поверхностному натяжению (ПН), которые в последние годы используются в диагностике заболеваний человека в ряде научно-медицинских центров ФРГ и Украины Поэтому актуальным является клиническое исследование ПН плазмы крови животных в сравнении с данными биохимических анализов, ""которое' выполнено 'для животных в ФГОУ ВПО МГАВМиБ впервые в мире.
Важную роль играют СБС на основе липидов, что обусловлено их значением в биоэнергетике, биомембранах, биологических жидкостях животных. Известно, что биохимический (в т. ч. - липидный) состав крови и молока претерпевает значительные изменения во время лактации у коров. Однако детальные исследования изменений липидно-го 'сбстава молозива и молока коров по семидесяти жирным кислотам при различных состояниях животных до сих пор не проводились. Эти исследования становятся все более актуальными в связи с вопросом о качестве и подлинности вырабатываемых молочных продуктов. Другим важным аспектом «липидных» СБС„ является структурно-функциональное моделирование биомембран, что привлекает все большее внимание ученых [Singer S.J., Nicolson G.L., 1972, Бергельсон Л.Д.7 І 975, 1981; ЛевАА, 1976; Овчинников Ю.А., 1987; de Kruijff В., 1987; Moehwald Н, Moebius D., 1991; Chapman D., 1993; Теннис P., 1997; Agre P., MacKinnon R., 2003 и др.]. Актуальным является исследование фрагментов биомембран, комплексов липидов, белков, БАС и их аналогов в монослоях, которые представляют собой «ли-пидные» и «синтетические» СБСЛ, имеющие как фундаментальное (для моделирования биопрсцессов самоорганизации, молекулярного узнавания и т.д.), так и прикладное значение (для создания бионано-материалов и т.д.).
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось создание и структурно-функциональное изучение супрамолекулярных биохимических систем (СБС) с заданными свойствами и уровнями организации для моделирования ряда биологических процессов, совершенствования биохимических методов исследований биологических жидкостей животных, создания био- и наноматериалсв.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: - разработать принципы систематизации СБС на основе ферментов (СБСф) и липидов (СБСЛ) по уровням структурной организации;
разработать модель и определить константы гидролиза липазами липидоподобных субстратов в монослое (как СБСФ 1го уровня);
изучить влияние поверхностно-активных веществ и полимерно-ионного окружения на каталитические свойства СБСФ 2го - 4го уровней (на основе липаз и трипсина) для создания биоматериалов;
выявить корреляцию «ферментного профиля» сыворотки крови (как СБСф 5го уровня) у собак старших возрастов с изменениями в деятельности сердца;
разработать методик;/ и провести исследования поверхностного натяжения модельных систем и сыворотки крови здоровых лошадей (как СБС 6го уровня) в сравнении с биохимическим анализом крови;
- изучить влияние «экзогенной» СБС (на примере биологически
активной добавки «Nurisol») на «эндогенную» СБС (на примере из
менений жирнокислотного состава молозива и молока коров);
-і изучить изменения жирнокислотного состава молозива и молока (как СБСЛ 1го уровня) у коров в течение первых недель лактации при сравнении здоровых и больных животных;
получить и исследовать СБСП 2го и 3го уровней (различные типы монослоев на сснове липидов с включенными белками и пептидами) как моделей биомембран, био- и наноматериалов;
получить и изучить монослои мембранных фракций клеток с различным содержанием П-гликопротеина (как СБСЛ 4го уровня);
получить л изучить монослои новых мембрано-активных соединений - амсЬифильных фотохромных комплексонов (АФК) как «синтетических* СБС, моделирующих определенные структурно-функциональные параметры СБСЛ 2го - 4го уровней.
Нз/чная новизна работы. Разработаны принципы создания и изучения супрамолекулярных биохимических систем с заданными свойствами и уровнями организации. На основании детального исследования особенностей структурной организации «ферментных» v «липидкых» СБС предложена их систематизация по уровням с регулируемым составом. Разработана модель и определены константы гидролиза липазами новых липидоподобных субстратов в монослое на границе раздела фаз. Получены комплексы на основе липазы и двух полиэлектролитов, проявляющие повышенную каталитическую аетивность. Предложена схема формирования этих многокомпонентных СБСф и показано влияние полимерно-ионного окружения на ферментативную активность липазы из поджелудочной железы свиней, бактериальных липаз и трипсина.
Разработана методика определения поверхностного натяжения модельных СБС и сыворотки крови животных (как «эндогенной» СБС высшего уровня). Впервые определены характеристические 'значения ПН у здоровых лошадей и обнаружены достоверные отличия у жеребцов и кобыл. Показано, что статические (начальные) значения ПН определяются липидным и солевым составом сыво-Г: 'ріотки крови, а динамические значения ПН - постепенной адсорбцией белков сыворотки крови из объёма на границу раздела фаз.
