Введение к работе
Актуальность проблемы Все большую актуальность в эндокринологии приобретает проблема молекулярного полиморфизма гормонов пептидной природы, его значения в эндокринной регуляции в норме и при патологии. Прежде всего это относится к белковым и гликопротеидным гормонам гипофиза, имеющим наиболее сложное химическое строение, б частности, к гормону роста (ГР). На современном этапе исследований установлено, что этот гормон, выполняющий чрезвычайно важную роль в росте, развитш и жизнедеятельности организма, присутствует в гипофизе в виде нескольких молекулярных изоформ, различавшихся массой и зарядом молекул. Соотношение отдельных изоформ ГР и других гапофизарных гормонов может изменяться под влиянием различных физиологических и фармакологических воздействий. На основании этих фактов высказываются предположения о специфической роли изоформ ГР в сложных регуляторних механизмах, в возникновении нарушений эндокринной регуляции процессов роста и других эндокринных функций, в частности, при гиперсекреции ГР (Baumann. 1988; Булатов А.А.,1990). В связи с этим возникает необходимость изучения молекулярных форм этого гормона не только в гипофизе, но и в циркулирующей крови, а также в других биологических жидкостях и тканях с привлечением адекватных методов исследования.
Сложность проблемы изучения природного полиморфизма ГР . его физиологического и патогенетического значения состоит в отсутствии высокоэффективных методов, позволяющих качественно к количественно охарактеризовать изоформы гормона в биологических кидкостях и тканях человека. Однако, реальные возможности приблизиться к пониманию этой проблемы открываются благодаря разработке иммунохимических подходов, основанных на использовании моно- и поликлональных*'антител.
Сегодня уже можно говорить о том. что именно применение ионок-лональных антител (МКА) с избирательной эпитопной специфичностью открывает принципиально новые возможности в изучении полиморфизма оал-ковых гомонов. Основными преимуществами МКА являются: абсолютная специфичность, стабильность по своим характеристикам, бозмоеность стандартизации реагентов. Кроме того, МКА можно использовать для разработки эффективных методов выделения и очистки препаратов гормона с помощью высокоспецифичных иммуносорбентов. Создание таких ииму-носорбентов открывает новые возможности я в изучении близкородствен-
- г -
ных ГР полипептвдоЁ. клесте с тем далеко не исчерпаны возможности применения хуикизучения ГР. его природного полиморфизма поликлональ-ных антител.
На примере иследовдния ряда белковых гормонов можно видеть что эффективным инструментом для исследования их молекулярных вариантов могут служить системы иммуноблоттинга на основе поли- и моноклональ-ных антител к гормону. Это позволяет с оптимизмом смотреть на перспективы применения иммуноблоттинга в сочетании с другими методами, в частности, с иммуносорбцией на МКА для изучения ГР и его природных вариантов в биологических жидкостях и тканях человека, включая случаи эндокринных нарушений.
Цель и задачи исследования Основная цель работы состояла в разработке комплекса иммунохимкческих подходов для исследования ГР в биі логических жидкостях и тканях человека и изучении с их помощью полиморфизма иммунореактивного гормона при эндокринной патологии."
В соответствии с целью исследования решались следующие задачи:
:. Получить ключевые реагенты для иммунохимических систем анализа гормона роста в биологических жидкостях и тканях человека, в том числе моноклональные антитела.
-
Разработать на основе моноклональных антител к ГР иммуносор-бент с целыз оптимизации методов выделения и детекции ГР и его изо-форм в биологических жидкостях и тканях человека.
-
Разработать специфические высокочувствительные системы иммуноблоттинга на основе моно- и поликлональных антител к ГР для детекции ГР и его природных изоформ.
-
С помощью иммуносорбции на МКА и систем иммуноблоттинга исследовать молекулярные формы ГР в биологических жидкостях и тканях че ловека.в том числе у отдельных больных с эндокринной патологией.
Научная новизна исследования В настоящей работе разработан комплекс иммунохимических реагентов, подходов и методов-, позволяющих изучать ГР и его молекулярные формы в биологических жидкостях и тканях человека. Иммуносорбент на основе МКА к ГР впервые был применен для концентрирования ГР из крови и мочи человека - биологических жидкостей с крайне низким содержанием ГР. и. дальнейшего изучения этого гормона. Научная новизна настоящего исследования заключается также в последовательном использовании иммунохимических систем н-. основе моно- и поликлональных антител для изучения природной гетерогенности ГР человека. Такая комбинация методов -позволила охарактеризовать спектр иммунореактиЕНых молекулярных форм ГР в сыворотке кро-
ви и моче больных с акромегалией и обнаружить помимо основной молекулярной формы ГР крупные иммунореактлвные фрагменты гормона, не описанные другими исследователями. Использование системы иммуноблот-тинга на основе поликлональных антител к ГР позволило впервые описать молекулярные формы ГР, секретируемне культурами клеток соматот-ропином человека..
Теоретическая и практическая значимость работы Результаты настоящих исследований представляют теоретический и практический интерес как для специалистов-биохимиков, занимающихся изучением свойств. физиологической функций и полиморфизма ГР, так и для эндокринологов-клиницистов, занимающихся изучением соматотропной функции при различных формах патологии. Они расширяют современные представления о природной молекулярной гетерогенности ГР, в том числе при эндокринных заболеваниях.
В результате проведенной работы получен штамм гибридных культивируемых клеток - продуцент моноклональиых антител к соматотропину человека,, который зарегистрирован и депонирован во Всероссийскую коллекцию клеточных культур при Институте цитологии РАН под регистрационным номером ВСКК(П) 399Д. По результатам работы по получению данного штамма подана заявка на изобретение N 4835631/13 (050607), по которой получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Получение моноклинальных антител создает основу для создания современных диагностикумов для клинической эндокринологии.
На основе мм, высокоспешфичшх по отношению к ГР человека, создан иммуносорбент. с высокой связывающей способностью, который может применяться для выделения и изучения ГР и его иммунореактивных форм из биологических жидкостей и тканей человека. Использование полученного иммуносорбента позволяет быстро и эффективно выделять из экстрактов гипофиза человека имму:ологически и биологически активный ГР.
Разработанные системы иммуноблоттинга на основе моно- и полик-локал~ных антител к ГР создают методическую основу для изучения "ри-родного полиморфизма ГР человека и его значения в патогенезе и диагностике эндокринных нарушений.
Обнаружение в моче в качестве основной иммунореахтизной Форш интактного ГР с молекулярной массой 22 К указывает на возможность интегральной характеристики соматотропной функции гипофиза по экскреции гормона с мочой.
Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуадены на
- 4 -III Всесоюзном сьеэде-'эндокринологов /Ташкент. 1989г./. на XVII Научной конференций молодых ученых и специалистов Харьковского НИИ эндокринологии и химии гормонов и на межлабораторной конференции Института экспериментальной эндокринологии ВЭНЦ Российской АМН.
Публикации По материалам диссертации опубликованы 4 работы, получено положительное решение по заявке на авторское свидетельство.
Объем и структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы /134 ссылки/. Работа изложена на ЮЗ страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками и 3 таблицами.