Впервые проведено сравнительное изучение «ферментного профиля» сыворотки крови (как;СБСф 5го уровня) у собак старших ^возрастов в норме и при хронической сердечной недостаточности '(ХСН) на основании: как определения активности аланинами-Нбтрансферазы (АЛТ), аспартатамйнотрансферазы (ACT) и у-глутамилтрансферазы (ГГТ), Так и содержания изоферментных '"' форЗм лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и крёатйнкиназы (КК). Важно, что лво всех контрольных группах происходит снижение активности этих ферментов с возрастом; а во всех опытных группах (при ХСН) происходит увеличение в 2-4 раза активности АЛТ, ACT и ГГТ; в 8 раз активности ЛДГ (преимущественно за счет фракций ЛДГ, и ЛДГ2); в 4 раза активности КК (за счет фракций КК-МВ и КК-ММ).
Впервые детально1 исследовано изменение содержания большого числа (71ой) жирных кислот (ЖК), в том числе 33х изомеров ЖК, в молозиве и молоке (как «ЖК профиль» или СБСЛ 1го уровня) у коров в первые недели лактации в норме и при патологии, а также при введении в рацион добавки «Nurisol» (как «экзогенной» СБСЛ).
Изучены мембраны на основе липидов, пептидов и белков (СБСЛ
2го - 4го уровней), перспективные для моделирования биомембран и
создания биосенсоров. Определены 'условия получения монослоев
мембранных фракций клетоксразличным содержанием (до ЗЙ%) П-
гликопротеина (ПГП). Максимальный эффект действия верапамила
(модулятора ПГП) наблюдается, когда количество молекул верапа
мила в субфазе сравнимо с количеством молекул ПГП в монослое,
что указывает на специфические изменения в структуре мембран
ных фракций клеток. Детально изучены «синтетические» СБСЛ 2го-
4го уровней на основе новых мембранно-актйвных соединений
(АФК) и разработаны принципы создания био- и наноматериалов с
комплексом задайных свойств. ' '
Теоретическая и практическая значимость'работы. Определены оптимальные условия для иммобилизации лйпаз в комплексы
' 6
с полиэлектролитами, позволяющие получить биоматериалы на основе СБСф с заданными свойствами. На основе сравнительного исследования различных комплексов липаз микробного и животного происхождения получены ферментные препараты с регулируемой активностью в широком температурном интервале, что представлено в заявках автора и др. №2006111372, №2006111373 и №2006111374 на получение патентов РФ на изобретения (положительные решения от 13.02.2007 г. с приоритетом от 14.06.2006 г.).
Разработана методика проведения исследований ПН сыворотки крови лошадей и показана перспективность внедрения в практику ветеринарии, зоотехнии и биологии достаточно простого и удобного метода экспресс-диагностики физиолого-биохимического статуса животных. Результаты изучения биохимических показателей крови у собак при ХСН показали возможность комплексной диагностики ХСН и разработки эффективных методов коррекции возникших изменений, что используется в работе ветеринарных клиник г. Москвы.
Впервые получен «ЖК профиль» по 71ой жирной кислоте молока и молозива коров черно-пестрой породы в зависимости от периода лактации, состава рациона и состояния здоровья животных, что имеет огромное значение при разработке процессов получения диетических молочных продуктов и необходимо для разработки нормативных документов на молочную продукцию (ГОСТ Р 52253-2004 и др.), где ЖК состав является одним из показателей, позволяющих выявить фальсификат и недоброкачественную продукцию.
Изучены различные типьГлипид-белковых монослоев и показана
их эффективность для моделирования процессов молекулярного
узнавания и транспорта в биомембранах, что важно для ряда био
химических методов анализа. Разработаны методики и получены
серии образцов нанокомпозитных материалов на основе новых
мембранно-активных соединений (АФК) для детекции катионов ме
таллов и диаминов: акты №1, №2, №3 от 06.11.'2006 г. при сдаче
темы ИН-12.1/015/027 Минобрнауки РФ по гос. 'контракту
№02.434.11.2039 от 09.11.2005 г., выполненной совместно с учены
ми ЦФ РАН с получением патента РФ на изобретение №2292368 с
приоритетом от27.12.2005 г. '. . ..L.'a-:
Результаты и основные научно-методические положения диссертации используются в лекционных курсах и лабораторных практикумах для студентов 2-5 курсов при подготовке специалистов
высшей квалификации по специальности 012300 - Биохимия, а также для подготовки аспирантов, докторантов и соискателей в ФГОУ ВПО МГАВМиБ по специальности 03.00.04 - Биохимия.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту:
принципы систематизации и особенности структурной организации СБС «на основе ферментов» (СБСФ) и «липидов» (СБСЛ);
разработанная модель и полученные константы гидролиза липазами липидоподобных субстратов в монослое (СБСФ 1го уровня);
данные по влиянию поверхностно-активных веществ и полимерно-ионного окружения на каталитические свойства СБСФ 2го - 4го уровней (из липаз и трипсина) и созданные на их основе биоматериалы;
закономерности изменения «ферментного профиля» сыворотки крови (как СБСф 5го уровня) собак старших возрастов в норме и при хронической сердечной недостаточности;
разработанная методика и данные исследования поверхностного натяжения модельных систем и сыворотки крови здоровых лошадей (как СБС 6го уровня) в сравнении с биохимическим анализом крови;
данные по влиянию «экзогенной» СБС (на примере биологически активной добавки «Nurisol») на «эндогенную» СБС (на примере изменений жирнокислотного состава молозива и молока коров);
закономерности изменения жирнокислотного состава молозива и молока (как СБСЛ 1го уровня) у коров в течение первых недель лактации при сравнении здоровых и больных животных;
данные по СБСЛ 2го и 3го уровней (различные типы монослоев на основе липидов с включенными пептидами и белками) как моделей биомембран и перспективных материалов для биосенсоров;
данные по монослоям мембранных фракций клеток с различным содержанием П-гликопротеина (как СБСЛ 4го уровня);
закономерности структурно-функциональных изменений для новых мембранно-активных соединений (АФК) в модельных мембранах (как «синтетических» СБСЛ 2го- 4го уровней) и нанокомпозитные материалы на их основе с сенсорными свойствами.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались с 1996 по 2006 годы на 32 всероссийских и международных съездах, конференциях, симпозиумах и семинарах по актуальным проблемам биохимии, физико-химической биологии, полимероїз, коллоидов, ветеринарии и зоотехнии: 2nd, 3rd, 4lh International Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems" (Russia, St.-Petersburg 1996, 1999, 2002); XVI и XVII Менделеевские съезды по
общей и прикладной химии, (С-Петербург, 1998; Казань, 2003); 2-я и 3-я Международные конференции "Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии" (С-Петербург, ,1998, 2001); 7th, 8th, 9th, 10th European Conferences on Thin Organized Films (Potsdam, Germany 1998, Otranto, Italy, 2001, Valladolid, Spain, ,2004, Riga, Latvia, 2006); International Symposium "Lipid and surfactaqt,dis-persed systems", (Moscow, Russia, 1999); 9th International conference of Organized Molecular Films (Potsdam, Germany, 2000); Всероссийская конференция с международным участием «Сенсор-2ОО0»у(С.-Петербург, 2000); 3-я Национальная конференция RGH3 (Москва, 2001); XX International Conference on Photochemistry (Moscqw, 2001); 3-ий Съезд биохимического общества РФ (С-Петербург, -2002); Всероссийская научно-производственная конференция по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2002); International Conference "Nanotechnologies in the area of physics/chemistry and biotechnology" (St. Petetsburg, Russia, 2002); 2nd, 3rd International Symposium "Molecular Design and Synthesis of Supramolecular Architectures" (Kazan, Russia, 2002, 2004); XIXth IUPAC Symposium on Photochemistry (Budapest, Hungary, 2002); XVIth, XVIIth European Conference Chemistry at Interfaces Conference (Vladimir, Russia, 2003, Loughborough, UK, 2005); XXVIII, XXX International Symposium on Macrocyclic; Chemistry (Gdansk, Poland, 2003, Dresden, Germany, 2005); Всероссийская научно-техническая конференция (Мурманск, 2003); IX International conference The problems of solvation and complex formation in solution" (Plyos, Russia, 2004); 2, 3 и 4 Всероссийские Каргинские Конференции (Черноголовка, 2000; МГУ, Москва, 2004 и 2007); European Polymer Congress (Moscow, Rus'sia;'2b05); Xth international seminar on inclusion compounds (Kazan,'Russia, 2005); Московские международные ветеринарные конгрессы (Москва, 2004-2006); Международная научно-производственная конференция агробиологической промышленности (Курск, 2006); Международная научно-практическая конференция по болезням лошадей (Москва, 2006); На>/чно-практические конференции ИБХ PAW~(Mock-ва, 1996-2004) и ФГОУ ВПО МГАВМиБ (Москва, 2001-2006);. *-"
Публикации результатов исследований. Подтеме диссертации опубликовано "?80 печатных работ, из них: 3 книги; 88 статей в журналах и научных сборниках (из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ: 24 статьи в российских и 26 статей в международных рецензируемых журналах), 89 тезисов докладов; &;также 1 патент и 3 положительных решения на патенты РФ, 9 методических работ.
9 .—
Личный вклад автора. Автором предложены основные направления исследований и разработаны важнейшие методики для экспериментального подтверждения предложенных им идей. Все ключевые эксперименты выполнены лично автором и лишь второстепенные - аспирантами и сотрудниками при участии автора. Лично автором проведена основная;работа по обработке и оформлению полученных результатов, по написанию всех научных проектов и публикаций. В исследованиях; "выполненных совместно с другими лабораториями в России и за рубежом, вклад автора заключался в обсуждении и постановке задач, в проведении экспериментов са-''мим автором в период его регулярных внутренних и заграничных командировок в эти лаборатории, в обработке и оформлении результатов в виде печатных работ.
1: "' Объем и структура диссертации. Материалы диссертационной
работы изложены на ^ страницах машинописного текста. В ра
боте приведено 63 рисунков и З'ґ таблиц. Диссертация со
стоит из введения, обзора литературы (глава 1), результатов экспе
риментов и "их обсуждения (главы'2, 3 и 4), выводов, списка литера
туры и приложений. В спиеоглитературы включено "7КГ~ отечест
венных и З&У зарубежных источников.
Межфазная тензиометрия модельных растворов и биологических жидкостей
В большинстве животных тканей равновесие катализируемой ЛДГ реакции сильно сдвинуто в сторону образования молочной кислоты; требует присутствия НАД-Н+ГҐ и протекает в анаэробных условиях. Исключение составляют раковые клетки: в них образуется большое количество молочной кислоты в аэробных условиях. Фермент встречается во всех органах и тканях, но наибольшая активность ЛДГ обнаружена в почках, сердце, скелетной мускулатуре и печени. ЛДГ содержится также и в эритроцитах, поэтому сыворотка, используемая для анализа, должна быть лишена даже следов гемолиза. Повышение общей активности в сыворотке отмечается при инфаркте миокарда, лейкозах, тромбоцитопении, повреждениях печени вирусной, токсической и травматической природы, опухолях различной локализации, заболеваниях почек, гемолизе эритроцитов [107].
В тканях животных выявлено 5 изоферментных форм ЛДГ, которые являются тетрамерами, причем каждый орган имеет свой «изоферментный спектр» ЛДГ. Так, тетрамер ГЦ или ЛДГі - преимущественно локализован в сердечной мышце; тетрамер М4 или ЛДГ5 - локализован как в печени, так и в поперечно-полосатой мышчной ткани; другие три изофермента - гибриды: Н3Мі или ЛДГ2 ; Н2М2 или ЛДГ3 ; HjM3 или ЛДГ4 - преимущественно локализованы в ретикулоэндотелиальной системе, легких и почках, соответственно. Интересно, что изофермент Н4 помимо реакции «пировиноградная кислота-молочная кислота» может катализировать реакцию «кетоглутаровая кислота-гидроксимасляная кислота», но легко ингибируется пируватом и поэтому особенно полезен для такого «высокоаэробного органа» как сердце. Хотя изофермент М4 эффективен лишь в реакции «пировиноградная кислота-молочная кислота», но он не ингибируется пируватом и поэтому особенно полезен для скелетных мышц, где может создаваться большая нагрузка, требующая мощных процессов анаэробного гликолиза. Обычно активность изофермента Н3Мі в крови человека и животных незначительно выше, чем других изоферментов. Поэтому увеличение активности М4 свидетельствует о патологии печени, а в случае инфаркта миокарда активность изоферментов ЬЦ и М]Н3 становится значительно выше активности других изоферментов. Указанные различия в активности изоферментов в крови имеют важное значение для клинической диагностики патологических состояний определенных органов и тканей как человека, так и животных.
Креатинкиназа (КК) - КФ 2.7.3.2. - гетерогенный фермент с молекулярной массой порядка 86000-89000 (рис. 1.5-1.10). Комплекс КК состоит из двух субъединиц 2 разных типов (В и М), обладающих молекулярной массой 44500 и 43000 соответственно [107]. В приложение 2 приведено строение полипептидных цепей креатинкиназы (типа ММ) из мышц человека, состоящих из 365 аминокислотных остатков. Каталитический центр состоит из 5 аминокислотных остатков Argl32 - Arg320 - Glu232 - Arg292 - Arg236. Креатинкиназа катализирует как прямую реакцию переноса фосфорильного остатка с АТФ на креатин, так и обратную реакцию переноса фосфорильного остатка с креатинфосфата на АДФ. АТФ + Креатин - АДФ + Креатинфосфат Скорость прямой реакции максимальна при рН 9,0; обратной - при рН 6-8. В организме равновесие сдвинуто в сторону обратной реакции. Активность фермента повышается под влиянием ионов магния, марганца, кальция, глутатиона и цистеина, а ионы цинка, меди и ртути, напротив, оказывают ингибирующее воздействие [107].
Креатинкиназа (типа КК-ВВ) из мозга цыпленка (Gallus gallus) состоит из двух В-субъединиц (рис. 1.5): код lqh4 (PDB-EBI). Полипептидная цепь В-субъединицы креатинкиназы (типа КК-ВВ) из мозга цыпленка состоти из 380 аминокислотных остатков. Хотя эта последовательность отличается, но порядок аминокислотных остатков в калитическом центре этой В-субъединицы Argl32 - Arg320 - GIu232 - Arg292 - Arg236 полностью совпадает с таковой для М-субъединицы креатинкиназы (типа ММ) из мышц человека код liOe (PDB-EBI).
Безусловно «супрамолекулярным» является строение ассиметрического комплекса и биологически активного октамера (рис. 1.6) митохондриальной креатинкиназы (КК-мит.) из сердечной мышцы цыпленка (Gallus gallus): код lcrk (PDB-EBI). Полипептидная цепь субъединицы КК-мит. из сердечной мышцы цыпленка состоит из 380 аминокислотных остатков, как и для приведенной выше В-субъединицы типа КК-ВВ из мозга цыпленка. Однако порядок аминокислотных остатков в калитическом центре этой митохондриальной субъединицы Arg231(A) - Arg287(A) - Argl27(A) -Arg315(A) - GIu227(A) существенно отличается от приведенной выше В-субъединицы креатинкиназы (типа КК-ВВ) из мозга цыпленка.
Необычным является строение ассиметрического комплекса и биологически активного димера креатинкиназы из сердечной мышцы кролика (Oryctolagus cuniculus) (рис. 1.7) Полипептидная цепь субъединицы креатинкиназы из сердечной мышцы кролика состоит из 365 аминокислотных остатков. Как эта последовательность, так и порядок аминокислотных остатков в калитическом центре этой субъединицы Argl32 - Arg320 - GIu232 - Arg292 - Arg236 полностью совпадает с таковой для М-субъединицы креатинкиназы (типа ММ) из мышц человека.
Изучение взаимодействия липазы с поверхностно активными веществами и его влияния на процессы ферментативного гидролиза на границе раздела фаз
Изотерма поверхностное давление (я) - площадь (А) на молекулу в монослое (рис. 1.22) является одной из главных характеристик ПАВ, из которой делается вывод об ориентации и упаковке молекулы на границе раздела фаз [2, 3, 117, 150, 209]. Поверхностное давление представляет собой двумерный аналог обычного давления и определяется как % = а0 - о, где о0 и с, - ПН поверхности водной субфазы до и после нанесения ПАВ. Поверхностное давление обычно измеряют двумя методами. Метод Вильгельми основан на измерении выталкивания (ПН) полупогруженной в водную субфазу тонкой пластинки (из стекла, бумаги, платины) при нанесении ПАВ. Ленгмюровский метод основан на прямом измерении силы (п), действующей на плавающий барьер, который разделяет чистую поверхность водной субфазы и поверхность с нанесенным ПАВ. Оба метода имеют высокую точность (0,01 мН/м). Значительное влияние на параметры п-А изотерм ПАВ оказывает концентрация и состав солей в водной субфазе, рН, температура, скорость сжатия монослоя, которые надо поддерживать постоянными для получения воспроизводимых результатов [2, 3, 150, 209].
Измерение поверхностного потенциала (AV) является важным параметром монослоя, позволяющим оценить ориентацию молекул в монослое [2, 3, 150]. Величина AV монослоя после нанесения ПАВ на границу раздела вода/воздух определяется из уравнения Гельмгольца AV=nfi(l/c0), где п число молекул в монослое, (j. - среднее значение эффективного дипольного момента на молекулу в плоскости, нормальной к поверхности раздела фаз, є0 - проницаемость вакуума [2, 3, 150]. Используя равенство п=1/А, где А средняя площадь на молекулу в монослое, предыдущее уравнение можно преобразовать в следующую форму і=є0АУА для расчета значений эффективного дипольного момента на молекулу, которые непосредственно отражают изменения в ориентации молекулы на границе раздела фаз [2, 3, 150]. Изотермы AV - А получают двумя методами, дающими близкие результаты. Метод вибрирующего электрода состоит в измерении AV между дисковым металлическим электродом, вибрирующим с ультразвуковой частотой в нескольких мм над поверхностью водной субфазы, и Pt-электродом (или Ag/AgCl-электродом), погруженным в водную субфазу. Так называемый "метод ионизирующего электрода" предполагает то же расположение двух электродов, но ионизация воздушной прослойки между электродами осуществляется с помощью источника а-частиц (Ро210). Второй метод имеет два существенных недостатка: необходимость дополнительной специальной защиты исследователя от радиоактивного излучения и большую вероятность повреждения БАС радиоактивным излучением, что перекрывает его достоинство в виде более простого аппаратурного оформления [150]. Поэтому, в настоящее время наиболее широко для определения величин AV ПАВ в монослое используется метод вибрирующего электрода.
Измерения поверхностной вязкости (г) особенно широко используются для сравнительного исследования монослоев низко- и высокомолекулярных соединений, поскольку зависят не только от структуры монослоя, но и от значения молекулярного веса веществ [2, 3, 150]. Вязкость может быть определена несколькими методами, из которых наиболее часто используются метод "затухающих осцилляции" и течение монослоя в канале. В первом случае измеряется затухание колебаний специального металлического диска, помещенного непосредственно на поверхность монослоя ПАВ и подвешенного на тонкую малоинерционную кварцевую нить. Вискозиметр канального типа представляет собой двумерный аналог традиционного вискозиметра Оствальда и предназначен для измерения скорости течения монослоя из области высокого давления в область низкого давления. Из величины указанной скорости по формуле Пуазейля и уточнений Харкинса и Кирквуда [150, 209] рассчитывается величина поверхностной вязкости. Последний метод почти в 2 раза более чувствителен, чем первый, но имеет ограничения для измерения вязкости высокоэластичных пленок, таких как монослои синтетических и природных полимеров.
В течение длительного времени оптическая спектроскопия и микроскопия использовались только для исследования достаточно "толстых" мультислоев ПАВ [209]. С увеличением чувствительности спектрофотометров и конструирования специальных приставок для многократного прохождения луча через образец, появилась возможность регистрировать спектры ПАВ в УФ- и видимой области непосредственно на границе раздела жидкость/газ [307]. Рингдорф был одним из первых, кто использовал такую технику для исследования полимеризации диацетиленовых кислот в монослое [171, 172]. Оптические свойства синтетических и природных полимеров, имеющих хромофорные группы типа стирола, пиридина, ретиналя и т.п., могут быть достаточно просто и с высокой степенью точности охарактеризованы этим методом [3, 150, 209].
Инфракрасная спектроскопия (ИК) в модификации Фурье-накопления или полного внутреннего отражения (МНПВО) применяется в основном для исследования мультислоев ПАМ, перенесенных на специальные твердые подложки (германий или KRS с углами 30, 45 или 60 к длинной оси) [3, 150, 209]. Этот метод широко используется для контроля полимеризации акриловых и виниловых мономеров, но редко применяется для исследования белков из-за чрезвычайной сложности ИК-спектров последних [3,209].
Межфазная тензиометрия в исследовании белок-липидных систем и крови животных
Обнаруженная активность трипсина, иммобилизованного в полимерные комплексы №2 и №3 достаточно высока. Тем не менее, установлено еще одно важное условие, позволившее увеличить ферментативную активность трипсина практически до исходного значения: а именно - использование полианиона ПСС с очень высокой молекулярной массой. Показано, что активность трипсина увеличивается с 74% (комплекс №2) до 93% (комплекс №7) при увеличении молекулярной массы (ММ) ПСС с 66000 до 1000000, что можно объяснить уменьшением плотности упаковки молекул фермента в полимерный комплекс и соответственно более легкой доступностью субстрата по активному центру фермента. При этом, активность трипсина в супернатанте постоянна и достаточно низка в области от 7% до 9% (табл. 2.16). Следовательно, более 90% трипсина включено в полимерный комплекс с практически полным сохранением его ферментативной активности.
Впервые детально изучены структурные параметры полиэлектролит-ферментных комплексов методом светорассеяния на примере таких комплексов с трипсином (табл. 2.17). Из полученных кривых светорассеяния можно сделать вывод о том, что полиэлектролит-ферментные комплексы представляют собой систему компактных сферических частиц с высокой степенью агрегации молекул. Степень этой агрегации увеличивается при увеличении концентрации полиэлектролита в системе (табл. 2.17), но до определенного предела устойчивости всей коллоидной системы, что соответствует общим положениям теории флоккуляции коллоидных частиц [173, 180]. Важно, что образование полиэлектролит-ферментных комплексов при рН 7,5 (комплекс №4 в табл. 2.17) соответствует максимальному размеру частиц (315 нм) с большой молекулярной массой (58,5 109) и достаточной высокой активности трипсина (72% в табл. 2.16), тогда как увеличение рН до 11,0 (комплекс №5 в табл. 2.17) приводит к образования частиц наименьших размеров (86 нм) с относительно малой молекулярной массой (1,32 109) и 162 очень низкой активностью трипсина (15% в табл. 2.16). Следовательно, оптимальными условиями образования полиэлектролит-трипсиновых комплексов является рН 3,0 (комплексы №1-№3 в табл. 2.17), при котором наблюдается прямо пропорциональная зависимость между соотношением полиэлектролита и трипсина (от 5:1 до 20:1) и структурными параметрами: максимальный размер частиц увеличивается (от 154 нм до 298 нм) при еще более значительном росте молекулярной массы частиц (от 5,35 109 до 40,3 109), причем активность трипсина также увеличивается значительно (от 52 до 82%, комплексы №1-№3 в табл. 2.16). Использование ПСС более высокой молекулярной массы (от 183 103 до 1,0 106) при оптимальном соотношении полиэлектролита и трипсина = 10:1 и рН 3,0 (комплексы №6 и №7 в табл. 2.17), удается существенно увеличить активность трипсина (до 89% до 93%, комплексы №6 и №7 в табл. 2.16) при незначительном изменении структурных параметров этих комплексов (табл. 2.17). Напротив, замена ПАМА на сополимер (СОР-47) при этих же оптимальных условиях не приводит к существенному повышению активность трипсина, наилучшие результаты - до 68% - проявляет комплекс №9 (табл. 2.16), при следующих структурных параметрах этого комплекса: максимальный размер частиц (132 нм) и молекулярная масса частиц (2,04 109), которые не являются наилучшими (табл. 2.17). Такой четкой зависимости активности от плотности частиц комплексов найти не удалось, хотя общими рекомендациями, при прочих равных условиях, могут служить два положения. Первое, при очень большой плотности частиц комплексов (0,82 г/мл для комплекса №5 в табл. 2.17) наблюдается малая активность трипсина (15% для комплекса №5 в табл. 2.16), что легко объяснимо диффузионными затруднениями для субстрата при достижении активного центра фермента в плотных частицах. Второе, очень низкая плотность частиц комплексов (0,33-0,40 г/мл для комплексов №8-№10 в табл. 2.17) не обязательно сопровождается повышением активности трипсина (41%-53% для комплексов №8-№10 в табл. 2.16). На основании полученных данных по активности трипсина (82%, 163 89%, 93% для комплексов №3, №6 и №7 в табл. 2.16), оптимальными значениями плотности частиц комплексов следует считать величины 0,49 0,60 г/мл (комплексы №3, №6 и №7 в табл. 2.17).
Таким образом, найдены оптимальные условия получения комплексов полимер-трипсин с практически полным сохранением его ферментативной активности, а именно: определенный методикой порядок смешивания компонентов в соотношении (ПСС-ПАМА):трипсин 10:1 при рН 3,0, причем ПСС следует выбирать молекулярной массы порядка 106. Коллоидно-химическая стабильность полученных комплексов достаточно высока, что позволяет предложить данный подход к получению биоматериалов для дальнейшего использования в биотехнологическом процессе получения рекомбинантного инсулина человека и других современных технологиях.
Найденные условия могут быть использованы для иммобилизации других ферментов: как сериновых протеиназ (например, химотрипсина), так и других типов протеолитических ферментов (например, карбоксипептидазы А и В), а также - ферментов других классов.
Исследование супрамолекулярных систем липидов с белками (пептидами) и их взаимодействия с катионами металлов для моделирования процессов молекулярного узнавания в биомембранах
Выделение и исследование тилакоидных липидов Среди множества примеров структурно-функционального изучения СБСЛ 2го уровня, наиболее наглядным является исследование изменений состава липидов тилакоидных мембран Marchantia polymorpha под воздействием света высокой интенсивности, которое было проведено лично автором при использовании методик, разработанных совместно с коллегами из ФРГ. Тилакоидные мембраны представляют несомненный интерес для исследований воздействия светового стресса, поскольку в эволюционном ряду занимают особое положение и отличаются достаточно простым липидным составом. Исследование жирнокислотного состава тилакоидных липидов Marchantia polymorpha до наших работ не предпринималось, в то время как состав и функционирование фотосистем (ФСІ и ФСП) из этих мемебран интенсивно исследуются в последнее время зарубежными учеными [128, 129, 174]. Найдено, что ФСІ и ФСП изменяются под воздействием света высокой интенсивности. Поведение фотосистем зависит от липид-белковых взаимодействий, которые являются важными для выполнения мембранными белками своих функций. По-видимому, найденные белковые изменения, связаны со свойствами тилакоидных мембран, и прежде всего липидов, которые являются матриксом для фотосистем. Кроме того, тилакоидные липиды участвуют в регуляции биохимических процессов в мембране, посредством изменения липидного состава. В связи с этим, были проведены оригинальные работы по исследованию липидного состава тилакоидных мембран и воздействию на него света высокой интенсивности.
Материалы и методы. Выращивание культуры клеток М. polymorpha проводили в Университете г. Байройт (ФРГ) по методике и при консультации доктора К. Шеффера. Культивирование проводили в течении трех недель с использованием стандартной среды «Skoag». Контрольные образцы растили при 25С и следующем световом режиме: 16 часов - свет, 8 часов - темнота. Опытные образцы получали последующим постоянным освещением в течении 30 часов с высокой интенсивностью. Сразу после этого клеточную культуру собирали, промывали 3 раза дистиллированной водой и 1 раз буфером №1, содержащем 100 мМ Tris (рН 7,8), 400 мМ сорбитола, 10 мМ NaCl, 5 мМ. Затем клеточную культуру суспендировали в 40 мл буфера №1, разрушали клетки прессом Френча (при 300 атм.), фильтровали через микрофильтры «Miacloth» (в 2 сложения), центрифугировали при 3500 об/мин. 10 минут при 4С. Оставшуюся клеточную массу пропускали через пресс Френча второй раз и центрифугировали при 8000 об/мин. 10 минут при 4С. Осадок ресуспендировали в буфере №2, содержащем 10 мМ Tris (рН 7,8), 10 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, и объединяли оба супернатанта, которые центрифугировали при 9000 об/мин. 10 минут при 4С. Образовавшийся осадок вторично ресуспендировали в буфере №2, объединяли фракции супернатанта и снова центрифугировали при 9000 об/мин. 10 минут при 4С. Остаток растворяли в глицерольном буфере и измеряли суммарную концентрацию хлорофилла, которая составляла в исходном растворе 728,6 мг/мл. Для выделения липидов отбирали 0,8 мл пробы (т.е. 580,9 мг по хлорофиллу) и заливали смесью метанол:хлороформ=7:3, осторожно нагревали до 35С, фильтровали, промывали хлороформом, фильтрат смешивали с 0,73% раствором NaCl и оставляли на ночь. На следующий день раствор использовали для определения липидов после упаривания в мерной колбе и тщательного взвешивания по стандартным методикам. Для проведения ТСХ готовили раствор липидов в смеси метанол:хлороформ=1:1 и использовали для разделения следующие смеси растворителей: 249 1) ацетон:толуол:метанол:вода=90:25:7:1, 2) ацетон:бензол:вода=91:30:4, 3) хлороформ:метанол:уксусная кислота:вода=85:15:10:3. В результате препаративного разделения смеси липидов с помощью ТСХ на пластинках «Kiselgel 60 F254 DC-Fertigplatten» в системе 3) были получены фракции липидов как для образца тилакоидных мембран из культуры клеток, выращенной в нормальных условиях (ТІТ0, так и для образца после 30 часов облучения светом высокой интенсивности (ТЪзо ч)-Каждая из фракций была выделена и взвешена; определено соотношение липидных фракций в исходных экстрактах.
Для выделения липидов в препаративных масштабах использовали колоночную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе по стандартным методикам набивки и промывки колонки, нанесения и элюирования липидов по фракциям. Использовали элюенты: хлороформ:метанол=6:4 для начальной (№1) фракции «нейтральных» липидов и 21,5 мл хлороформ:метанол=6:4 с добавлением 1,5 мл водного раствора аммиака для трех фракций «кислых» липидов (№2, №3 и №4).
Для того, чтобы выявить изменения, произошедшие в составе жирных кислот в результате облучения образца светом высокой интенсивности, был проведен метанолиз полученных ранее липидных фракций. Разделение жирных кислот, предварительно модифицированных фенацилбромидом, осуществлялось на колонке с обращенной фазой С18 (ZORBAX PSM 60-S 6.2 mm х 25 cm P. N. 880957-802) методом ВЭЖХ. Данные хроматограмм для липидных фракций образца, выращенного в стандартных условиях, и образца после светового стресса приведены ниже.
